專利名稱：九節(jié)龍?jiān)碥沼糜谥苽渲委熑四X膠質(zhì)瘤藥物的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種已知的藥物新用途，特別是九節(jié)龍?jiān)碥沼糜谥苽渲委熑四X膠質(zhì)瘤藥物的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
川產(chǎn)九節(jié)龍(ardiseapusilla, A *DC)系紫金?？谱辖鹋僦参锏娜?九節(jié)龍阜苷(ardipusilloside,A *DS)是從該全草中分離 出的單體,分子式為C53H86O22 *2H20,分子量為1074[1]，經(jīng)初步藥理試驗(yàn)研究表明A DS具有提高免疫功能的作用并抑制腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移，申請(qǐng)人從上世紀(jì)九十年代開(kāi)始對(duì)川產(chǎn)九節(jié)龍進(jìn)行研究，并以川產(chǎn)九節(jié)龍為原料，經(jīng)醇提、減壓濃縮，萃取、低壓層析，洗脫等一系列提取方法，得到九節(jié)龍?jiān)磉?，?jīng)實(shí)驗(yàn)證明，九節(jié)龍?jiān)磉皩?duì)腫瘤細(xì)胞的基因復(fù)制有抑制作用，而口腹給藥L D 5(|約為最小有效量的12倍，能夠作為制備抗腫瘤藥物，并獲得中國(guó)專利(專利號(hào)ZL99115731. I)。以下是申請(qǐng)人檢索的參考文獻(xiàn)[I]Zhang Q H,WangXJ,Miao Z C,et al. Studies on the saponin constituentsof jiujie long[J], ActaPhamaceuticaSinica,1993,28 :673。[2]陶小軍，龍靜文，賀建宇，等ADS — I的抗腫瘤作用和免疫調(diào)節(jié)作用[J]，中國(guó)藥理學(xué)報(bào)，2005，21 :1070。[3]梁克明，王四旺，王曉娟，ADS對(duì)Hale細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用[J]，第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，24 :725。[4]陶小軍，王佩賢，楊孝江等，ADSI對(duì)小鼠Lewis肺癌和裸鼠肝癌SMMC — 7721的抑制作用[幻，中藥材，2005，28:574。[5]ffoo D H, Han IS, Jung G. Mefenamic acid-induced apoptosis in humanliver cancer cell-lines through caspase-3 pathway[J], Life Sci, 2004, 75 :2439。[6]Liang XH, Jackson S, Seaman M, et al. Induction of autophagy andinhibition of tumorigenesis by beclin I. Nature, 1999,402 :672_676。[7]Kihara A, Kabeya Y, Ohsumi Y, et al.Beclin-phosphatidylinositol3-kinase complex functions at the trails-GOlgi network. EMBO Rep,2001,2:330-335。[8]Kabeya Y, Mizushima N, Ueno T, et al. LC3, a mammalian homologue ofyeast Apg8p, is localized in autophagosome membranes after processing. EMBOJ,2000，19 :5720-5728。[9]梁克明，王四旺，ADS對(duì)8株細(xì)胞的抑制作用[J]，第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，22 671。

發(fā)明內(nèi)容
近年來(lái)，申請(qǐng)人在對(duì)九節(jié)龍?jiān)磉暗倪M(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，其抗癌機(jī)制可能與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)[2、3]，經(jīng)申請(qǐng)人研究證明，九節(jié)龍?jiān)碥湛梢种迫四X膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87MG、U251MG、U373MG、SHG-44MG生長(zhǎng)并導(dǎo)致其發(fā)生凋亡、自噬性細(xì)胞死亡，并探討了細(xì)胞發(fā)生凋亡、自噬性細(xì)胞死亡與時(shí)間及劑量的關(guān)系，為人腦膠質(zhì)瘤的診治提供現(xiàn)實(shí)依據(jù)。


