專利名稱：他昔莫芬的新用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥用途，具體他昔莫芬的新用途。
背景技術(shù)：
隨著人類壽命的延長,老年男性的下尿道(lower urinary tract, LUT)越來越多的受到社會和醫(yī)學(xué)界的關(guān)注。流行病學(xué)調(diào)查表明40-49歲的男性中有約26%的人具有中度和重度的下尿道綜合癥(lower urinary tract syndrome, LUTS);在 70 歲的男性中有約 46% 出現(xiàn) LUTS。我國的流行病調(diào)查表明，在上海市市區(qū)一般人群中抽取40歲以上男性居民1583名，通過國際前列腺癥狀評分(IPSS)和生活質(zhì)量(QoL)評分等方法，調(diào)查該人群中LUTS的、患病率及對生活質(zhì)量的影響。結(jié)果在40-49歲、50-59歲、60-69歲和大于70歲年齡組中，中、重度LUTS (IPSS彡8)患病率分別為8. 7%、19· 4%,32. 3%和40. 2%，呈現(xiàn)隨年齡增長患病率上升趨勢；隨著LUTS嚴(yán)重程度的増加，患者的QoL評分也顯著上升(P〈0.01)。我國男性LUTS患病率也不斷接近歐美國家，嚴(yán)重影響男性的生理健康和生活質(zhì)量。男性的LUTS的主要病因是膀胱出口梗阻(bladder outlet obstruction, BOO),尿道發(fā)炎，小便失禁和膀胱癌。膀胱出口梗阻(B00)是下尿道綜合癥(LUTS)中最常見的ー種病(Groutz etal. 2001)。B00從尿動(dòng)力學(xué)定義是指膀胱頸和近端尿道處各種原因?qū)е碌哪蛞毫鞒鲎枇ι?，泌尿困難，不能排尿以及不能排空膀胱中的儲尿。而尿頻、尿急、尿痛則為LUTS的典型癥狀。B00常導(dǎo)致膀胱逼尿肌功能異常，繼而產(chǎn)生一系列嚴(yán)重的并發(fā)癥，如尿流間斷，泌尿困難，不能排尿以及不能排空膀胱中的儲尿，嚴(yán)重的能引起腎積水，慢性腎功能不全，長期排尿困難導(dǎo)致腹壓增高，還可引起腹股溝疝，內(nèi)痔與脫肛，腎衰竭和猝死等。因此研究B00后逼尿肌功能的變化一直是泌尿外科研究中最活躍的領(lǐng)域。逼尿肌和尿道括約肌在收縮過程中協(xié)同失調(diào)(DUSD)，和/或在排尿過程中外括約肌舒張失敗引起B(yǎng)00。一直以來，DUSD被認(rèn)為是由于神經(jīng)系統(tǒng)疾病或上部脊髄損傷，而B00在神經(jīng)系統(tǒng)正常的成年男性發(fā)病率更高，且隨著年齡的增長而加重。雄激素一直被認(rèn)為是主要調(diào)控男性泌尿生殖系統(tǒng)的生長、分化并維持其正常的功能，大量的研究表明，雌激素也在許多方面調(diào)節(jié)著它們的功能。流行病學(xué)表明，隨著年齡的增加，老年男性雌/雄激素比例失衡，雄激素水平，特別是具有生物活性的睪酮水平下降，與此同時(shí)，雌激素比例上升。臨床研究表明雄激素水平與B00有著非常密切的相關(guān)性。老年男性這種雌/雄激素比例的升高與老年男性B00發(fā)病率的升高恰好平行。臨床的研究表明，良性前列腺增生(BPH)和前列腺炎是引起B(yǎng)00最常見的原因。現(xiàn)已確認(rèn)，雌激素是誘導(dǎo)BPH、前列腺炎和前列腺癌的主要危險(xiǎn)因子之一。雌激素主要是通過兩種雌激素的受體(ERa和β )行使其生物學(xué)功能。ERi3在人類尿道上皮和膀胱平滑肌細(xì)胞核中表達(dá)，同時(shí)在大鼠的膀胱頸、尿道括約肌、近尿道和前列腺的橫紋肌中表達(dá)。