專利名稱：一種膠原基骨軟骨三層復(fù)合物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物材料制備領(lǐng)域，特別涉及一種以膠原為基質(zhì)材料構(gòu)建結(jié)構(gòu)一體化的用于骨軟骨修復(fù)的膠原基骨軟骨三層復(fù)合物及制備方法。
背景技術(shù)：
由于交通事故、體育運(yùn)動、各種關(guān)節(jié)炎疾病引起的骨軟骨損傷給病人及其家屬帶來了巨大的痛苦及沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。影響病人的生活質(zhì)量，增加了社會壓力。目前臨床上治療關(guān)節(jié)骨軟骨病一般采用自體骨軟骨移植及異體骨或異種骨軟骨移植。前者來源有限且造成新的損傷點(diǎn)，后者存在疾病的風(fēng)險。因此都不能被廣泛應(yīng)用。組織工程的提出使生物相容性好、具有仿生結(jié)構(gòu)的生物材料逐漸應(yīng)用到臨床骨軟 骨的治療。然而，傳統(tǒng)方法制備的單一結(jié)構(gòu)的骨軟骨修復(fù)材料已被證明不利于骨軟骨的修復(fù)，而模擬骨軟骨天然多層結(jié)構(gòu)構(gòu)建的組織工程支架材料逐漸成為研究熱點(diǎn)，并取得較好的修復(fù)效果。但能促使有序的持久型組織再生的無細(xì)胞“智能”支架仍然停留在大量的動物實(shí)驗過程中，僅有很少一部分被引入到臨床實(shí)驗中[Arthroscopy 2006; 22 (January(I)):107-12. Instr Course Lect 2008;57:563-71. Injury, Int.J.Care Injured41 (2010)693 - 701] o美國Smith&N印hew公司的TRUFIT plug產(chǎn)品為聚乙丙交酯與硫酸隹丐組成的雙層活性支架，用于修復(fù)5-17mm厚的深度關(guān)節(jié)骨軟骨缺損；意大利Fin-CeramicaFaenza Spa的MaioRege 產(chǎn)品為含不同膠原輕基磷灰石配比組成的三層骨軟骨膠原結(jié)構(gòu)；英國TiGENIX公司的ChondroMimetic 產(chǎn)品為膠原/GAG和膠原/GAG/HAp組成的雙層結(jié)構(gòu)用于修復(fù)關(guān)節(jié)骨軟骨缺損。臨床及動物實(shí)驗對比中膠原基骨軟骨修復(fù)材料比PLA等化學(xué)合成材料的修復(fù)效果更加明顯。層與層之間的連接方式也是多層骨軟骨支架的制備過程中非常關(guān)鍵的一步，而傳統(tǒng)的連接工藝一般是用交聯(lián)劑連接或纖維蛋白膠粘合、簡單的壓合、縫合、或者生物可降解聚合物的外固定，存在嚴(yán)重的軟骨層與軟骨下骨層間分離的現(xiàn)象。因此大量研究報道多層骨軟骨界面加強(qiáng)的方法，例如，中國專利200710078264. 9，名為“具有仿生功能界面骨軟骨復(fù)合組織一體化工程支架”，公布了一種具有足夠機(jī)械強(qiáng)度和仿生功能界面的骨軟骨復(fù)合組織，層與層之間通過鈣化層的鋸齒狀結(jié)構(gòu)連接；中國專利CN200710078392. 3，名為“一種制備含功能界面的組織工程骨軟骨仿生一體化支架的方法”公布了一種通過仿生學(xué)原理和三維打印技術(shù)制備的骨軟骨仿生一體化支架，應(yīng)用存在廣泛爭議的有毒交聯(lián)劑戊二醛。中國專利CN200510015576. 6，名為“一種組織工程骨軟骨復(fù)合物制備方法及其應(yīng)用”中用一種黏性產(chǎn)物將骨和軟骨層連接。這些方法產(chǎn)生的惰性界面很可能會導(dǎo)致修復(fù)過程中鈣化層與軟骨下骨層之間分離。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種構(gòu)建一體化膠原基骨軟骨三層生物材料的方法，即膠原基骨軟骨三層復(fù)合物，克服傳統(tǒng)骨軟骨多層結(jié)構(gòu)構(gòu)建過程中應(yīng)用的物理及化學(xué)連接方法的缺陷。