圖I (a)、(b)、(c)、(d)分別是不同濃度 A DS 作用于 U87MG、U251MG、U373MG、SHG-44MG細(xì)胞(24、48、72h)后對(duì)存活的影響；其中，(a)是A DS作用于U251MG細(xì)胞，(b)是A DS作用于U87MG細(xì)胞，(c)是是A DS作用于U373MG細(xì)胞，(d)是A DS作用于SHG-44MG 細(xì)胞。圖2是ADS隨濃度變化對(duì)U87MG、U251MG、U373MG、SHG-44MG細(xì)胞凋亡的影響；其中圖(a)、(b)、(c)分別是U251MG 細(xì)胞 n=3，P〈0. 01 (Bars土SE)的 Cntrol (0. 87±0. 05),4. 4mg/L (23. 30±0. 34),8. 8mg/L (62. 77±0. 38)；圖(d)、(e)、(f)分別是U373MG 細(xì)胞的 n=3，P〈0. 01 (Bars土SE)，Control(1.4±0. 14)、3.8mg/L (37. 8± I. 87)、7. 6mg/L (81.6±2.47);(g)、(h)、(i)分別是 U87MG 細(xì)胞 n=3，P〈0. 01 (Bars土SE)的 Control (0. 4±0. 32)、
3.9mg/L (25. 12±0. 14),7. 7mg/L (51. 64±0. 45)；(j)、(k)、(I)分別是 SHG-44MG 細(xì)胞的 n=3，P〈0. 01 (Bars土SE)的 Control(3. 0±0. 54)、4. Omg/L (21. 9± I. 37)、8. Omg/L (59.1±2.56);圖3是ADS隨濃度變化對(duì)U87MG、U251MG、U373MG、SHG-44MG細(xì)胞凋亡的影響；其中圖(a)、(b)、(c)分別是U251MG 細(xì)胞的 n=8,P〈0. 01 (Bars土SE)的 Control>4. 4mg/L (31. 66%±4. 4%),8. 8mg/L (62. 69%±3. 5%)；圖(d)、(e)、(f)分別是U373MG 細(xì)胞的 n=8，P〈0. 01 (Bars土SE)的 Control,3. 8mg/L (21. 69%±3. 9%), 7. 6mg/L (59. 75%±4. 1%)；圖(g)、(h)、(i)分別是U87MG 細(xì)胞的 n=8,P〈0. 01 (Bars土SE)的 Control>3. 9mg/L (31. 32%±1. 8%), 7. 7mg/L (68. 57%±4. 7%)；圖(j)、(k)、(l)分別是SHG-44MG 細(xì)胞的 n=8，P〈0. 01 (Bars土SE)的 Control、
4.Omg/L (33. 48%±2. 7%),8. Omg/L (67. 12%±3. 2%)；圖4是Caspase3、Beclin-1、LC-3的免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果；其中圖(a)、(b)、(c)分別是 U251MG-Bclin_l 的 n=3, P<0. 01 (Bars土SE)的 Control(0. 1134%±0. 085%),4. 4mg/L (0. 1878%±0. 067%),8. 8mg/L (0. 2019%±0. 098%)；圖(d)、(e)、(f)分別是 U373MG_Bcl in_l 的 n=8，P〈0. 01 (Bars土SE)的 Control(0. 1563%±0. 0153. 8mg/L)、4. 4mg/L (0. 1764±0. 0137. 6mg/L) 0. 1878%±0. 067%),8. 8mg/L (0. 2214±0. 066)；圖(j)、(k)、(l)分別是 U87MG_Bclin-1 的 n=8，P〈0. 01 (Bars土SE)的 Control(0. 1413±0. 0224. Omg/L),4. 4mg/L (0. 1918±0. 0938. Omg/L) 0. 1878%±0. 067%),8. 8mg/L(0. 2645±0. 099)；圖(m)、(n)、(o)分別是 SHG-44MG-Bclin_l 白勺 n=8,P〈0. 01 (Bars土SE)的 Control(0. 1733±0. 0144. Omg/L),4. 4mg/L(0. 2561 ±0. 0718. Omg/L),8. 8mg/L(0. 3014±0. 186mg/L)。圖5 是 Caspase-3、憐酸化 Caspase-3、Beclin-1> LC-3 的 Western-blot 結(jié)果；其中圖(a)、(b)是對(duì) U251MG 細(xì)胞的 Control,4. 4ml/L、8. 8ml/L、12、2ml/L 的結(jié)果；圖(c)、(d)是對(duì)U373MG 細(xì)胞的 Control,3. 9ml/L、7. 7ml/L、12、4ml/L 的結(jié)果；圖(e)、(f)是對(duì)U87MG 細(xì)胞的 Control,3. 9ml/L、7. 7ml/L、12、4ml/L 的結(jié)果；圖(g)、(h)是對(duì) SHG-44MG 細(xì)胞的 Control、4. 0ml/L、8. 0ml/L、12、5ml/L 的結(jié)果.以下結(jié)合附圖和具體實(shí)驗(yàn)對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。