在雄性小鼠和膀胱頸，后尿道周圍區(qū)域有ERa的表達(dá)，在犬齒科和兔的前列腺部尿道也有表達(dá)，而在這些物種的膀胱體中沒有發(fā)現(xiàn)ERa的表達(dá)。雖然ERa，i3的功能尚未完全清楚，但是ERs在LUT的廣泛分布也暗示了下尿道(LUS)是雌激素的ー個(gè)直接的靶。實(shí)驗(yàn)表明，用こ烯雌酚(DES)處理新生鼠引起尿頻、尿少和膀胱下部梗阻。而且在尿道周圍的基質(zhì)中、膀胱頸和膀胱中ERs的表達(dá)水平上調(diào)。這種ERs的異常表達(dá)暗示著LUT中局部的雌激素的作用擾亂局部雌/雄激素比例的平衡，引起膀胱功能的異常。DES還能夠降低雄性大鼠膀胱的收縮性，且睪酮和雌激素聯(lián)合處理Nobel大鼠引起前列腺發(fā)炎和梗阻性排尿，雌激素是雄激素在芳香酶(細(xì)胞色素P450)作用生成的。因此芳香酶是調(diào)節(jié)雌/雄激素比例平衡的非常重要的調(diào)節(jié)者。大量的臨床觀察和實(shí)驗(yàn)表明，升高的雌激素水平，特別是睪酮/雌激素的比例失衡是BOO形成的重要病因。BOO的影響因素及發(fā)病機(jī)制I、良性前列腺增生良性前列腺增生(Benign Prostate Hyperplasia, BPH)是老年男性常見的疾病(Canales et al. 2005;Dedhia and McVary 2008)。臨床研究表明，良性前列腺增生和前列腺炎是引起B(yǎng)OO最常見的原因(Gat etal. 2008; Schwinn and Roehrborn 2008)。伴隨著前列腺增生,鄰近的泌尿系統(tǒng)也會發(fā)生一些變化，增生的腺體向尿道內(nèi)突出，使前列腺段尿道彎曲、延長、變窄，膀胱底部抬高，尿道阻カ增加，從而引起排尿困難，甚至尿潴留(Verhamme et al. 2002)。由于尿液排出受阻，膀胱逼尿肌必須過度收縮才能完成排尿；由于前列腺尿道部位的梗阻，尿液排泄不暢，膀胱逼尿肌會代償性地肥大(Brent and Stephens1975;Mattiasson and Uvelius 1982)，以克服尿道的阻力，肌肉壁要比正常增厚2cm，同時(shí)膀胱粘膜上會造成肌肉束狀增生，輸尿管和膀胱三角區(qū)也肥厚(Levin et al. 1984;Gilpinet al. 1985)。隨著梗阻的進(jìn)ー步發(fā)展，膀胱逼尿肌即使過度收縮也不能將尿液完全排空，出現(xiàn)殘余尿。膀胱壁肌束增厚突出形成小梁，小梁之間形成憩室，極易出現(xiàn)泌尿系感染和膀胱結(jié)石；長期排尿困難導(dǎo)致腹壓增高，可引起腹股溝疝、脫肛或內(nèi)痔等。如果不積極治療，可出現(xiàn)膀胱輸尿管返流，導(dǎo)致腎積水，壓迫腎實(shí)質(zhì)使腎功能減退，甚至腎功能衰竭。BPH是BOO的ー個(gè)很重要的病因，但并不是唯一的原因。研究提示，隨著前列腺體積的増大，前列腺擠壓尿道導(dǎo)致的BOO程度也隨之加重，但二者間的決定系數(shù)僅為O. 08，說明前列腺増大并不必然導(dǎo)致嚴(yán)重的BOO (雙衛(wèi)兵，2004)。也有研究者認(rèn)為BPH病人得BOO是由于隨著年齡的增長，膀胱逼尿肌功能不全造成的。2、神經(jīng)因素膀胱的神經(jīng)為內(nèi)臟神經(jīng)，其中交感神經(jīng)來自第11、12胸節(jié)和第1、2腰節(jié)，經(jīng)盆叢隨血管分布至膀胱壁，使膀胱平滑肌松弛，尿道內(nèi)括約肌收縮而儲尿。副交感神經(jīng)為來自脊髓第2-4骶節(jié)的盆內(nèi)臟神經(jīng)，支配膀胱逼尿肌，抑制尿道括約肌，是與排尿有關(guān)的主要神經(jīng)。