專利名稱：葉酸偶聯(lián)殼聚糖川芎嗪納米粒制劑的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種MDR逆轉(zhuǎn)劑，尤其是一種可提高川芎嗪對腫瘤細胞的聚集濃度、降低對正常細胞分布的葉酸偶聯(lián)殼聚糖)I丨芎嗪納米粒制劑。
背景技術：
多藥耐藥(multidrug resistance,MDR)現(xiàn)象可嚴重妨礙腫瘤的化療效果。MDR由多種機制引發(fā)，最具代表性的是由于耐藥細胞表面P-gp、多藥耐藥相關蛋白等跨膜蛋白的高表達所形成的外排泵，使細胞內(nèi)化療藥物外排所造成的。MDR的產(chǎn)生不僅保護了腫瘤細胞，所排出的化療藥還增加了對正常組織的損傷。研究表明，具有鈣離子通道拮抗作用的部
分天然藥物成分如川芎嗪、丹參酮IIA、苦參堿、去甲斑蝥素等具有MDR逆轉(zhuǎn)作用，尤其川芎嗪逆轉(zhuǎn)MDR的作用非常突出。盡管川芎嗪能顯著增加化療藥物的敏感性，但目前卻難以廣泛應用于臨床，主要原因是缺少良好的給藥載體，致使川芎嗪在體內(nèi)廣泛分布，增加了對正常人體細胞的損傷，不良反應發(fā)生率較高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是為了解決現(xiàn)有技術所存在的上述技術問題，提供一種可提高川芎嗪對腫瘤細胞的聚集濃度、降低對正常細胞分布的葉酸偶聯(lián)殼聚糖川芎嗪納米粒制劑。本發(fā)明的技術解決方案是一種葉酸偶聯(lián)殼聚糖川芎嗪納米粒制劑，其特征在于依次按如下方法制備
a.將殼聚糖分子量降解至5萬道爾頓；
b.磁力攪拌條件下，將所得分子量為5萬道爾頓的殼聚糖與葉酸偶聯(lián)，得葉酸殼聚糖偶聯(lián)物；
c.在室溫下，將所得葉酸殼聚糖偶聯(lián)物溶于濃度為1%的醋酸溶液中，制得2mg/ml的葉酸殼聚糖醋酸溶液15ml,將18mg川彎嗪溶于葉酸殼聚糖醋酸溶液中，200 rpm/min磁力攪拌下，滴加5ml濃度為0. 6 mg/ml的多聚磷酸鈉水溶液,滴加完畢后，繼續(xù)磁力攪拌30min,即得葉酸偶聯(lián)殼聚糖川彎嗪納米粒的混懸液；
d.將所制備的混懸液4°C下32900 rpm/min離心30min,離心后棄上清,收集沉淀，分散在去離子水中，加凍干保護劑，_48°C預凍12h，冷凍干燥機中凍干，即得葉酸偶聯(lián)殼聚糖川芎嗪納米粒的粉末。所述a步驟是將殼聚糖加入到1%醋酸溶液中，攪拌使之溶解，制得200mg/100ml殼聚糖醋酸液，過濾除去不溶性雜質(zhì)，60°C磁力攪拌下加入過量的雙氧水至2小時，用NaOH調(diào)PH值至產(chǎn)生白色沉淀，過濾收集白色沉淀，用去離子水洗至中性，無水乙醇浸泡2h，抽濾沉淀并在常溫下干燥，即制得分子量為5萬道爾頓的殼聚糖。所述b步驟是稱取150mg葉酸，用DMSO溶解，再加入150mg脫水縮合劑，25°C避光攪拌I小時，即得紅棕色的葉酸活性酯的DMSO溶液；稱取IOOmg分子量為5萬的殼聚糖溶解于醋酸-醋酸鈉緩沖液(PH5)中，并在磁力攪拌條件下緩慢加入葉酸活性酯的DMSO溶液中，30°C下避光反應過夜，然后用NaOH調(diào)pH至橘紅色沉淀析出，上述葉酸與殼聚糖用量的摩爾比為170 1 ;將上一步的混合液及橘紅色沉淀一同裝入透析袋中，先于pH 7. 