膠原基骨軟骨三層復(fù)合物的一體化構(gòu)建方法首先利用固態(tài)下離子擴(kuò)散速率慢和物質(zhì)相似相容的原理，利用膠原溶液的液、固兩種形態(tài)界面融合無縫連接，然后利用乙醇與水任意比例互溶的性質(zhì)，通過乙醇向膠原-水體系中的擴(kuò)散將鈣離子快速滲透到膠原纖維束間，同膠原分子表面的磷酸根離子反應(yīng)形成原位復(fù)合的納米羥基磷灰石，該過程具體包括如下步驟(I) 一體化致密膠原/多孔膠原/膠原-水溶性磷酸鹽三層結(jié)構(gòu)的低溫制備。(2)鈣離子單向滲透原位合成法制備一體化致密膠原/多孔膠原/膠原-納米羥基磷灰石復(fù)合三層材料。(3)致密膠原/多孔膠原/膠原-納米羥基磷灰石復(fù)合三層材料的一體化加強(qiáng)。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種膠原基骨軟骨三層復(fù)合物，所述復(fù)合物按如下方法制備(1)在模具中注入 膠原-磷酸鹽混合溶液，-2(T-80°C冷凍4 24h，再注入5 20mg/mL (優(yōu)選l(T20mg/mL)的膠原水溶液，0 8°C條件下靜置I 15min后于-2(T-80°C冷凍4 24h，最后注入35 45mg/mL(優(yōu)選40mg/mL)的膠原水溶液，0 8°C條件下靜置I 15min后于-2(T-80°C冷凍4 24h，去除模具，獲得致密膠原-多孔膠原-膠原水溶性磷酸鹽復(fù)合物；所述膠原為水溶性I型膠原，所述膠原-磷酸鹽混合溶液是將可溶性磷酸鹽與l(T60mg/mL膠原水溶液混合配制而成，所述可溶性磷酸鹽與l(T60mg/mL膠原水溶液中膠原的質(zhì)量比為f 3:1 ;所述膠原-磷酸鹽混合溶液、5 20mg/mL膠原水溶液與35 45mg/mL的膠原水溶液的注入體積比為2飛:2 5:1 ; (2)將步驟(I)獲得的致密膠原-多孔膠原-膠原水溶性磷酸鹽復(fù)合物迅速浸沒在-2(T0°C預(yù)冷2 24h的無水乙醇a中，(TlO°C浸沒反應(yīng)2 10min，去除無水乙醇a后迅速放入-2(T0°C預(yù)冷2 24h的0. 05、. 5mol/L鈣鹽的無水乙醇溶液中，(T40°C浸沒反應(yīng)12 48h，去除反應(yīng)液，獲得致密膠原-多孔膠原-膠原納米羥基磷灰石復(fù)合物；(3)在4 28°C、2(T40rpm (搖床振蕩)條件下將步驟(2)獲得的致密膠原-多孔膠原-膠原納米羥基磷灰石復(fù)合物置于無水乙醇b中浸沒2 48小時，去除無水乙醇b后加入EDC終濃度為4mg/mL的EDC-NHS的MES溶液，在4 28°C、2(T40rpm搖床上振蕩浸沒交聯(lián)2 8小時(優(yōu)選2 4h)，交聯(lián)結(jié)束后去除EDC-NHS的MES溶液，再用pH為7. 4 9. 0的緩沖液于4 28° C條件下浸沒處理12 48h，去除緩沖液后水洗，_80°C冷凍干燥24h，獲得所述膠原基骨軟骨三層復(fù)合物；所述EDC-NHS的MES溶液為I-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)以4 :1的質(zhì)量比溶于濃度為l(T50g/L，pH=5 7. 5的2-嗎啉乙磺酸(MES)的水溶液制備的蛋白交聯(lián)劑溶液，所述蛋白交聯(lián)劑溶液中EDC的終濃度為4mg/mL。進(jìn)一步，步驟(I)所述可溶性磷酸鹽為磷酸一氫鉀、磷酸二氫鉀、磷酸一氫鈉或磷酸二氫鈉中的一種或兩種以任意比例的混合。進(jìn)一步，步驟(I)所述在模具中注入膠原-磷酸鹽混合溶液、5 20mg/mL膠原水溶液與35 45mg/mL膠原水溶液的體積比為3飛2 4 :1。進(jìn)一步，步驟(I)所述模具為聚四氟乙烯模具。進(jìn)一步，步驟(2)所述無水乙醇a的體積用量是致密膠原-多孔膠原-膠原水溶性磷酸鹽復(fù)合物體積的10 20倍(優(yōu)選1(T15倍)。進(jìn)一步，步驟(2)所述0. 05、. 5mol/L鈣鹽的乙醇溶液的體積用量是致密膠原-多孔膠原-膠原水溶性磷酸鹽復(fù)合物體積的1(T20倍。
進(jìn)一步，步驟(2)所述鈣鹽的乙醇溶液為為氯化鈣或硝酸鈣溶于無水乙醇中制成