交感神經(jīng)末梢的興奮，可通過釋放腎上腺素和去甲腎上腺素而使平滑肌收縮，使得前列腺內(nèi)和后尿道的壓カ增高。α I腎上腺素受體(adrenoceptor, AR)介導(dǎo)交感神經(jīng)反應(yīng),如平滑肌收縮和心肌、變力。在去甲腎上腺素的激動(dòng)下，a IAR主要與Gq蛋白偶聯(lián)，激活磷脂酶C2i3，將細(xì)胞膜上的磷酯酰肌醇_4，5 ニ磷酸水解成三磷酸肌醇和ニ?；视蛢煞N第二信使，然后通過細(xì)胞內(nèi)·丐的轉(zhuǎn)運(yùn)引起肌肉收縮并激活蛋白激酶C(Graham et al. 1996)。a IAR在前列腺、尿道、脊髓和膀胱中表達(dá)(Walden et al. 1997;Gosling et al. 1999)，實(shí)驗(yàn)表明，在前列腺中的主要亞型是a Ia AR和a Id AR，a la AR的阻滯劑能夠引起前列腺平滑肌的舒張，因此a IaAR阻滯劑能夠改善BPH中前列腺平滑肌的收縮狀態(tài)(Andersson 2000 ;Michel and Vrydag2006)。到現(xiàn)在為止，在對人類尿道(包括膀胱頸和前列腺內(nèi)尿道)的研究表明，a IaAR在尿道表達(dá)(G. 1993)。通過對病人的研究發(fā)現(xiàn)，在膀胱逼尿肌中a IdAR優(yōu)勢表達(dá)(Schwinn andRoehrborn 2008)，人類逼尿肌中a IdAR占66%，a IaAR占34%，不表達(dá)a Ib AR，而且無論在mRNA水平還是蛋白質(zhì)水平，a Id AR的表達(dá)量均是a Ia AR的兩倍(Malloy et al. 1998)。在BOO的大鼠中，a Id AR上調(diào)。在正常大鼠中a IAR的mRNA含量為70%為a la，5%為a lb,25% 為 a Id ;而在 BOO 大鼠中 23% 為 a la, 2% 為 a lb, 75% 為 a Id (Hampel et al. 2002)。Andersson提出，正常生理狀態(tài)下逼尿肌對交感神經(jīng)興奮的主要反應(yīng)是β 2介導(dǎo)的舒張反應(yīng)，而α I介導(dǎo)的收縮反應(yīng)作用極??；但在良性前列腺梗阻(ΒΡ0，以前稱作癥狀性BPH)、不 穩(wěn)定逼尿肌和神經(jīng)源性膀胱引起的LUTS患者中，逼尿肌對交感神經(jīng)興奮的主要反應(yīng)可能由β 2介導(dǎo)的舒張反應(yīng)轉(zhuǎn)變?yōu)棣?I介導(dǎo)的收縮反應(yīng)(Andersson2000)。通過動(dòng)物和人類膀胱的實(shí)驗(yàn)，a Ia AR阻滯劑雖然能夠帶來前列腺平滑肌的舒張和増加尿流量，改善BPH引起的梗阻癥狀，但是BPH帶來的LUTS的評分沒有改變。只有a Ia AR和a Id AR阻滯劑聯(lián)合使用，LUTS 的評分才得以改變(Haynes et al. 2003; Sigala et al. 2004;Barendrecht etal. 2008)。a 2AR，主要是a 2a AR亞型，在膀胱，尿道和前列腺中均有表達(dá)，但表達(dá)很少。它介導(dǎo)神經(jīng)遞質(zhì)釋放的節(jié)前抑制，同時(shí)是ー些物種尿道的微弱收縮劑(但不是人類)。它們在下尿道的節(jié)后中的作用至今還不太清楚。前列腺平滑肌松弛通過a 21a受體介導(dǎo)，因此a 21a受體拮抗劑在治療良性前列腺增生中可以提高尿流率，但不能緩解刺激癥狀。(Haynes etal. 2003;Michel and Vrydag 2006)。