專利名稱：大黃酸或大黃酸類化合物在制備治療以fto 為靶點的疾病的藥物中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及藥物學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及大黃酸或大黃酸類化合物在制備治療以FTO為靶點的疾病的藥物中的用途。
背景技術(shù)：
肥胖相關(guān)的FT0(Fat mass and obesity-associated)基因定位于人類16號染色體，其蛋白產(chǎn)物在人體內(nèi)廣泛表達(dá)。FTO基因變異和肥胖癥表現(xiàn)出較大的關(guān)聯(lián)性，因此該基因又被人們稱為“肥胖基因” (Frayling TM, et al.，Science, 2007316(5826) :889-94; Gerken T，et al.，Science, 2007，318，(5855) : 469-72)。FTO 和阿爾法-酮戊二酸依賴的核酸氧化去甲基化酶AlkB家族蛋白具有較高的序列同源性。FTO能催化單鏈脫氧核糖核酸(DNA)中N-3位甲基化胸腺嘧啶(3meT)和核糖核酸(RNA)中N-3位甲基化尿嘧啶(3meU)氧化去甲基化。最近研究顯示，在體外實驗中，單鏈DNA和RNA中N-6位甲基化腺嘌呤(6meA)是FTO 的一個主要作用底物(Jia G，et al.，Nat. Chem. Biol.，20117 (12) : 885-7)，在體內(nèi)，含有(6meA)的信使RNA是FTO的作用底物。至今人們對FTO的功能與疾病的關(guān)系還不清楚。已有研究表明，F(xiàn)TO會對人類攝食產(chǎn)生直接影響，還可能與阿爾茨海默癥、代謝綜合征等有關(guān)(Speakman JR, et al. , Obesity2008 16(8):1961-5;Keller L, et al. , J Alzheimers Dis.2011 23(3):461-9;FreathyRM, et al. ,Diabetes 200857 (5) : 1419)。FTO與人類健康關(guān)系密切，因而FTO的功能與調(diào)控也一直是國內(nèi)外研究的熱點。然而，目前未見有關(guān)于FTO抑制劑的報道。FTO抑制劑的發(fā)現(xiàn)將對FTO功能的研究以及針對FTO靶點的新藥研發(fā)產(chǎn)生重大影響。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題設(shè)計并驗證針對FTO的小分子化合物抑制劑，其具有抑制FTO去除N_6位甲基化腺嘌呤(6meA)中的甲基化的生物活性。技術(shù)方案為了加速設(shè)計篩選FTO抑制劑，發(fā)明人首先運用高通量虛擬篩選(In silico HTS)技術(shù)，即通過分析蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)，借助計算機(jī)程序和分析軟件，過濾掉化合物庫中大部分不滿足要求的化合物，從28萬個化合物中篩選得到了 141個候選化合物。通過體外FTO生物活性驗證實驗得到具有抑制活性的小分子化合物。為了排除化合物由于破壞蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)而表現(xiàn)抑制活性，發(fā)明人運用了圓二色譜(CD)技術(shù)。遠(yuǎn)紫外CD是研究蛋白質(zhì)在溶液中二級結(jié)構(gòu)的主要手段之一。阿爾法-螺旋結(jié)構(gòu)在222納米和208納米處表現(xiàn)出兩個負(fù)的特征肩峰譜帶，可以利用這兩處的摩爾橢圓度
208或
222來估計蛋白質(zhì)中阿爾法-螺旋的含量，判斷二級結(jié)構(gòu)是否發(fā)生了劇烈變化。為了研究活性化合物是否能與FTO蛋白質(zhì)結(jié)合，發(fā)明人通過差異掃描熒光(DSF)實驗進(jìn)行了驗證。蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性與去折疊過程中的吉布斯自由能變化(AGu)具有一定的相關(guān)性，而且是溫度依賴的。大部分蛋白的穩(wěn)定性隨溫度而變化，溫度升高時，AGu降低，在折疊與去折疊的蛋白達(dá)到平衡時，A Gu=O，此時的溫度被定義為蛋白質(zhì)的融解溫度(Tm)。如果蛋白質(zhì)的去折疊以可逆的雙態(tài)方式進(jìn)行，那么平衡態(tài)熱動力學(xué)模型將適用于這一過程。如果化合物能夠與蛋白質(zhì)結(jié)合，化合物結(jié)合的自由能變化多數(shù)情況下會導(dǎo)致A Gu增加，相應(yīng)的Tm值升高。突光染料Sypro Orange的突光信號在水環(huán)境中被萃滅,隨著溫度的升高，蛋白質(zhì)去折疊暴露出疏水區(qū)，Sypro Orange結(jié)合至蛋白質(zhì)疏水區(qū),發(fā)射突光。突光值對溫度做曲線，蛋白質(zhì)去折疊的過渡態(tài)位置的溫度定義為Tm。研究表明，化合物結(jié)合引起的蛋白穩(wěn)定性提高與化合物的濃度以及親和性成正比。
