專利名稱：：鼠傷寒沙門菌UF110lux及其在活體成像中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于微生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別涉及鼠傷寒沙門菌UFllOlux及其在活體成像中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：鼠傷寒沙門菌{Salmonellatyphimurium)宿主范圍廣泛,感染發(fā)病率高,是目前食品安全、農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。沙門菌質(zhì)粒毒力基因5/^(Salmonellaplasmidvirulencegenes)是沙門菌毒力質(zhì)粒上的的高度保守序列。編碼的產(chǎn)物和細(xì)菌的毒力表型關(guān)系最為密切，能增加沙門菌在腸外組織細(xì)胞內(nèi)的增值，并與細(xì)菌血清抗性、粘附與定居有關(guān)；另外5/^基因還可影響細(xì)菌在胞內(nèi)存活和宿主細(xì)胞的自噬凋亡。UFllO是鼠傷寒沙門菌毒力質(zhì)粒上^敲除的菌株，可作為對(duì)照用于研究鼠傷寒沙門菌毒力基因SPV的功能。近年來(lái)，活體動(dòng)物體內(nèi)光學(xué)成像技術(shù)以其操作簡(jiǎn)便及直觀性在生命科學(xué)研究中得以不斷發(fā)展。這種成像技術(shù)可以直接實(shí)時(shí)觀察標(biāo)記的基因及細(xì)胞在活體動(dòng)物體內(nèi)的活動(dòng)及反應(yīng)。利用光學(xué)標(biāo)記的細(xì)菌建立動(dòng)物模型可以實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)追蹤病原菌在動(dòng)物活體內(nèi)的感染過(guò)程，深入研究病原菌致病機(jī)制，進(jìn)行藥物研究及篩選等。生物發(fā)光技術(shù)是目前活體成像研究的熱點(diǎn)，它是用熒光素酶(Iuciferase)基因標(biāo)記。以熒光素酶作為體內(nèi)報(bào)告源的生物發(fā)光是以酶和底物的特異作用而發(fā)光，特異性極強(qiáng)，因動(dòng)物本身沒有任何自發(fā)光，使得生物發(fā)光相較傳統(tǒng)的熒光技術(shù)具有極低的背景，極高的信噪比。細(xì)菌熒光素酶基因操縱子ZmCDABE由熒光素酶基因和其底物合成酶基因組成，其標(biāo)記的細(xì)菌會(huì)持續(xù)發(fā)光不需要外源性底物。近年來(lái)研究者們陸續(xù)將其克隆至多種載體導(dǎo)入病原菌中，應(yīng)用生物發(fā)光技術(shù)和小動(dòng)物成像系統(tǒng)監(jiān)測(cè)病原菌感染過(guò)程。但以質(zhì)粒為基礎(chǔ)的生物發(fā)光技術(shù)在無(wú)抗生素選擇下不穩(wěn)定，不能用于體內(nèi)的長(zhǎng)期研究。對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠注射抗生素來(lái)篩選攜帶完整發(fā)光質(zhì)粒的沙門菌，會(huì)造成小鼠的耐藥性，且會(huì)在某種程度上干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。又因質(zhì)粒的拷貝數(shù)不同，單細(xì)胞發(fā)光強(qiáng)度不穩(wěn)定，無(wú)法以發(fā)光強(qiáng)度來(lái)定量檢測(cè)病原菌。2010年，KevinHowe構(gòu)建質(zhì)粒pBEN276，利用該質(zhì)?？蓪ux操縱子克隆至細(xì)菌染色體(圖1)，其生物發(fā)光信號(hào)可以用于精確定量，本發(fā)明由此在鼠傷寒沙門菌UFllO基礎(chǔ)上構(gòu)建了具有穩(wěn)定生物發(fā)光性能的菌株UFllOlux，可作為對(duì)照在動(dòng)物活體內(nèi)實(shí)時(shí)觀察5/^基因?qū)?xì)菌致病過(guò)程的影響。