人類的逼尿肌上有大量的β AR存在(Rohner et al. 1978)。交感神經(jīng)興奮時(shí)，β AR介導(dǎo)膀胱逼尿肌舒張，完成儲尿過程。以前認(rèn)為人類逼尿肌上有β1、β2 ニ種受體亞型，其中，β 2AR是逼尿肌舒張的主要因素(Perlberg and Caine 1982;Tsujii et al. 1992)。但是，現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，非選擇性的β受體激動(dòng)劑誘發(fā)的逼尿肌的舒張作用不能被β 和β2受體拮抗劑所抑制。由此提示人逼尿肌可能由第三種β AR亞型所調(diào)節(jié)。1994年，國際藥理聯(lián)合會受體命名與藥物分會將β AR分為β I、β 2和β 3三種受體亞型。其中β 3AR亞型(又稱“非典型” PAR)具有內(nèi)源性兒茶酚胺功能，可介導(dǎo)脂肪分解、抗肥胖以及抑制逼尿肌和胃腸道平滑肌收縮等。在人類逼尿肌中P3AR亞型占到97%(Igawa et al. 1999; Takedaet al. 1999)。人類逼尿肌的舒張功能主要由β 3AR亞型所介導(dǎo)(Yamaguchi 2002; Hayneset al. 2003;Michel and Vrydag 2006)。β 3AR亞型的基因突變可以使β 3AR的表達(dá)減少，從而導(dǎo)致逼尿肌的舒張功能減弱，這可能是發(fā)生逼尿肌不穩(wěn)定的關(guān)鍵因素之一。3AR介導(dǎo)膀胱、尿道和前列腺平滑肌的舒張。因此β 3激動(dòng)劑可以作為膀胱過度活動(dòng)癥(overactivebladder)的候選藥物(Gruneberger 1984;Lindholm and Lose 1986)。3、激素
睪酮(雄激素)一直被認(rèn)為是主要調(diào)控男性泌尿生殖系統(tǒng)的生長、分化并維持其正常的功能的激素。睪酮在5 α還原酶的作用下轉(zhuǎn)化為雙氫睪酮(Dihydrotestosterone,DHT)刺激前列腺增生，前列腺增生是引起膀胱出ロ梗阻的主要病因之一。研究發(fā)現(xiàn)，老年男性血清中的睪酮并不高，但是前列腺局部組織中的DHT水平很高，且隨著年齡的增長呈上升趨勢，這是激發(fā)良性前列腺增生的罪魁禍?zhǔn)?Lagiou et al. 1997; Feldman and Feldman2001;Roberts et al. 2004)。過去認(rèn)為，雌激素可以拮抗男性雄激素，因而減少睪酮向雙氫睪酮的轉(zhuǎn)化，使已增生的前列腺組織逐漸萎縮、變小。1936年，Zuckerman就指出雌激素是前列腺纖維基質(zhì)生長刺激因子(Zuckerman 1936;Page et al. 2006)，并指出前列腺的致病因子不在于器官中的雌激素水平，而在于雌、雄激素間的平衡。一些醫(yī)生的科學(xué)實(shí)驗(yàn)也證實(shí)雌激素是前列腺纖維基質(zhì)生長刺激因子。研究發(fā)現(xiàn)，血漿和前列腺中雌激素相對水平越高，前列腺體積越大(Roberts et al. 2004)。由于老年男性血漿中雌激素水平保持穩(wěn)定，而雄激素水平下降，就出現(xiàn)雌激素/雄激素比例増加的現(xiàn)象。隨著年齡增加，男性的雌激素濃度較穩(wěn)定或稍有增カロ，與青年男性相比，老年人的雌雄激素比例升高，有學(xué)者認(rèn)為，這種雌雄激素平衡的改變可能是前列腺基質(zhì)誘導(dǎo)活性而致前列腺增生發(fā)生的原因。