4的磷酸鹽緩沖液中透析3天，然后再于去離子水溶液中透析3天；將透析袋內(nèi)的混合液全部轉(zhuǎn)移至西林瓶中，_48°C預凍12h，冷凍干燥機中凍干，即得葉酸殼聚糖偶聯(lián)物。殼聚糖(CMC)具有生物可降解性、生物相容性、低毒性、良好的粘附性和成膜能力等特點；葉酸受體(FA)是一種糖蛋白受體，在正常組織中的表達高度保守，而在許多腫瘤細胞如Hela、MCF-7等呈過渡表達。本發(fā)明是將葉酸偶聯(lián)殼聚糖并以此作為載體包載川芎嗪，制成MDR逆轉(zhuǎn)劑，具有主動靶向性強等特點，可對靶組織(腫瘤細胞)高濃度聚集，減小對正常組織的毒副作用，延長藥物作用時間，減少給藥次數(shù)。


圖I :降解時間與殼聚糖分子量(n=3)的關系不意圖。圖2 :高、低分子量殼聚糖紅外掃描圖譜。 圖3 :葉酸殼聚糖、殼聚糖、葉酸紅外掃描圖譜。圖4 :葉酸殼聚糖1H-核磁共振掃描圖譜。圖5 :葉酸偶聯(lián)殼聚糖川彎嗪納米粒粒徑大小及分布示意圖。圖6 :葉酸偶聯(lián)殼聚糖川芎嗪納米粒透射電鏡圖。圖7 :川芎嗪溶液與葉酸偶聯(lián)殼聚糖川芎嗪納米粒體外釋放累積曲線。圖8 :激光共聚焦顯微鏡觀察細胞對樣品中川芎嗪的攝取圖。圖9 :本發(fā)明實施例納米粒的體外靶向作用示意圖。
具體實施例方式本發(fā)明實施例依次按a、b、C、d步驟制備
a.將殼聚糖分子量降解到5萬道爾頓，具體做法是將殼聚糖加入到1%醋酸溶液中，攪拌使之溶解，制得200mg/100ml殼聚糖醋酸液，過濾除去不溶性雜質(zhì)，60°C磁力攪拌下加入過量的雙氧水至2小時，用NaOH調(diào)pH值至10左右，得到白色沉淀，過濾收集白色沉淀，用去離子水洗至中性，無水乙醇浸泡2h，抽濾沉淀并在常溫下干燥，即制得分子量為5萬道爾頓的殼聚糖。采用粘度法測定各降解時間殼聚糖的粘均分子量(#,)，以0. I mo I L^1CH3CO2Na和0. 2 mo I L-1CH3COOH為溶劑，將不同降解時間的殼聚糖配制成一定濃度的溶液，在30°C恒溫水浴條件下，用烏氏粘度計測定各樣品的分子量。殼聚糖的分子量與降解時間的相關性見圖1，當降解2h時，殼聚糖的分子量降解到5萬。分別取干燥的殼聚糖及降解的殼聚糖樣品適量，與KBr粉末混研壓片，然后在紅外光譜儀中進行分析，分辨率為2cm—1，紅外圖譜見圖2，a，b分別是殼聚糖與降解殼聚糖的紅外光譜圖，從圖2中可以看出a，b兩個紅外光譜圖基本一樣，說明殼聚糖經(jīng)雙氧水降解后，結(jié)構基本不發(fā)生變化，僅分子量降低。b.磁力攪拌條件下，將所得分子量為5萬道爾頓的殼聚糖與葉酸偶聯(lián)，得葉酸殼聚糖偶聯(lián)物，具體做法是稱取150mg葉酸，用IOml的DMSO溶解，再加入150mg脫水縮合劑(I-乙基-3- (3—二甲氨丙基)碳二亞胺鹽酸鹽)，25°C避光攪拌I小時，即得紅棕色的葉酸活性酯的DMSO溶液；稱取IOOmg分子量為5萬的殼聚糖溶解于醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH5)中，并在磁力攪拌條件下緩慢加入葉酸活性酯的DMSO溶液中，30°C下避光反應過夜，然后用NaOH調(diào)pH至10左右，有橘紅色沉淀析出；將上一步的混合液及橘紅色沉淀一同裝入透析袋中，先于PH 7. 4的磷酸鹽緩沖液中透析3天，然后再于去離子水溶液中透析3天；將透析袋內(nèi)的混合液全部轉(zhuǎn)移至西林瓶中，_48°C預凍12h，冷凍干燥機中凍干，即得葉酸殼聚糖偶聯(lián)物。化學反應方程式如下