0.05、. 5mol/L相應(yīng)鈣鹽的無水乙醇溶液。進(jìn)一步，步驟(3)所述EDC終濃度為4mg/mL的EDC-NHS的MES溶液的體積用量以膠原-磷酸鹽混合溶液、5 20mg/mL膠原水溶液、35 45mg/mL的膠原水溶液中膠原的總質(zhì)量計為 0. I 0. 3mL/mg。進(jìn)一步，步驟(3)所述緩沖液為pH值7. 4^9. 0的Tris-base緩沖液，即用IM鹽酸水溶液調(diào)節(jié)濃度為6. 118g/L的三羥甲基氨基甲烷(Tris-base)制成的pH值7. 4^9. 0的緩沖液。本發(fā)明所述EDC終濃度4mg/mL的EDC-NHS的MES溶液按如下方法配制稱取4gMES粉末溶于80mL去離子水，然后用6M的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)其pH為6. 0，分別稱量4mg EDC 和Img NHS,溶于上述MES溶液中，定溶至IOOmL,可配得EDC終濃度4mg/mL的EDC-NHS的MES緩沖液。本發(fā)明所述膠原-磷酸鹽混合溶液、5 20mg/mL膠原水溶液、35 45mg/mL的膠原水溶液中膠原為水溶性I型膠原，所述膠原通過本領(lǐng)域公知的常規(guī)提取法從二月齡健康豬的新鮮跟腱中提取，推薦按如下步驟制備①二月齡健康白豬，新鮮豬腿，剝?nèi)〖‰?，去除筋膜和脂肪，剪成肌腱薄片，浸泡于體積濃度75%的乙醇水溶液中，4°C過夜；②將步驟①的肌腱薄片用蒸餾水沖洗5遍，加入0. 5mol/L的乙酸水溶液中，調(diào)節(jié)pH至I，加入胃蛋白酶，4°C放置3天，獲得膠原溶膠液；所述乙酸水溶液的體積用量以肌腱薄片質(zhì)量計為18. 9mL/g，所述胃蛋白酶質(zhì)量用量以肌腱薄片質(zhì)量計為94. 7mg/g ;③將步驟②獲得的膠原溶膠液于4°C、4000rpm水平離心25分鐘，棄上層脂肪層，將沉淀a用0. 5mol/L乙酸水溶液稀釋3倍體積，在超凈臺中用4層紗布過濾，將濾液與0. 9mol/L的NaCl水溶液以體積比I : 10混合，間歇震蕩，4°C過夜，再在4°C、4000rpm水平離心25分鐘，棄上清液及懸浮物，獲得沉淀b ;④將沉淀b按下述方式之一處理，制備水溶性I型膠原a、將沉淀b用0. 5mol/L的乙酸水溶液在4°C溶解過夜，所述乙酸水溶液與沉淀b的體積比為4 :1，獲得所述水溶性I型膠原；b、將沉淀b置于直徑0. 25 y m的再生纖維素透析袋中，以三蒸水作為透析液，每天換水4飛次，透析3天，將透析袋中透析后的沉淀置于培養(yǎng)皿中_80°C過夜，再于凍干機(jī)中抽干2 3天，獲得所述水溶性I型膠原。本發(fā)明所述無水乙醇a和無水乙醇b均為無水乙醇，為便于區(qū)分不同步驟所用無水乙醇，為表達(dá)方便而分別命名無水乙醇a和無水乙醇b，字母a和b本身沒有含義。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在利用膠原水溶液的液、固兩種形態(tài)界面融合無縫連接，然后利用乙醇與水任意比例互溶的性質(zhì)，通過乙醇向膠原-水體系中的擴(kuò)散將鈣離子快速滲透到膠原纖維束間，同膠原分子表面預(yù)先組裝的磷酸根離子反應(yīng)形成原位復(fù)合的納米羥基磷灰石，而未預(yù)先組裝磷酸根離子的部分無羥基磷灰石形成，從而通過一步反應(yīng)實(shí)現(xiàn)膠原基三層結(jié)構(gòu)的一體化構(gòu)建；本發(fā)明方法提高三層支架的界面結(jié)合性能，防止骨軟骨修復(fù)過程中出現(xiàn)層與層之間分裂的不良后果。


圖I膠原基骨軟骨三層復(fù)合物(即致密膠原/多孔膠原/膠原-納米羥基磷灰石三層復(fù)合物)模擬圖，A為致密膠原層，B為多孔膠原層，C為膠原-納米羥基磷灰石層；
圖2實(shí)施例2制備的膠原基骨軟骨三層復(fù)合物(即致密膠原/多孔膠原/膠原-納米羥基磷灰石三層復(fù)合物)的電鏡掃描(SEM)圖，A為致密膠原層，B為多孔膠原層及C為膠原-羥基磷類石復(fù)合層，膠原-羥基磷灰石層中孔壁較膠原層明顯粗糙。圖3實(shí)施例2，3，4，5制備的膠原基骨軟骨三層復(fù)合物(即致密膠原/多孔膠原/膠原-納米羥基磷灰石三層復(fù)合物)的X射線衍射(XRD)圖譜，a、C、e、g為在緩沖液中處理前的衍射圖，b、d、f、h為在緩沖液中處理后衍射圖；其中(a，b)為實(shí)施例2，(c，d)為實(shí)施例3，(e，f)為實(shí)施例4，(g，h)為實(shí)施例5。圖4新西蘭大白兔骨軟骨造模照片及修復(fù)8周后的結(jié)果a、b :新西蘭大白兔造模為直徑5mm深度4mm的圓柱形骨軟骨缺損，c :修復(fù)8周標(biāo)本大體圖片；d HE染色結(jié)果表明材料與周轉(zhuǎn)組織結(jié)合良好，而且有新的軟骨形成。