有研究顯示，前列腺增生組織中 結(jié)合狀態(tài)的雌激素能夠激活細(xì)胞合成和分泌細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，在細(xì)胞周圍形成一層致密的纖維結(jié)締組織，進(jìn)而參與前列腺增生的發(fā)生、發(fā)展。在最初的間質(zhì)增生中，雌激素的作用是主要的；在前列腺增生的過程中，雌雄激素具有協(xié)同作用，因而有人稱雌激素是前列腺基質(zhì)生長的刺激剤。雌激素可増加前列腺的雄激素受體，應(yīng)用雌激素后，前列腺內(nèi)DHT增高，故可促使前列腺增生(Niu et al. 2003; Ansari et al. 2008)。在目前現(xiàn)有的激素治療(雄激素耗竭、抗雄激素、5 α -還原酶抑制劑和芳香酶抑制劑)中，5α還原酶抑制劑是唯一在隨機(jī)臨床試驗(yàn)中顯示良好有效性和可接受的安全性藥物，它最常見的副作用是性功能不良，如射精減少、性欲下降和陽萎(Roehrborn etal.2002;Kaplan 2006;Roehrborn 2008)。4、其它發(fā)病因素糖尿病會導(dǎo)致支配膀胱的神經(jīng)發(fā)生病理改變，引起B(yǎng)00。糖尿病時(shí)形態(tài)學(xué)上可以發(fā)現(xiàn)脊髓及其神經(jīng)根萎縮或呈橡皮樣變，神經(jīng)膠質(zhì)纖維化伴空泡變性，前角細(xì)胞萎縮而代之以脂肪組織；自主神經(jīng)元染色質(zhì)溶解，胞漿空泡變性及核壞死、呈念珠狀或梭狀斷裂；外周神經(jīng)髓鞘水腫、變性、斷裂而脫落；軸突變性、纖維化、運(yùn)動(dòng)終板腫脹(龔宇2002)。由于膀胱的傳入及傳出纖維損害，導(dǎo)致膀胱感覺受損和膀胱收縮功能障礙。進(jìn)ー步的研究顯示，膀胱感覺受損與膀胱和腰骶背根神經(jīng)節(jié)中神經(jīng)生長因子水平降低，導(dǎo)致A δ和C纖維傳入通路功能障礙有關(guān)(Sasaki K2003)。膀胱收縮功能障礙的產(chǎn)生可能與膽堿能神經(jīng)損害、膽堿こ酰轉(zhuǎn)移酶活性下降、膽堿能M受體上調(diào)、G蛋白及信號傳導(dǎo)異常等有關(guān)(Steers WD 1994)。缺血再灌注也是引起B(yǎng)00的因素之一。平滑肌細(xì)胞的缺血再灌注引起細(xì)胞內(nèi)鈣離子的釋放，導(dǎo)致鈣離子超負(fù)荷和氧自由基的釋放。這些過程又將依次引起磷脂酶的活化(如PLA2)、蛋白酶的活化(如鈣蛋白酶)、膜脂質(zhì)的過氧化反應(yīng)等，這些一系列的反應(yīng)將對神經(jīng)、細(xì)胞內(nèi)膜、線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)產(chǎn)生進(jìn)行性的損傷。隨著損傷不斷加重，膀胱將失代償，弓丨起不可逆的代謝和收縮功能障礙。膀胱失代償最終有兩種后果一種是低容量、低順應(yīng)性、極弱或無收縮功能的纖維化厚壁膀胱；另ー種是大容量、擴(kuò)張的、極弱或無收縮功能的纖維化薄壁膀胱(Masick JM2001; Levin RM 2002)。膀胱部位的病變，例如膀胱癌、膀胱結(jié)石，尿結(jié)石等損害了正常的膀胱結(jié)構(gòu)或阻礙了正常的排尿通路，均會造成不同程度的B00。目前的治療手段主要有藥物治療、手術(shù)治療，其中I、外科手術(shù)治療目前臨床上可接受的介入性治療主要是經(jīng)尿道前列腺切除術(shù)(TURP)、開放性前列腺切除術(shù)(OS)、經(jīng)尿道前列腺電氣化術(shù)(TUVP)、激光氣化術(shù)(VLAP)、經(jīng)尿道微波治療術(shù)(TUMT)、經(jīng)尿道穿刺消融術(shù)(TUNA)、間質(zhì)激光凝固術(shù)(ILC)、尿道支架術(shù)。