具體實(shí)施例方式本實(shí)施例主要目的是探討九節(jié)龍?jiān)碥諏?duì)人腦膠質(zhì)瘤U87MG、U251MG、U373MG、SHG-44MG、細(xì)胞系潛在的治療作用及其機(jī)制。采用的方法是用四基偶唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)2、
4、8、16、32、64、100mg/L 九節(jié)龍?jiān)碥兆饔?24、48、72h 對(duì)人腦膠質(zhì)瘤 U87MG、U251MG、U373MG、SHG-44MG細(xì)胞活性的影響，流式細(xì)胞儀觀察細(xì)胞發(fā)生凋亡。Tunel染色觀察細(xì)胞發(fā)生死亡的形態(tài)學(xué)變化。免疫細(xì)胞化學(xué)定位、定性的檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白Beclin-1、LC-3和凋亡蛋白Caspase3 Pho_Caspase3的表達(dá)。Western blot定量分析自卩遼相關(guān)蛋白Beclin-1、LC_3和凋亡蛋白Caspase3Pho_Caspase3的表達(dá)。結(jié)果表明=Tunel染色、流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示，隨著九節(jié)龍?jiān)碥諠舛鹊脑龃蠛蜁r(shí)間延長(zhǎng)，U87MG、U251MG、U373MG、SHG-44MG細(xì)胞的凋亡率明顯上升，免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示，自曬相關(guān)蛋白Beclin-1、LC_3和凋亡蛋白Caspase3 Pho_Caspase3均在胞衆(zhòng)中有高表達(dá)表達(dá)，并隨劑量的增加表達(dá)增高。Western-blot結(jié)果提示九節(jié)龍?jiān)碥湛梢酝ㄟ^(guò)激活凋亡蛋白Caspase3、Pho_Caspase3發(fā)揮促凋亡作用，又能激活自卩遼蛋白Beclin-1、LC-3誘導(dǎo)其發(fā)生自噬性細(xì)胞死亡的作用。結(jié)論九節(jié)龍?jiān)碥彰黠@抑制U87MG、U251MG、U373MG、SHG-44MG細(xì)胞生長(zhǎng)活性呈時(shí)間-劑量依賴性，通過(guò)調(diào)控Beclin-I和LC-3誘導(dǎo)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞發(fā)生自噬性死亡，也能調(diào)控凋亡蛋白Caspase3、Pho_Caspase3發(fā)揮促凋亡作用，具有顯著的抗腫瘤作用，能夠作為制備治療人腦膠質(zhì)瘤藥物。以下是詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)過(guò)程I、材料和方法I. I 材料A *DS藥粉，第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院藥劑科所提供，批號(hào)101210，純度>99%，用二甲基亞砜(dimethyl sulphoxide. DMS0)溶解配成200mg/L忙存液，置_20°C條件下凍存。U87MG、U251MG、SHG-44MG細(xì)胞系由本研究所保存，U373MG購(gòu)自美國(guó)ATCC。改良Eagle 培養(yǎng)基(Dulbecco，S modified Eagle’ s medium, DMEM)和膜蛋白酶，胎牛血清購(gòu)自杭州四季青由北京鼎國(guó)生物技術(shù)公司提供。四甲基氮唑藍(lán)(methylthiazolylterrazaium,MTT),青霉素、鏈霉素、Hoechst33258突光試劑盒均為Sigma公司提供。BCA (bicinchoninic acid)蛋白定量試劑盒購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)公司；
兔抗Beclin-I抗體,抗LC-3單抗，山羊抗兔二抗購(gòu)自于美國(guó)Santa ctruz公司?？諝鈨艋_(tái)為蘇州凈化設(shè)備廠生產(chǎn)產(chǎn)品，酶聯(lián)儀和蛋白電泳設(shè)備裝置均為美國(guó)伯樂(lè)公司產(chǎn)品。I. 2細(xì)胞培養(yǎng)U87MG、U251MG、U373MG、SHG-44MG腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞在含10%胎牛血清、IOOml青霉素、100g/ml鏈霉素和0. 37% NaHC03、0. 42% Heppes的DMEM培養(yǎng)液中，置于37°C>5% CO2 孵箱中培養(yǎng)，0. 25%胰蛋白酶和 0. 02%的 EDTA(ethylenediamineetraaceticacid)消化傳代繼續(xù)培養(yǎng)。