具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此EDC終濃度4mg/mL的EDC-NHS的MES溶液按如下方法配制稱取4g MES粉末溶于80mL去離子水，然后用6M的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)其pH為6. 0，分別稱量4mg EDC和Img NHS,溶于上述MES溶液中，定溶至IOOmL,可配得EDC終濃度4mg/mL的EDC-NHS的MES交聯(lián)劑溶液。實(shí)施例I水溶性I型膠原的提?、賹⒍慢g健康白豬的新鮮豬腿，剝?nèi)〖‰?，去除筋膜和脂肪，剪成肌腱薄?20g，浸泡于500mL體積濃度75%的乙醇水溶液中，4°C過夜將步驟①的肌腱薄片95g用蒸餾水沖洗5遍，加入0. 5mol/L的乙酸水溶液1800mL中，用6M氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)pH至1，加入胃蛋白酶(Sigma-ALDRICH，P7000-25G，1:10000，601U/mg) 9g，4°C放置 3 天，得到膠原溶膠液1800mL ;③將步驟②得到的膠原溶膠液于4°C、4000rpm水平離心25分鐘，棄上層脂肪層，將沉淀a用0. 5mol/L乙酸水溶液稀釋3倍體積，在超凈臺中用4層紗布過濾，將濾液與0. 9mol/L的NaCl水溶液以體積比I :10混合，間歇震蕩，4°C過夜，再在4°C、4000rpm水平離心25分鐘，棄上清液及懸浮物，獲得沉淀b ;將沉淀b置于直徑為0. 25 y m的再生纖維素透析袋中，以三蒸水作為透析液，每天換水4飛次，透析3天，將透析袋中透析后的沉淀置于培養(yǎng)皿中_80°C過夜，再于凍干機(jī)中抽干2 3天，獲得所述水溶性I型膠原62g。實(shí)施例2:(I)將實(shí)施例I方法提取的水溶性I型膠原分別溶于去離子水中配制成濃度為lOmg/mL膠原水溶液IOmL, lOmg/mL膠原水溶液5mL,配制35mg/mL的膠原水溶液5mL ;將300mg磷酸氫二鉀溶于上述10mg/mL膠原水溶液IOmL(膠原質(zhì)量為IOOmg)中制得膠原-磷酸鹽混合溶液；取十個深度為8_，直徑為8_的聚四氟乙烯圓柱形模具，每個模具分別先注入5mm高度的膠原-磷酸鹽混合溶液，-20° C冷凍24小時，再加入2mm高度的10mg/mL的膠原水溶液，0°C條件中靜置Imin后，-20° C冷凍24小時后，再注入Imm高度的35mg/mL的膠原水溶液，0°C條件中靜置Imin后，-20° C冷凍24小時，去除模具，獲得致密膠原-多孔膠原-膠原水溶性磷酸鹽復(fù)合物；(2)將11. Ig無水氯化鈣溶于無水乙醇中配制成0. 2mol/L鈣鹽的無水乙醇溶液500mL，-20° C下預(yù)冷2小時，同時將500mL無水乙醇于-20° C下預(yù)冷2小時；將步驟(I)中獲得的致密膠原-多孔膠原-膠原水溶性磷酸鹽復(fù)合物(4. 2cm3)從模具中取出后迅速放A 42mL上述預(yù)冷無水乙醇中，(TC浸沒反應(yīng)2分鐘，取出，迅速放入42mL的上述預(yù)冷的鈣鹽的無水乙醇溶液中，0° C浸沒反應(yīng)12小時，去除反應(yīng)液，獲得致密膠原-多孔膠原-膠原納米羥基磷灰石復(fù)合物；(3)將步驟(2)制備的致密膠原-多孔膠原-膠原納米羥基磷灰石復(fù)合物浸入40mL的無水乙醇中，在4° C、20rpm搖床上浸沒2小時，去除無水乙醇后，加入EDC終濃度4mg/mL的EDC-NHS的MES溶液15. 8mL(膠原-磷酸鹽混合溶液、lOmg/mL膠原水溶液、35mg/mL的膠原水溶液中膠原的總質(zhì)量為52. 7mg)，在4° C、20rpm搖床上浸沒交聯(lián)2小時，交聯(lián)結(jié)束后去除EDC-NHS的MES溶液，用160mL、pH=7. 4的tris-base緩沖液在4° C條件下浸沒處理12小時后，去除緩沖液水洗，_80°C冷凍干燥24h，獲得一體化致密膠原/多孔膠原/膠原-納米羥基磷灰石復(fù)合三層材料，即膠原基骨軟骨三層復(fù)合物。