臨床上應(yīng)根據(jù)病人的具體情況，選擇最有利于病人的手術(shù)方式。標(biāo)準(zhǔn)的外科手術(shù) 療效明顯，癥狀得長期改善且危險(xiǎn)性小。但目前越來越傾向于微創(chuàng)治療，在一定程度上癥狀得到改善，危險(xiǎn)性(某些病例)也小于開放手術(shù)，但是目前缺乏有關(guān)持久性證據(jù)，尚未確定這些新技術(shù)在費(fèi)用和療效上是否比標(biāo)準(zhǔn)外科手術(shù)(如TURP)有更大的優(yōu)勢(楊勇2002)。2、藥物治療a IAR拮抗劑在前列腺中的主要亞型是a IaAR和a IdAR, a IaAR拮抗劑能夠改善BPH中前列腺平滑肌收縮狀態(tài)(Andersson 2000;Michel and Vrydag 2006),減輕前列腺對尿道的擠壓，從而改善膀胱梗阻的癥狀。a Ia AR阻滯劑雖然能夠帶來前列腺平滑肌的舒張和增加尿流量，改善BPH引起的梗阻癥狀，但是BPH帶來的LUTS的評分沒有改變。只有a Ia AR和a Id AR阻滯劑聯(lián)合使用，LUTS的評分才得以改變(Haynes et al. 2003; Sigalaet al. 2004; Barendrecht et al. 2008)。a IAR拮抗劑其有效性和安全性已在開放擴(kuò)展臨床試驗(yàn)中得到證實(shí)。但臨床現(xiàn)有的所有a IAR拮抗劑均與頭暈、乏カ和立位性低血壓的發(fā)生有關(guān)。5α-還原酶抑制劑睪酮在5α-還原酶的作用下轉(zhuǎn)化為雙氫睪酮刺激前列腺增生，前列腺增生是引起膀胱出口梗阻的主要病因之一。在目前現(xiàn)有的激素治療中，5α-還原酶抑制劑非那雄胺是唯一在隨機(jī)臨床試驗(yàn)中顯示良好有效性和可接受的安全性藥物。非那雄胺最常見的副作用是性功能不良，如射精減少、性欲下降和陽萎。目前已上市的藥物皆是針對治療前列腺病變引起的膀胱出ロ梗阻，尚未見到對雌/雄激素比例失調(diào)引起的膀胱出ロ梗阻的治療。他昔莫芬(tamoxifen),曾用名三苯氧胺、諾瓦得士、Nolvadex、ΤΑΜ,化學(xué)名稱為(Z)-2-[對-(1，2- ニ苯基-I- 丁烯基)苯氧基]-N, N- ニ甲こ基胺。他莫昔芬屬于三苯こ烯非留體抗雌激素類抗腫瘤藥物，它通過與靶細(xì)胞質(zhì)中的雌激素受體競爭性結(jié)合，阻斷過高的雌激素作用于乳腺組織，減少雌激素對乳腺導(dǎo)管與間質(zhì)的過度刺激，因此可用于乳腺癌的治療，此外，該藥物還具有抗氧、膜調(diào)節(jié)、抗多耐藥性(Multi-drug Resistance, MDR)、心臟保護(hù)功能、抗病毒、抗念珠菌、對胰島素生長因子有影響(能夠顯著降低血中IGF-1 (Insulinlike Growth Factor I)的水平)等多種作用。但是未見到他莫昔芬在膀胱出ロ梗阻相關(guān)用途方面的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種他莫昔芬的新用途。本發(fā)明提供了他莫昔芬在制備治療男性膀胱出口梗阻及其引起的下尿道綜合征的藥物中的應(yīng)用。上述應(yīng)用中所述膀胱出ロ梗阻的癥狀是尿頻、尿急、排尿困難、淋漓不盡、排尿時(shí)間延長。所述膀胱出口梗阻引起的下尿道綜合征的癥狀，凡有尿頻、尿急、尿痛的癥狀都屬于下尿道綜合征的典型癥狀。所述膀胱出口梗阻及其引起的下尿道綜合征是由雌/雄激素比例失調(diào)引起的；本發(fā)明所述他莫昔芬為含有他莫昔芬的制劑，該制劑可市售獲得，或與藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑組成制劑。