發(fā)明內(nèi)容解決的技術(shù)問題本發(fā)明針對(duì)熒光標(biāo)記的體內(nèi)檢測(cè)特異性低，背景高，難定量等缺陷，及以往以基于質(zhì)粒的生物發(fā)光檢測(cè)需外加篩選壓力和底物，且難以定量等不足，提供了一種可以穩(wěn)定發(fā)光的鼠傷寒沙門菌UFlIOlux及其在活體成像中的應(yīng)用。技術(shù)方案鼠傷寒沙門菌typhimurium)UFlIOlux,該菌株已在國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局指定的保藏單位保藏，保藏日期為2012年3月13日，保藏單位名稱中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)CGMCCNo.5893。鼠傷寒沙門菌typhimurium)UFlIOlux在活體成像中的應(yīng)用。鼠傷寒沙門菌(5^7^9/7(9773UFllO下文簡(jiǎn)稱UFllO;鼠傷寒沙門菌{Salmonellatyphimurium)UFIlOlux下文簡(jiǎn)稱UFIlOlux。有益效果該鼠傷寒沙門菌具有穩(wěn)定的生物發(fā)光性能，彌補(bǔ)了生物熒光的細(xì)菌檢測(cè)需激發(fā)光源且在體內(nèi)特異性低，背景高，難定量等缺陷。經(jīng)位點(diǎn)特異性重組，將管家基因E.coli/rr啟動(dòng)子和操縱子插入宿主菌染色體中穩(wěn)定表達(dá)(同時(shí)插入位點(diǎn)不破壞基因組基因功能，對(duì)細(xì)菌無(wú)不利影響)。操縱子在其上游連接的管家基因E.co7i/rr啟動(dòng)子的調(diào)控下，組成性表達(dá)熒光素酶和底物，無(wú)需外加篩選壓力和底物維持細(xì)菌發(fā)光。并通過(guò)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到細(xì)菌的數(shù)量與其發(fā)光強(qiáng)度成正比，且在小鼠活體內(nèi)能持續(xù)檢測(cè)到細(xì)菌的生物發(fā)光。彌補(bǔ)了以往質(zhì)粒標(biāo)記的生物發(fā)光細(xì)菌需外加篩選壓力和底物，影響發(fā)光檢測(cè)，且單位細(xì)胞發(fā)光量不穩(wěn)定等不足之處。熒光酶基因插入染色體中穩(wěn)定表達(dá)，單位細(xì)胞的發(fā)光數(shù)量很穩(wěn)定。加上生物發(fā)光技術(shù)極高的特異性和信噪比，即便標(biāo)記細(xì)胞在動(dòng)物體內(nèi)有復(fù)雜的定位，亦可從動(dòng)物體表的信號(hào)水平直接得出發(fā)光細(xì)胞的相對(duì)數(shù)量?？蓮V泛應(yīng)用于體外細(xì)胞感染模型和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的建立。結(jié)合利用活體成像儀器可實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)的持續(xù)監(jiān)測(cè)鼠傷寒沙門菌在小鼠活體內(nèi)的入侵、增殖及擴(kuò)散情況。為鼠傷寒沙門菌及傷寒沙門菌致病機(jī)制的深入研究，藥物研究和篩選及相關(guān)疾病防治策略的研究等提供便利的工具。圖I為PBEN276質(zhì)粒圖譜，tnsABCD為編碼Tn7轉(zhuǎn)座子的基因。操縱子IuxCDABE編碼熒光素酶和底物，引入多克隆酶切位點(diǎn)Xhol和Notl，將其連接于Tn7轉(zhuǎn)座子側(cè)翼。Lux操縱子3’端連接Ε.coli管家基因frr的啟動(dòng)子，啟動(dòng)Zm操縱子的組成性表達(dá)。