膠原基骨軟骨三層復(fù)合物模擬圖見圖I所示，A為致密膠原層，B為多孔膠原層，C為膠原-納米羥基磷灰石層；電鏡掃描(SEM)圖見圖2所示，其中A為致密膠原層，B為多孔膠原層及C為膠原-羥基磷 類石復(fù)合層，膠原-羥基磷灰石層中孔壁較膠原層明顯粗糙；X射線衍射(XRD)圖譜見圖3中的a，b所示，a為在緩沖液中處理前的衍射圖，b為在緩沖液中處理后衍射圖。實(shí)施例3 (I)將實(shí)施例I方法提取的水溶性I型膠原分別溶于去離子水中配制成濃度為20mg/mL膠原水溶液IOmL, 15mg/mL膠原水溶液5mL,40mg/mL的膠原水溶液5mL ;將200mg磷酸氫二鉀溶于上述20mg/mL膠原水溶液IOmL中制得膠原-磷酸鹽混合溶液；取十個深度為8mm，直徑為8mm的聚四氟乙烯圓柱形模具，每個模具分別先注入4mm高度的膠原-磷酸鹽混合溶液，-50° C冷凍16小時后，再注入3_高度的15mg/mL的膠原水溶液，4°C條件中靜置5min后，-50° C冷凍16小時后，再注入Imm高度的40mg/mL的膠原水溶液，4°C條件中靜置5min后，-50° C冷凍16小時，去除模具，獲得致密膠原-多孔膠原_膠原水溶性磷酸鹽復(fù)合物；(2)將2. Hg無水氯化I丐溶于無水乙醇中配制成0. 05mol/L I丐鹽的無水乙醇溶液500mL, -10。C下預(yù)冷12小時，同時將500mL無水乙醇于-10° C下預(yù)冷12小時；將步驟(I)中獲得的致密膠原-多孔膠原-膠原水溶性磷酸鹽復(fù)合物(4. 2cm3)從模具中取出后迅速放入63mL預(yù)冷無水乙醇中，2°C浸沒反應(yīng)5分鐘，取出，迅速放入42mL的上述鈣鹽的無水乙醇溶液中，10° C浸沒反應(yīng)24小時，去除反應(yīng)液，獲得致密膠原-多孔膠原-膠原納米羥基磷灰石復(fù)合物；(3)將步驟(2)制備的致密膠原-多孔膠原-膠原納米羥基磷灰石復(fù)合物浸入40mL的無水乙醇中，在25° C、30rpm搖床上浸沒8小時，去除無水乙醇后，加入EDC終濃度4mg/mL的EDC-NHS的MES溶液12. 6mL(膠原-磷酸鹽混合溶液、15mg/mL膠原水溶液、40mg/mL的膠原水溶液中膠原的總質(zhì)量為82. 9mg)，在25° C、30rpm搖床上浸沒交聯(lián)4小時，交聯(lián)結(jié)束后，去除EDC-NHS的MES溶液，用160mL、pH=8的tris-base緩沖液25° C浸沒處理24小時后，去除緩沖液后水洗，-80°C冷凍干燥24h，獲得一體化致密膠原/多孔膠原/膠原-納米羥基磷灰石復(fù)合三層材料，即膠原基骨軟骨三層復(fù)合物。X射線衍射(XRD)圖譜見圖3中的c、d所示，c為在緩沖液中處理前的衍射圖，d為在緩沖液中處理后衍射圖。
實(shí)施例4 (I)將實(shí)施例I方法提取的水溶性I型膠原分別溶于去離子水中配制成濃度為30mg/mL膠原水溶液IOmL, lOmg/mL膠原水溶液5mL, 45mg/mL的膠原水溶液；將500mg磷酸氫二鈉溶于上述30mg/mL膠原水溶液IOmL中制得膠原-磷酸鹽混合溶液；取十個深度為8mm,直徑為8_的聚四氟乙烯圓柱形模具，每個模具分別先注入3_高度的膠原-磷酸鹽混合溶液，-80° C冷凍8小時后，再加入4mm高度的10mg/mL的膠原水溶液，8°C條件中靜置IOmin后，-80° C冷凍8小時后，再注入Imm高度的45mg/mL的膠原水溶液，8°C條件中靜置IOmin后，-80° C冷凍8小時，去除模具，獲得致密膠原-多孔膠原_膠原水溶性磷酸鹽復(fù)合物；(2)將5. 55g無水氯化I丐溶于無水乙醇中配制成0. lmol/L I丐鹽的無水乙醇溶液500mL，0。C下預(yù)冷24小時，同時將500mL無水乙醇于0° C下預(yù)冷24小時；將步驟(I)中獲得的致密膠原-多孔膠原-膠原水溶性磷酸鹽復(fù)合物(4. 2cm3)從模具中取出后迅速放入42mL預(yù)冷無水乙醇中，6°C浸沒反應(yīng)8分鐘，取出，迅速放入63mL的上述鈣鹽的無水乙醇溶液中，25。C浸沒反應(yīng)36小時，去除反應(yīng)液，獲得致密膠原-多孔膠原-膠原納米羥基磷灰石復(fù)合物；·(3)將步驟(2)制備的致密膠原-多孔膠原-膠原納米羥基磷灰石復(fù)合物浸入40mL的無水乙醇中，在28° C、40rpm搖床上浸沒16小時，去除無水乙醇后，加入EDC終濃度4mg/mL的EDC-NHS的MES溶液17. 