所述制劑為片劑、膠囊、顆粒劑、丸剤、ロ服液或注射劑，所述注射劑為注射液或凍干粉針。 所述藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑是指藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的藥物載體，選自填充劑、粘合劑、崩解劑、潤滑劑、助懸劑、潤濕劑、溶劑、表面活性劑或矯味劑中的ー種或幾種。所述填充劑選自淀粉、蔗糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、微晶纖維素或葡萄糖等;所述粘合劑選自纖維素衍生物、藻酸鹽、淀粉、糊精、明膠或聚こ烯吡咯烷酮等；所述崩解劑選自微晶纖維素、羧甲基淀粉鈉、交聯(lián)聚こ烯吡咯烷酮、低取代羥丙基纖維素或交聯(lián)羧甲基纖維素鈉；所述潤滑劑選自硬脂酸、聚こニ醇、碳酸鈣、碳酸氫鈉、微粉硅膠、滑石粉或硬脂酸鎂；所述助懸劑選自微粉硅膠、蜂蠟、纖維素、固態(tài)聚こニ醇；所述潤濕劑選自甘油、吐溫-80、こ氧基氫化蓖麻油或卵磷脂；所述溶劑選自こ醇、液態(tài)聚こニ醇、異丙醇、吐溫-80、甘油、丙ニ醇或植物油，所述植物油選自大豆油、蓖麻油、花生油、調(diào)和油等；所述表面活性劑選自十二烷基苯磺酸鈉、硬脂酸、聚氧こ烯-聚氧丙烯共聚物、月旨肪酸山梨坦或聚山梨酯(吐溫)等；所述矯味劑選自阿斯巴甜、蔗糖素、香精、檸檬酸或糖精鈉。所述他莫昔芬的用量為l_50mg/Kg/d，優(yōu)選為5_25mg/Kg/d。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于I、本發(fā)明提出了他莫昔芬的新用途，該藥物能夠快速有效的治療雄性小鼠膀胱出ロ梗阻，為臨床治療提供理論基礎(chǔ)，同時(shí)為治療膀胱出ロ梗阻提供了ー種新方法；2、實(shí)驗(yàn)證實(shí)用他莫昔芬來治療膀胱出口梗阻及其導(dǎo)致的下尿道綜合征，癥狀減輕明顯，治療率為100%。


圖I :芳香酶表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)示意圖。圖2 :PCR鑒定結(jié)果，6號為陽性，+為陽性對照。圖3 Southern Blot篩選結(jié)果，I為陽性對照，是回收的探針，6為southern blot陽性鼠。圖4 :小鼠生殖泌尿系統(tǒng)表型的鑒定，左邊兩鼠1為陽性轉(zhuǎn)基因的尿潴留小鼠，2為陰性對照組的野生型小鼠，右邊ー鼠為圖3Southern blot分析的含有轉(zhuǎn)芳香酶基因的陽性鼠的解剖學(xué)分析為尿潴留引起的膀胱的形態(tài)學(xué)變化。圖5 :膀胱組織HE染色及Van Gieson染色結(jié)果，A為HE染色結(jié)果，B為Van Gieson染色結(jié)果；其中，I為野生型小鼠，2為陽性轉(zhuǎn)基因小鼠；a表示膠原纖維，b表示肌纖維。圖6 :芳香化酶基因的半定量RT-RCR，A1、A2為芳香化酶轉(zhuǎn)基因小鼠，WT1，WT2為野生型小鼠。圖7 :芳香化酶Western Blot檢測結(jié)果，A1，A2為陽性轉(zhuǎn)基因小鼠，WT為野生型小鼠。圖8 :他莫昔芬處理的轉(zhuǎn)基因鼠和陽性對照鼠(左邊為陽性對照組，右邊為他莫昔芬組)，疝氣癥狀消失明顯(疝氣往往伴隨著尿道梗阻);