權利要求
1.一種葉酸偶聯(lián)殼聚糖川芎嗪納米粒制劑，其特征在于依次按如下方法制備 a.將殼聚糖分子量降解至5萬道爾頓； b.磁力攪拌條件下，將所得分子量為5萬道爾頓的殼聚糖與葉酸偶聯(lián)，得葉酸殼聚糖偶聯(lián)物； c.在室溫下，將所得葉酸殼聚糖偶聯(lián)物溶于濃度為1%的醋酸溶液中，制得2mg/ml的葉酸殼聚糖醋酸溶液15ml,將18mg的川彎嗪溶于葉酸殼聚糖醋酸溶液中，200 rpm/min磁力攪拌下，滴加5ml濃度為0. 6 mg/ml的多聚磷酸鈉水溶液,滴加完畢后，繼續(xù)磁力攪拌30min,即得葉酸偶聯(lián)殼聚糖川彎嗪納米粒的混懸液； d.將所制備的混懸液4°C下32900rpm/min離心30min,離心后棄上清,收集沉淀，分散在去離子水中，加凍干保護劑，_48°C預凍12h，冷凍干燥機中凍干，即得葉酸偶聯(lián)殼聚糖川芎嗪納米粒的粉末。
2.根據(jù)權利要求I所述的葉酸偶聯(lián)殼聚糖川芎嗪納米粒制劑，其特征在于所述a步驟是將殼聚糖加入到1%醋酸溶液中，攪拌使之溶解，制得200mg/100ml殼聚糖醋酸液，過濾除去不溶性雜質(zhì)，60 0C磁力攪拌下加入過量的雙氧水至2小時，用NaOH調(diào)pH值至產(chǎn)生白色沉淀，過濾收集白色沉淀，用去離子水洗至中性，無水乙醇浸泡2h，抽濾沉淀并在常溫下干燥，即制得分子量為5萬道爾頓的殼聚糖。
3.根據(jù)權利要求I或2所述葉酸偶聯(lián)殼聚糖川芎嗪納米粒制劑，其特征在于所述b步驟是稱取150mg葉酸，用IOmlDMSO溶解，再加入150mg脫水縮合劑，25°C避光攪拌I小時，即得紅棕色的葉酸活性酯的DMSO溶液；稱取IOOmg分子量為5萬的殼聚糖溶解于醋酸-醋酸鈉緩沖液(PH5)中，并在磁力攪拌條件下緩慢加入葉酸活性酯的DMSO溶液中，30°C下避光反應過夜，然后用NaOH調(diào)pH至橘紅色沉淀析出，上述葉酸與殼聚糖用量的摩爾比為170 1 ;將上一步的混合液及橘紅色沉淀一同裝入透析袋中，先于pH 7.4的磷酸鹽緩沖液中透析3天，然后再于去離子水溶液中透析3天；將透析袋內(nèi)的混合液全部轉(zhuǎn)移至西林瓶中，_48°C預凍12h，冷凍干燥機中凍干，即得葉酸殼聚糖偶聯(lián)物。
全文摘要
本發(fā)明公開一種可提高川芎嗪對腫瘤細胞的聚集濃度、降低對正常細胞分布的葉酸偶聯(lián)殼聚糖川芎嗪納米粒制劑，依次按如下方法制備將殼聚糖分子量降解至5萬道爾頓，與葉酸偶聯(lián)，得葉酸殼聚糖偶聯(lián)物；在室溫下，將所得葉酸殼聚糖偶聯(lián)物溶于的醋酸溶液中，制得葉酸殼聚糖醋酸溶液，將川芎嗪溶于葉酸殼聚糖醋酸溶液中，磁力攪拌下，滴加濃度為0.6mg/ml的多聚磷酸鈉水溶液，滴加完畢后，繼續(xù)磁力攪拌30min，即得葉酸偶聯(lián)殼聚糖川芎嗪納米粒的混懸液；將所制備的混懸液離心后收集沉淀，凍干。
文檔編號A61P35/00GK102716088SQ20121020667
公開日2012年10月10日 申請日期2012年6月21日 優(yōu)先權日2012年6月21日
發(fā)明者程荔春, 范青, 馬輝 申請人:大連醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院