I. 3 四基偶唑藍(lán)法(MTT)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期 U87MG、U251MG、U373MG、SHG-44MG 細(xì)胞，消化，洗滌，重懸，稀釋成2X104ml的單細(xì)胞懸液，接種至96孔板內(nèi)，實(shí)驗(yàn)分24、48、72h組，每組將 A DS 分 8 個(gè)不同濃度梯度，分別以 2mg/L、4mg/L、8mg/L、16mg/L、32mg/L、64mg/L、100mg/L、200mg/L的處理組及濃度為200mg/LA -DS的等量DMSO的對(duì)照組，每個(gè)濃度設(shè)6個(gè)復(fù)孔并以空白孔調(diào)零，各組細(xì)胞培養(yǎng)24h后，將培養(yǎng)液換成不同濃度的A DS培養(yǎng)液，繼續(xù) 培養(yǎng) 6、12、24、72h。隨后每孔加人20ul 5g/L的MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4h，吸去上清，棄掉，每孔加入150ulDMS0，震蕩lOmin。酶標(biāo)分析儀檢測(cè)490nm波長(zhǎng)的光密度值。抑制率(％)= (A對(duì)照組一 A實(shí)驗(yàn)組)/A對(duì)照組X 100%。I. 4 流式細(xì)胞術(shù)(Flowing cell micmspectrofluorimetry, FCM)檢測(cè)凋亡細(xì)胞將U87MG、U251MG、U373MG、SHG-44MG細(xì)胞接種于5個(gè)IOOml培養(yǎng)瓶中，各組細(xì)胞培養(yǎng)24h后，其中一瓶為正常對(duì)照組，將培養(yǎng)液換成含的A -DS培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24h。消化細(xì)胞，加入含血清的完全培養(yǎng)基終止反應(yīng)。輕微吹打使細(xì)胞脫壁，500rpm離心5min收集細(xì)胞，吸棄上清，用PBS洗滌細(xì)胞2次。后續(xù)步驟按照Annexin V FITC試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，用流式細(xì)胞儀定量分析細(xì)胞凋亡水平。I. 5ffestern blot 分析 Beclin-l、LC-3、Caspase_3 及憐酸化 Caspase-3 的蛋白在腦膠質(zhì)瘤U87MG、U251MG、U373MG、SHG-44MG細(xì)胞中的表達(dá)將IX IO6個(gè)細(xì)胞接種于IOOmL培養(yǎng)瓶，細(xì)胞貼壁后換液加入稀釋后的A DS,繼續(xù)培養(yǎng)24h后，用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(0. OlM PBS)漂洗細(xì)胞，加入IOOul預(yù)冷的細(xì)胞裂解液(50mm/L 的 Tris-cl,200mmol/L Nacl,2mmol/L EDTA,I % (V/V)Tritonx-100,0. Olmm/LPMSF)于冰上孵育裂解各組細(xì)胞20min，以12000rpm / min、4°C離心15min抽提蛋白，用BCA試劑盒以570nm于酶聯(lián)儀上測(cè)定蛋白含量，制備10%的十二基甲酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulphate-Polyacrylamide gelelectrophoresis, SDS-PAGE)分離，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉封閉，分別加入兔抗人Caspase-3、磷酸化Caspase-3酶原多克隆抗體，抗Actin單抗,抗Beclin-1、LC-3單抗,然后加入與結(jié)合含有辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔lGg-HRP，暗室曝光并進(jìn)行掃描圖像分析儀計(jì)算蛋白條帶的表達(dá)。I. 6Tunel熒光檢測(cè)凋亡細(xì)胞取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期U87MG、U251MG、U373MG、SHG-44MG細(xì)胞，消化，洗滌，重懸，稀釋成2X 104ml的單細(xì)胞懸液，接種至6孔板內(nèi)，板內(nèi)放有經(jīng)濃硫酸處理，高溫消毒過(guò)的載波片。細(xì)胞帖壁后，將培養(yǎng)液吸出，以含A DS培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24h。然后用PBS清洗三次，加入10%甲醛固定30min，PBS清洗三次后按Tunel試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，用Tunel熒光檢測(cè)定量分析細(xì)胞凋亡水平。