接著，發(fā)明人通過生物分子相互作用分析(BIA)技術(shù)評價了化合物與FTO結(jié)合的特異性及強(qiáng)度。BIA是基于表面等離子共振(SPR)這一物理光學(xué)現(xiàn)象的生物傳感分析技術(shù)。當(dāng)入射光以臨界角入射到兩種不同透明介質(zhì)的界面時將產(chǎn)生全反射，且反射光強(qiáng)度在各個角度上都應(yīng)相同，但若在介質(zhì)表面鍍上一層金屬薄膜后，由于入射光可以引起金屬中自由電子的共振，從而導(dǎo)致反射光在一定的角度內(nèi)大大減弱，其中使反射光完全消失的角度稱為共振角。共振角會隨金屬薄膜表面通過的液相的折射率的改變而改變,折射率的變化又和結(jié)合在金屬表面的大分子質(zhì)量成正比。BIA就是利用金屬薄膜表面的折射率的改變，弓丨起共振角的變化，來推斷金屬薄膜表面的變化。實驗時先將一種生物分子固定在傳感器芯片表面，將與之相互作用的分子溶于溶液流過芯片表面。由于不必使用熒光標(biāo)記和同位素標(biāo)記，從而保持了生物分子的天然活性。檢測器能跟蹤檢測溶液中的分子(如化合物)與芯片表面分子(如蛋白質(zhì))的結(jié)合、解離整個過程的變化。通過它能觀察兩種分子結(jié)合的特異性，能知道兩種分子的結(jié)合有多強(qiáng)。為了進(jìn)一步研究化合物與FTO的作用方式，發(fā)明人運用了等溫滴定量熱(ITC)技術(shù)。ITC技術(shù)是近年來發(fā)展起來的一種研究生物熱力學(xué)與動力學(xué)的重要方法，它通過高靈敏度、高自動化的微量量熱儀連續(xù)、準(zhǔn)確地監(jiān)測和記錄一個變化過程的量熱曲線，原位、在線和無損傷地同時提供熱力學(xué)和動力學(xué)信息。在單次實驗中即可提供一整套有關(guān)分子相互作用的完整信息。ITC是表征生物分子相互作用的經(jīng)典方法之一，被廣泛應(yīng)用于研究小分子化合物與生物大分子(蛋白質(zhì)、核酸等)的相互作用。為了闡明化合物表現(xiàn)抑制活性的方式，發(fā)明人運用了熒光偏振(FP)技術(shù)。FP的基本原理是熒光物質(zhì)經(jīng)單一平面的偏振光照射后，吸收光能躍入激發(fā)態(tài)，隨后回復(fù)至基態(tài)，并發(fā)出單一平面的偏振熒光。偏振熒光的強(qiáng)弱程度與熒光分子的大小呈正相關(guān)，與其受激發(fā)時轉(zhuǎn)動的速度呈反相關(guān)。用熒光標(biāo)記FTO底物DNA，當(dāng)DNA與蛋白結(jié)合后，有效熒光分子變大，偏振熒光增強(qiáng)。若化合物能夠影響DNA與FTO的相互作用，熒光強(qiáng)度會相應(yīng)發(fā)生變化。發(fā)明人基于FTO晶體結(jié)構(gòu)開展小分子抑制劑的虛擬篩選和作用方式研究，首次發(fā)現(xiàn)了大黃酸或大黃酸類化合物能夠抑制FTO活性，該類化合物的結(jié)構(gòu)如以下通式I所示
權(quán)利要求
1.如下通式I所示大黃酸或大黃酸類化合物在制備治療以FTO為靶點的疾病的藥物中的用途
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的用途，其中，在通式I所示的化合物中，R1 R8為選自下表中的取代基
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用途，其中，所述通式I化合物為大黃酸或其鈉鹽或鉀鹽。
全文摘要
本發(fā)明涉及如下通式I所示的大黃酸或大黃酸類化合物在制備治療以FTO為靶點的疾病的藥物中的用途，實驗結(jié)果表明，通式I所示的化合物能夠特異性地與FTO結(jié)合，通過競爭底物結(jié)合位點表現(xiàn)抑制活性。細(xì)胞內(nèi)試驗也表明通式I化合物可以明顯升高體內(nèi)信使RNA中N-6位甲基化腺嘌呤(6meA)的水平。
文檔編號A61P25/28GK102697762SQ201210197108
公開日2012年10月3日 申請日期2012年6月14日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月14日
發(fā)明者俞璐, 葉飛, 楊財廣, 羅成, 蔣華良, 陳報恩 申請人:中國科學(xué)院上海藥物研究所