58mL (膠原-磷酸鹽混合溶液、10mg/mL膠原水溶液、45mg/mL的膠原水溶液中膠原的總質(zhì)量為87. 92mg)，在28。C、40rpm搖床上浸沒交聯(lián)2小時，交聯(lián)結(jié)束后，去除EDC-NHS的MES溶液，用160mL、pH=8. 4的tris-base緩沖液，在28°C條件下，浸沒處理36小時后，去除緩沖液后水洗，_80°C冷凍干燥24h，獲得一體化致密膠原/多孔膠原/膠原-納米羥基磷灰石復(fù)合三層材料，即膠原基骨軟骨三層復(fù)合物。X射線衍射(XRD)圖譜見圖3中的e、f所示，e為在緩沖液中處理前的衍射圖，f為在緩沖液中處理后衍射圖。實(shí)施例5 (I)將實(shí)施例I方法提取的水溶性I型膠原分別溶于去離子水中配制成濃度為60mg/mL膠原水溶液10mL,20mg/mL膠原水溶液5mL,40mg/mL的膠原水溶液5mL ;將600mg磷酸氫二鈉溶于上述60mg/mL膠原水溶液IOmL中制得膠原-磷酸鹽混合溶液；取十個深度為8mm，直徑為8mm的聚四氟乙烯圓柱形模具，每個模具分別先注入5mm高度的膠原-磷酸鹽混合溶液，-80° C冷凍4小時后，再加入2mm高度的20mg/mL的膠原水溶液，4°C條件中靜置15min，-80° C冷凍4小時后，再注入Imm高度的40mg/mL的膠原水溶液，4°C條件中靜置15min，-80° C冷凍4小時，去除模具，獲得致密膠原-多孔膠原_膠原水溶性磷酸鹽復(fù)合物；(2)將27. 75g無水氯化I丐溶于無水乙醇中配制成0. 5mol/L I丐鹽的無水乙醇溶液500mL, -20° C下預(yù)冷12小時，同時將500mL無水乙醇于-20° C下預(yù)冷12小時；將步驟
(I)中獲得的致密膠原-多孔膠原-膠原水溶性磷酸鹽復(fù)合物(4. 2cm3)從模具中取出后迅速放入63mL預(yù)冷無水乙醇中，10°C浸沒反應(yīng)10分鐘，取出，迅速放入84mL的上述鈣鹽的無水乙醇溶液中，40° C浸沒反應(yīng)48小時，去除反應(yīng)液，獲得致密膠原-多孔膠原-膠原納米羥基磷灰石復(fù)合物；
(3)將步驟(2)制備的致密膠原-多孔膠原-膠原納米羥基磷灰石復(fù)合物浸入40mL的無水乙醇中，在25° C、30rpm搖床上浸沒48小時，去除無水乙醇后，加入EDC終濃度4mg/mL的EDC-NHS的MES溶液19. ImL (膠原-磷酸鹽混合溶液、20mg/mL膠原水溶液、40mg/mL的膠原水溶液中膠原的總質(zhì)量為191mg)在25。C、30rpm搖床上浸沒交聯(lián)2小時，交聯(lián)結(jié)束后，去除EDC-NHS的MES溶液，用160mL、pH=9的tris-base緩沖液，在25° C下浸沒處理48小時后，去除緩沖液后水洗，_80°C冷凍干燥24h，獲得一體化致密膠原/多孔膠原/膠原-納米羥基磷灰石復(fù)合三層材料，即膠原基骨軟骨三層復(fù)合物。X射線衍射(XRD)圖譜見圖3中的g、h所示，g為在緩沖液中處理前的衍射圖，h為在緩沖液中處理后衍射圖。實(shí)施例6I)將實(shí)施例I方法提取的水溶性I型膠原分別溶于去離子水中配制成濃度為40mg/mL膠原水溶液IOmL, 15mg/mL膠原水溶液5mL,40mg/mL的膠原水溶液5mL ;將600mg磷酸氫二鈉溶于上述40mg/mL膠原水溶液IOmL中制得膠原-磷酸鹽混合溶液；取十個深度為8mm，直徑為8mm的聚四氟乙烯圓柱形模具，每個模具分別先注入4mm高度的膠原-磷酸鹽混合溶液，-80° C冷凍4小時后，再加入3mm高度的15mg/mL的膠原水溶液，4°C條件中 靜置15min，-80° C冷凍4小時后，再注入Imm高度的40mg/mL的膠原水溶液，4°C條件中靜置15min，-80° C冷凍4小時，去除模具，獲得致密膠原-多孔膠原_膠原水溶性磷酸鹽復(fù)合物；(2)將27. 75g無水氯化I丐溶于無水乙醇中配制成0. 5mol/L I丐鹽的無水乙醇溶液500mL，-20° C下預(yù)冷4小時，同時將500mL無水乙醇于-20° C下預(yù)冷4小時；將步驟(I)中獲得的致密膠原-多孔膠原-膠原水溶性磷酸鹽復(fù)合物(4. 