I. 7免疫細(xì)胞化學(xué)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期U87MG、U251MG、U373MG、SHG-44MG細(xì)胞，消化，洗滌，重懸，稀釋成2 X 104ml的單細(xì)胞懸液，接種至6孔板內(nèi)，板內(nèi)放有經(jīng)濃硫酸處理，高溫消毒過(guò)的載波片。細(xì)胞帖壁后，將培養(yǎng)液吸出，以含A -DS培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24h。然后用PBS清洗三次，0. 3%的H202封閉20min，加入Triton-100 (0. 15%)破膜10min，PBS清洗三次，加入一抗4°C過(guò)夜，加入二抗，按DAB操作步驟過(guò)缸，樹(shù)膠封片后，定位，定量檢測(cè)蛋白表達(dá)情況；I. 8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所得數(shù)據(jù)用SPSS 10.0軟件計(jì)算均數(shù)及標(biāo)準(zhǔn)差，并進(jìn)行方差分析，組問(wèn)差異采用Dunnett-t檢驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均值土標(biāo)準(zhǔn)差(x土s)表示,用SPSS1. 0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行、Dummett-t 檢驗(yàn)分析(P〈0. 01)。2、結(jié)果2. IA DS 所導(dǎo)致 U87MG、U251MG、U373MG、SHG-44MG 細(xì)胞的細(xì)胞毒性效應(yīng) MIT 試驗(yàn)結(jié)果顯示不同濃度A D S作用不同時(shí)間后的U87MG、U251MG、U373MG、SHG-44MG細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，隨著A *DS作用濃度的增加，膠質(zhì)瘤細(xì)胞受抑制作用越明顯；隨著藥物濃度的增加，生長(zhǎng)曲線有下降趨勢(shì)。A DS 作用 24、48、72h 的 U87MG、U251MG、U373MG、SHG-44MG 腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(50% inhibiting concentration, IC50)見(jiàn)圖 I, (P〈0. 01)。2. 2FCM檢測(cè)細(xì)胞凋亡結(jié)果采用FCM定量分析正常對(duì)照組和A DS作用24h處理后U87MG、U251MG、U373MG、SHG-44MG細(xì)胞的凋亡水平。結(jié)果顯示，與正常U87MG、U251MG、U373MG、SHG-44MG細(xì)胞相比，A DS處理組隨濃度增加U87MG、U251MG、U373MG、SHG-44MG細(xì)胞凋亡明顯增加(圖2)。2. 3Tunel熒光檢測(cè)凋亡細(xì)胞經(jīng)A.DS 處理U87MG、U251MG、U373MG、SHG-44MG 細(xì)胞 24h 后 U87MG、U251MG、U373MG、SHG-44MG細(xì)胞的凋亡水平，數(shù)據(jù)采用image pro plus6. 0分析。結(jié)果顯示，與正常U87MG、U251MG、U373MG、SHG-44MG 細(xì)胞相比，A DS 處理組隨濃度增加 U87MG、U251MG、U373MG、SHG-44MG細(xì)胞凋亡明顯增加(圖3 )。2. 4ffestern blot經(jīng)A DS 處理 U87MG、U251MG、U373MG、SHG-44MG 細(xì)胞 24h 后，提取蛋白檢測(cè)A DS 對(duì) U87MG、U251MG、U373MG、SHG-44MG 腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞蛋白表達(dá)的影響，Western-blot結(jié)果經(jīng)(image J I. 44p)分析后，證實(shí)A. DS作用于U373MG、SHG-44MG、U251MG，凋亡蛋白Caspase3、Pho-Caspase3隨劑量增大而表達(dá)增高。自噬蛋白Beclin_l、LC3不隨藥物濃度增加而增加，在IC50時(shí)表達(dá)最高。而對(duì)于U87MG細(xì)胞系,凋亡蛋白Caspase3、Phos_Caspase3不隨藥物濃度增加而增加，在IC50時(shí)表達(dá)最高，自噬蛋白Beclin-I隨劑量增大而表達(dá)增高。LC3不隨藥物濃度增加而增加，在IC50時(shí)表達(dá)最高(見(jiàn)圖4)。3、討論紫金?？谱辖鹋僦参锓植加谖覈?guó)長(zhǎng)江流域，A DS系從九節(jié)龍植物中提取的有效單體，全草含量高達(dá)1%。研究表明A Ds具有清熱解毒，活血化瘀的功效，用于消炎、消腫和抗腫瘤的治療[4]。Caspase-3是目前發(fā)現(xiàn)caspase成員中激活細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵性激酶,也是細(xì)胞凋亡的主要參與成分[5]?，F(xiàn)今已經(jīng)證實(shí)Beclin-I是一種與自噬相關(guān)的基因[6]，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中還發(fā)現(xiàn)所有Beclin I與PI3K形成聯(lián)合體m，而誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生自性死亡。LC3是酵母菌自噬基因Atg8在哺乳動(dòng)物中的同源物，其定位于前自噬泡和自噬泡膜表面，參與自噬體的形成。