圖2為菌落生物發(fā)光檢測(cè)結(jié)果(I和2依次為UFllOlux單菌落在whitelight和luminescence條件下成像，3和4依次為UFllO單菌落在whitelight和luminescence條件下成像)。圖3為菌液光子數(shù)與細(xì)菌數(shù)關(guān)系的檢測(cè)結(jié)果(I飛UFllOlux菌量倍增；6=UFllO陰性對(duì)照)。圖4為光子數(shù)與細(xì)菌數(shù)關(guān)系圖。圖5UF1101ux生物發(fā)光穩(wěn)定性檢測(cè)結(jié)果。圖6為穩(wěn)定發(fā)光菌在活體內(nèi)(麻醉后觀察小鼠)臟器的定位(1，2，3依次為將感染UFllOlux的小鼠解剖后，取其臟器于whitelight模式成像，luminescence模式成像和merge圖像)。具體實(shí)施例方式實(shí)施例I菌株具體構(gòu)建及鑒定I、材料準(zhǔn)備I.I質(zhì)粒與菌株質(zhì)粒PBEN276由法國(guó)自然資源研究所動(dòng)物傳染病和公共健康病原菌研究實(shí)驗(yàn)室PierreGermon教授惠贈(zèng)。KevinHowe,AttilaKarsi,PierreGermon,et.al.DevelopmentofstablereportersystemcloningluxCDABEgenesintochromosomeofSalmonellaentericaserotypesusingTn7transposon[J].BMCMicrobiology2010,10:197鼠傷寒沙門菌{Salmonellatyphimurium)UFllOlux由美國(guó)亞利桑那州立大學(xué)生物科學(xué)學(xué)院ROYCURTISSIII教授惠贈(zèng)。HIDEN0RIMATSUI,CHRISTOPHERM.BACOT,WENDYA.VirulencePlasmid-Bornespv^andspvCGenesCanReplacethe90-KilobasePlasmidinConferringVirulencetoSalmonellaentericaSerovarTyphimuriuminSubcutaneouslyInoculatedMice[J].Journalofbacteriology,2001，15(183):4652-4658.1.2儀器與試劑儀器電轉(zhuǎn)儀(Bio-RadGenePulserIIsystem)為美國(guó)Bio-Rad產(chǎn)品；高速冷凍離心機(jī)Beckaman公司產(chǎn)品；柯達(dá)多模式小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)DXS4000pro；試劑質(zhì)粒提取試劑盒QIAGENPlasmidMaxKit購(gòu)自Qiagen公司。2方法2.1目的菌株的轉(zhuǎn)化2.I.I感受態(tài)細(xì)胞制備平板劃線法接種鼠傷寒沙門菌UFllO至LB固體培養(yǎng)基，37°C倒置培養(yǎng)過(guò)夜。挑取個(gè)體圓潤(rùn)有光澤的單菌落接種到3mLLB液體培養(yǎng)基，37°C，200r/min培養(yǎng)過(guò)夜。將培養(yǎng)物以1:100的體積比例接種到IOOmL生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，37°C，250r/min培養(yǎng)至0D600為O.3時(shí)取出培養(yǎng)物，立即冰浴30min。4°C,4000r/min離心lOmin，收集菌體。用4°C預(yù)冷的超純水洗三遍，以50μL預(yù)冷的超純水重懸，冰上放置待用。2.I.2電轉(zhuǎn)化方案將質(zhì)粒ΡΒΕΝ276加入到50μL感受態(tài)細(xì)胞中，混合均勻后轉(zhuǎn)入預(yù)冷的Imm電極杯。