2cm3)從模具中取出后迅速放A 42mL預(yù)冷無水乙醇中，10°C浸沒反應(yīng)10分鐘，取出，迅速放入84mL的上述鈣鹽的無水乙醇溶液中，40° C浸沒反應(yīng)48小時，去除反應(yīng)液，獲得致密膠原-多孔膠原-膠原納米羥基磷灰石復(fù)合物；(3)將步驟(2)制備的致密膠原-多孔膠原-膠原納米羥基磷灰石復(fù)合物浸入40mL的無水乙醇中，在25° C、30rpm搖床上浸沒48小時，去除無水乙醇后，加入EDC終濃度4mg/mL的EDC-NHS的MES溶液18. 4mL (膠原-磷酸鹽混合溶液、15mg/mL膠原水溶液、40mg/mL的膠原水溶液中膠原的總質(zhì)量為120. 4mg)在25° C、30rpm搖床上交聯(lián)4小時，交聯(lián)結(jié)束后，去除EDC-NHS的MES溶液，用160mL、pH=9的tris-base緩沖液，15° C條件下，浸沒處理32小時后，去除緩沖液后水洗，-80°C冷凍干燥24h，獲得一體化致密膠原/多孔膠原/膠原-納米羥基磷灰石復(fù)合三層材料，即膠原基骨軟骨三層復(fù)合物。動物實(shí)驗及樣本HE染色見圖4。動物實(shí)驗參照權(quán)威期刊雜志中(Yasuyuki Kawaguchi et al. , J MaterSciiMater Med (2011) 22:397 - 404)報導(dǎo)的大白兔骨軟骨缺損造模的方法。將制備的膠原基骨軟骨三層復(fù)合物修剪成直徑5mm、高度3mm的圓柱后移植到相應(yīng)尺寸的缺損中，常規(guī)培養(yǎng)8周后取材，進(jìn)行常規(guī)HE染色分析。結(jié)果表明8周后，經(jīng)過該方法得到的膠原基支架降解較慢，沒有炎癥反應(yīng)，支架與周圍正常組織之間結(jié)合良好，而且有大量的新生軟骨組織形成。
權(quán)利要求
1.一種膠原基骨軟骨三層復(fù)合物，其特征在于所述復(fù)合物按如下方法制備(1)在模具中注入膠原-磷酸鹽混合溶液，-2(T-8(TC冷凍4 24h，再注入5 20mg/mL膠原水溶液，0 8°C條件下靜置I 15min后于-2(T-8(TC冷凍4 24h，最后注入35 45mg/mL的膠原水溶液，(T8°C條件下中靜置f 15min后于-2(T-8(TC冷凍4 24h，去除模具，獲得致密膠原-多孔膠原-膠原水溶性磷酸鹽復(fù)合物；所述膠原為水溶性I型膠原，所述膠原-磷酸鹽混合溶液是將可溶性磷酸鹽與l(T60mg/mL膠原水溶液混合配制而成，所述可溶性磷酸鹽與l(T60mg/mL膠原水溶液中膠原的質(zhì)量比為廣3:1 ;所述膠原-磷酸鹽混合溶液、5 20mg/mL膠原水溶液與35 45mg/mL的膠原水溶液的注入體積比為2飛:2 5:1 ; (2)將步驟(I)獲得的致密膠原-多孔膠原-膠原水溶性磷酸鹽復(fù)合物迅速放入-2(T0°C預(yù)冷2 24h的無水乙醇a中，(TlO°C浸沒反應(yīng)2 10min，去除無水乙醇a后迅速放入-2(T(TC預(yù)冷2 24h的0. 05、. 5mol/L鈣鹽的無水乙醇溶液中，(T40°C浸沒反應(yīng)12 48h，去除反應(yīng)液，獲得致密膠原-多孔膠原-膠原納米羥基磷灰石復(fù)合物；(3)在r28°C、2(T40rpm條件下將步驟(2)獲得的致密膠原-多孔膠原-膠原納米羥基磷灰石復(fù)合物在無水乙醇b中浸沒2 48h，去除無水乙醇b后加入EDC終濃度為4mg/mL的EDC-NHS的MES溶液，在4 28°C、2(T40rpm條件下浸沒2 8h進(jìn)行交聯(lián)，交聯(lián)結(jié)束后去除EDC-NHS的MES溶液，再用pH為7. 4^9. 0的緩沖液于4 28°C條件下浸沒處理12 48h，去除緩沖液后水洗，冷凍干燥，獲得所述膠原基骨軟骨三層復(fù)合物；所述EDC-NHS的MES溶液為I-乙基-3- (3- 二甲基氨丙基)-碳化二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺以4 1的質(zhì)量比溶于濃度為l(T50g/L，pH=5^7. 5的2-嗎啉乙磺酸的水溶液制備的蛋白交聯(lián)劑溶液，所述蛋白交聯(lián)劑溶液中EDC的終濃度為4mg/mL。
2.如權(quán)利要求I所述膠原基骨軟骨三層復(fù)合物，其特征在于步驟(I)所述可溶性磷酸鹽為磷酸一氫鈉、磷酸二氫鈉、磷酸一氫鉀或磷酸二氫鉀中的一種或兩種以任意比例的混口 o