其以I型和II型兩種不同相對(duì)分子質(zhì)量的形式存在。LC3-II位于胞內(nèi)自噬體膜上，被認(rèn)為是自噬體的標(biāo)志分子，LC3-II / LC3-I的比值與自噬強(qiáng)度成正比[8]。經(jīng)申請(qǐng)人研究發(fā)現(xiàn)，體外培養(yǎng)的人腦膠質(zhì)瘤U87MG、U251MG、U373MG、SHG-44MG細(xì)胞經(jīng)A *DS處理后，隨著藥物濃度的增加膠質(zhì)瘤細(xì)胞受抑制作用越明顯；隨著藥物作用時(shí)間的延長(zhǎng)，生長(zhǎng)曲線有下降趨勢(shì)，呈時(shí)間-劑量依賴性，說(shuō)明A *DS有很強(qiáng)的抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用；而采用FCM定量分析結(jié)果與正常U87MG、U251MG、U373MG、SHG-44MG細(xì)胞相比，A DS處理組隨時(shí)間延長(zhǎng)U87MG、U251MG、U373MG、SHG-44MG細(xì)胞凋亡和自噬明顯增加，這進(jìn)一步說(shuō)明A DS可能通過(guò)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡和自噬來(lái)抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)并抑制其活性；將申請(qǐng)人采用Western-blot法檢測(cè)(圖5)發(fā)現(xiàn)凋亡蛋白Caspase3、Pho_Caspase3隨劑量增大而表達(dá)增高。自噬蛋白Beclin-1、LC3不隨藥物濃度增加而增加，在IC50時(shí)表達(dá)最高。而對(duì)于U87MG細(xì)胞系，凋亡蛋白Caspase3、Phos-Caspase3不隨藥物濃度增加而增加，在IC50 時(shí)表達(dá)最高，自噬蛋白Beclin-I隨劑量增大而表達(dá)增高。LC3不隨藥物濃度增加而增加，在IC50時(shí)表達(dá)最高。A DS能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞大量凋亡，發(fā)揮其抗腫瘤的作用。近年來(lái)A DS的抗腫瘤效能日益受到重視。前期研究已證實(shí)ADS對(duì)體外培養(yǎng)的胸腺癌、肺癌、結(jié)腸癌、表皮樣癌和腎癌等細(xì)胞群都有一定的抑制或殺傷作用[9]。本研究證實(shí)A DS對(duì)人腦膠質(zhì)瘤U87MG、U251MG、U373MG、SHG-44MG細(xì)胞系，既可通過(guò)激活自噬蛋白Beclin-I和LC-3誘導(dǎo)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞發(fā)生自卩遼性死亡，也能激活凋亡蛋白Caspase3、Pho_Caspase3 發(fā)揮促凋亡作用。結(jié)果表明 A *DS 調(diào)控 caspase3、Pho-Caspase3、Beclin_l、LC-3蛋白是其促進(jìn)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡和發(fā)生自噬性細(xì)胞死亡的機(jī)制之一。同時(shí)，A DS是一個(gè)多途徑、多靶點(diǎn)的藥物，在治療人腦膠質(zhì)瘤中可能是一個(gè)新型的，非常具有潛力的新藥物。
權(quán)利要求
1.九節(jié)龍?jiān)碥沼糜谥苽渲委熑四X膠質(zhì)瘤藥物的應(yīng)用。
2.如權(quán)利要求I所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的人腦膠質(zhì)瘤是U87MG、U251MG、U373MG和SHG-44MG細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種已知的藥物九節(jié)龍?jiān)碥沼糜谥苽渲委熑四X膠質(zhì)瘤藥物的新用途，并探討了九節(jié)龍?jiān)碥諏?duì)人腦膠質(zhì)瘤U87MG、U251MG、U373MG、SHG-44MG、細(xì)胞系潛在的治療作用及其機(jī)制。證明了九節(jié)龍?jiān)碥漳軌蛎黠@抑制U87MG、U251MG、U373MG、SHG-44MG細(xì)胞生長(zhǎng)活性呈時(shí)間-劑量依賴性，通過(guò)調(diào)控Beclin-1和LC-3誘導(dǎo)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞發(fā)生自噬性死亡，也能調(diào)控凋亡蛋白Caspase3、Pho-Caspase3發(fā)揮促凋亡作用，具有顯著的抗腫瘤作用。
文檔編號(hào)A61P35/00GK102727510SQ201210199170
公開(kāi)日2012年10月17日 申請(qǐng)日期2012年6月15日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月15日
發(fā)明者校鑫, 王曉娟, 王榮 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)