再調(diào)節(jié)電壓、電阻及電容參數(shù)為2.5kV，400Ω，50μF，電擊后迅速加入30°C預(yù)熱的SOC培養(yǎng)基lmL。將電擊后的菌液轉(zhuǎn)移至試管，37°C，100r/min培養(yǎng)f3h。取100μL涂布于含40μg/mL氨芐青霉素的LB平板上，37°C培養(yǎng)過(guò)夜。2.2轉(zhuǎn)化子鑒定陽(yáng)性克隆從含50μg/mLAmp的LB瓊脂平板上挑出接種至2mL含50μg/mLAmp的液體LB培養(yǎng)基30°C，200rpm培養(yǎng)1416h，將菌液轉(zhuǎn)移至24孔板檢測(cè)生物發(fā)光。同時(shí)提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定和PCR鑒定，并接種于SS固體培養(yǎng)基進(jìn)行鼠傷寒沙門菌生化鑒定。2.3誘導(dǎo)轉(zhuǎn)座子重組將上述經(jīng)鑒定的轉(zhuǎn)化子接種至含0.l%wt阿拉伯糖的LB液體培養(yǎng)基30°C，200rpm培養(yǎng)1416h。誘導(dǎo)后的菌液于無(wú)抗生素LB固體培養(yǎng)基平板上劃線，42°C培養(yǎng)1416h。各挑選6個(gè)單克隆接種于液體LB培養(yǎng)基42°C，200rpm培養(yǎng)1416h，菌液轉(zhuǎn)移至24孔板檢測(cè)生物發(fā)光。2.4篩選穩(wěn)定表達(dá)Lux操縱子的克隆挑選出重組后能發(fā)光的菌液于含50μg/mLAmp固體LB培養(yǎng)基上劃線，同時(shí)在無(wú)抗生素培養(yǎng)基中繼續(xù)傳代37°C培養(yǎng)，定量檢測(cè)細(xì)菌發(fā)光情況。篩選出無(wú)抗生素抗性且多次傳代能穩(wěn)定發(fā)光的菌落。菌株的培養(yǎng)增殖方法UFllOlux為兼性厭氧菌，在普通LB培養(yǎng)基中可生長(zhǎng)，培養(yǎng)基成分蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g，溶于IL水，pH=7±0.2，培養(yǎng)溫度37°C下可穩(wěn)定增殖。新菌種UFllOlux區(qū)別于UFllO的是具有穩(wěn)定的生物發(fā)光性能。Lux操縱子的位點(diǎn)特異性插入染色體，對(duì)細(xì)菌的其他生理特性無(wú)影響。菌種形態(tài)與生化特性檢測(cè)液體LB培養(yǎng)基37°C培養(yǎng)過(guò)夜細(xì)菌均勻渾濁。取一環(huán)菌液適當(dāng)稀釋后革蘭染色鏡檢，該菌為革蘭陰性桿菌。用固體LB培養(yǎng)基37°C培養(yǎng)18h，形成乳白色菌落，表面光滑，邊緣整齊，直徑f3mm。SS培養(yǎng)基37°C培養(yǎng)1824h上菌落形態(tài)為中等大小、圓形、光滑、乳白色、菌落中心黑色，硫化氫陽(yáng)性。挑取單菌落接種于生化管檢測(cè)生化特性，該菌不發(fā)酵乳糖和蔗糖，能發(fā)酵葡萄糖、甘露醇、麥芽糖。挑取單菌落接種于半固體瓊脂，37°C培養(yǎng)1824h，細(xì)菌呈羽毛狀生長(zhǎng)，動(dòng)力陽(yáng)性。菌落生物發(fā)光檢測(cè)分區(qū)劃線法將UFllOlux接種于LB平板，37°C，培養(yǎng)1416h。待長(zhǎng)出單菌落后，將平板置于多模式活體成像儀中進(jìn)行生物發(fā)光檢測(cè)。在生物發(fā)光檢測(cè)模式下，可見發(fā)光菌單菌落，而普通細(xì)菌單菌落不可見(圖2)。菌液生物發(fā)光檢測(cè)光子數(shù)與細(xì)菌數(shù)的關(guān)系UFlIOlux單菌落接種至液體LB培養(yǎng)基37°C，200rpm培養(yǎng)1416h，菌液轉(zhuǎn)移至24孔板，倍比稀釋菌液，檢測(cè)生物發(fā)光。光子量與細(xì)菌量成線性關(guān)系(圖3，4)。