3.如權(quán)利要求I所述膠原基骨軟骨三層復(fù)合物，其特征在于步驟(I)所述在模具中所注入的膠原-磷酸鹽混合液、5 20mg/mL的膠原水溶液與35 45mg/mL的膠原水溶液的體積比為3 5 :2 4 :1。
4.如權(quán)利要求I所述膠原基骨軟骨三層復(fù)合物，其特征在于步驟(I)所述模具為聚四氟乙烯模具。
5.如權(quán)利要求I所述膠原基骨軟骨三層復(fù)合物，其特征在于步驟(2)所述無水乙醇a的體積用量是致密膠原-多孔膠原-膠原水溶性磷酸鹽復(fù)合物體積的10 20倍。
6.如權(quán)利要求I所述膠原基骨軟骨三層復(fù)合物，其特征在于步驟(2)所述0.05、. 5mol/L鈣鹽的無水乙醇溶液的體積用量是致密膠原-多孔膠原_膠原水溶性磷酸鹽復(fù)合物體積的10 20倍。
7.如權(quán)利要求I所述膠原基骨軟骨三層復(fù)合物，其特征在于步驟(2)所述鈣鹽的無水乙醇溶液為氯化鈣或硝酸鈣溶于無水乙醇中制成0. 05、. 5mol/L鈣鹽的無水乙醇溶液。
8.如權(quán)利要求I所述膠原基骨軟骨三層復(fù)合物，其特征在于步驟(3)所述EDC終濃度為4mg/mL的EDC-NHS的MES溶液的體積用量以膠原-磷酸鹽混合溶液、5 20mg/mL膠原水溶液、35 45mg/mL的膠原水溶液中膠原的總質(zhì)量計為0. f 0. 3mL/mg。
9.如權(quán)利要求I所述膠原基骨軟骨三層復(fù)合物，其特征在于步驟(3)所述緩沖液為pH值I. 4 9. 0的Tris-base緩沖液。
10.如權(quán)利要求I所述膠原基骨軟骨三層復(fù)合物，其特征在于膠原-磷酸鹽混合溶液、l(T20mg/mL膠原水溶液、35 45mg/mL的膠原水溶液中膠原為水溶性I型膠原，所述膠原按如下步驟制備①取二月齡健康白豬的新鮮豬腿，剝?nèi)〖‰欤コ钅ず椭?，剪成肌腱薄片，浸泡于體積濃度75%的乙醇水溶液中，4°C過夜；②將步驟①的肌腱薄片用蒸餾水沖洗5遍，加入0. 5mol/L的乙酸水溶液中，調(diào)節(jié)pH至1，加入胃蛋白酶，4°C放置3天，獲得膠原溶膠液；所述乙酸水溶液的體積用量以肌腱薄片質(zhì)量計為18. 9mL/g，所述胃蛋白酶質(zhì)量用量以肌腱薄片質(zhì)量計為94. 7mg/g ;③將步驟②獲得的膠原溶膠液于4°C、4000rpm水平離心25分鐘，棄上層脂肪層，將沉淀a用0. 5mol/L乙酸水溶液稀釋3倍體積，在超凈臺中用4層紗布過濾，將濾液與0. 9mol/L的NaCl水溶液以體積比I :10混合，間歇震蕩，4°C過夜， 再在4°C、4000rpm水平離心25分鐘,棄上清液及懸浮物,獲得沉淀b ;④按下述方式之一處理，制備水溶性I型膠原a、將沉淀b用0. 5mol/L的乙酸水溶液在4°C溶解過夜，所述乙酸水溶液與沉淀b的體積比為4 :1，獲得所述水溶性I型膠原；b、將沉淀b置于直徑0. 25 y m的再生纖維素透析袋中，以三蒸水作為透析液，每天換水4飛次，透析3天，將透析袋中透析后的沉淀置于培養(yǎng)皿中-80°C過夜，再于凍干機(jī)中抽干2 3天，獲得所述水溶性I型膠原。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種膠原基骨軟骨三層復(fù)合物及其制備方法，所述復(fù)合物按如下方法制備在模具中依次注入膠原-磷酸鹽混合溶液，5~20mg/mL膠原水溶液和35~45mg/mL的膠原水溶液，形成致密膠原-多孔膠原-膠原水溶性磷酸鹽復(fù)合物，將該復(fù)合物經(jīng)無水乙醇、鈣鹽的無水乙醇溶液浸沒處理后，再用EDC-NHS的MES溶液進(jìn)行交聯(lián)處理，獲得所述膠原基骨軟骨三層復(fù)合物；本發(fā)明方法提高三層支架的界面結(jié)合性能，防止骨軟骨修復(fù)過程中出現(xiàn)層與層之間分裂的不良后果。
文檔編號A61L27/40GK102805881SQ20121020680
公開日2012年12月5日 申請日期2012年6月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月18日
發(fā)明者趙洪石, 陳隆坤, 其他發(fā)明人請求不公開姓名 申請人:浙江星月生物科技股份有限公司