生物發(fā)光穩(wěn)定性檢測(cè)將UFllOlux單菌落接種至無(wú)抗生素液體LB培養(yǎng)基，每天傳代培養(yǎng)至12天，每3天收集菌液，以0D600為標(biāo)準(zhǔn)稀釋至相同體積相同濃度，在活體成像儀中進(jìn)行生物發(fā)光檢測(cè)，記錄發(fā)光強(qiáng)度。UFllOlux具有穩(wěn)定的生物發(fā)光性能(如圖5)。實(shí)施例2鼠傷寒沙門菌{Salmonellatyphimurium)UFllOlux在活體成像中的應(yīng)用I.細(xì)菌培養(yǎng)從固體LB瓊脂平板上挑選單克隆接種至LB液體培養(yǎng)基中，37°C，200rpm培養(yǎng)1416h至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。4000rpm，4°C，IOmin離心收集菌體，經(jīng)生理鹽水洗兩遍(4000rpm，4°C，IOmin)后，用生理鹽水重懸，測(cè)0D600計(jì)算細(xì)菌濃度。用生理鹽水梯度稀釋待用。2.小鼠感染方法(腹腔注射或口飼感染)2.I腹腔注射感染選取8-12周BALB/C或C57BL小鼠，以50μL濃度105CFU/mL的菌液腹腔注射感染小鼠。2.2.口飼感染8-12周BALB/C或C57BL小鼠禁食禁水6h后，以50μL10%wt的NaHCO3灌胃，中和胃酸，以體積O.2mL濃度107CFU/mL的菌液灌胃感染小鼠，半小時(shí)后恢復(fù)喂食。3.活體成像方法以10%wt水合氯醛O.ImL經(jīng)腹腔注射麻醉小鼠，待麻醉生效(約30min)后利用小動(dòng)物成像儀成像。首先在白光(whitelight)條件下成像，只可見小鼠。然后在生物發(fā)光(luminescence)條件下成像,只可見發(fā)光菌。將兩次成像結(jié)果歸并(merge),可見發(fā)光菌感染后播散到的部位，解剖后可具體分析細(xì)菌在深層臟器的定位(圖6);經(jīng)光子量分析可計(jì)算發(fā)光菌在體內(nèi)的增殖情況。權(quán)利要求1.鼠傷寒沙門菌{Salmonellatyphimurium)UFllOlux，該菌株已在國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局指定的保藏單位保藏，保藏日期為2012年3月13日，保藏單位名稱中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)CGMCCNo.5893。2.鼠傷寒沙門菌typhimurium)UFllOlux在活體成像中的應(yīng)用。全文摘要鼠傷寒沙門菌UF110lux及其在活體成像中的應(yīng)用，該菌株已在國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局指定的保藏單位保藏，保藏日期為2012年3月13日，保藏單位名稱中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)CGMCCNo.5893。鼠傷寒沙門菌UF110是將毒力質(zhì)粒上spv基因敲除的菌株，可作為對(duì)照用于研究鼠傷寒沙門菌毒力基因spv的功能。UF110lux是在其基礎(chǔ)上構(gòu)建的具有穩(wěn)定生物發(fā)光性能的菌株。彌補(bǔ)了傳統(tǒng)熒光標(biāo)記的不足，結(jié)合利用活體成像儀器可實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)地續(xù)監(jiān)測(cè)鼠傷寒沙門菌在小鼠活體內(nèi)的入侵、增殖及擴(kuò)散情況。為鼠傷寒沙門菌致病機(jī)制的深入研究提供便利的工具。文檔編號(hào)A61K49/00GK102757910SQ20121020619公開日2012年10月31日申請(qǐng)日期2012年6月21日優(yōu)先權(quán)日2012年6月21日發(fā)明者葉穎,吳淑燕,李嫄淵,黃瑞申請(qǐng)人:蘇州大學(xué)