圖9 :他莫昔芬處理的轉(zhuǎn)基因鼠和陽性對照鼠的尿潴留情況，解刨學(xué)分析，左邊WT為野生小鼠，中間為陽性對照，右邊為他莫昔芬組；圖10 :括約肌的組織病理學(xué)分析，A :野生型鼠尿道ロ的括約??；B :轉(zhuǎn)基因鼠尿道ロ的括約肌；C :他莫昔芬處理的轉(zhuǎn)基因鼠尿道ロ的括約肌。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例I:小鼠模型的制備參考又獻(xiàn)Molecular mechanisms of bladder outlet obstructionin transgenic male mice over expressing aromatase (Cyp 19a I). Lin W,Rahman NA,Lin J, Zhang H, Gou K, Yu W, Zhu D, Li N, Huhtaniemi I, Li X. Am JPathol. 201IMar;178(3):1233-44. PMID:21356374。試驗(yàn)動(dòng)物C57BL/6小鼠購自中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物中心。C57BL/6是國外引進(jìn)的近交系，是B6F129和B6JEiF 78雜交，而后經(jīng)過129代的同胞兄妹近交而生
產(chǎn)的近交系，相關(guān)基因型是a/a。試驗(yàn)試劑pUB6/V5_HisA(Cat. No. V25020),購自 Invitrogen, Carlsbad, CA ；pRC/CMV(Cat. No. 10131027)，購自 Invitrogen, Carlsbad, CA。用C57BL/6小鼠構(gòu)建膀胱出ロ梗阻動(dòng)物模型，具體方法如下—、重組表達(dá)載體(或?yàn)榉枷忝副磉_(dá)載體)的構(gòu)建I、Ubiquitin C基因的啟動(dòng)子及其外顯子I和內(nèi)含子I的獲得用限制性內(nèi)切酶BglII和HindIII酶切pUB6/V5_HisA，回收Ubiquitin C基因的啟動(dòng)子及其外顯子I和內(nèi)含子I片段，其中Ubiquitin C基因的啟動(dòng)子及其外顯子I和內(nèi)含子I及該片段在載體pUB6/V5-HisA上兩端的酶切位點(diǎn)的核苷酸序列如序列表中SEQUENCEI所示；人工序列I自5'末端起第1-6位核苷酸為BglII的識別序列(A|GATCT)，人工序列I自5'末端起第1218-1223位核苷酸為HindIII的識別序列(A| AGCTT);人工序列I自5'末端起第7-1217位核苷酸為片段Ubiquitin C基因的啟動(dòng)子及其外顯子I和內(nèi)含子I的序列，其人工合成序列見序列表中的SEQUENCE I所示。2、人芳香酶編碼基因的cDNA的獲得兩端帶有酶切位點(diǎn)的人芳香酶編碼基因的cDNA全長序列如序列表中人工序列2所示，其中序列2自5’末端第1-6位核苷酸為HindIII的識別序列(A | AGCTT)，第2155-2160位核苷酸為XbalI的識別序列(T| CTAGA)，第7-2154位核苷酸為人芳香酶編碼基因的cDNA全長序列，其人工合成序列見序列表中的SEQUENCE 2所示。3、牛生長激素基因的polyAイ目號序列在載體PRC/CMV上具有牛生長激素基因的polyA信號序列，其核苷酸序列見序列表中的SEQUENCE 3所示；4、重組表達(dá)載體的構(gòu)建用限制性內(nèi)切酶BglII和HindIII酶切載體pRC/CMV，回收大片段(即去除CMV啟動(dòng)子的載體片段)，將其與步驟(I)中酶切獲得的Ubiquitin C基因的啟動(dòng)子及其外顯子I和內(nèi)含子I片段連接，得到重組載體pRC/Ubiquitin C ； 用限制性內(nèi)切酶HindIII/Xbal酶切重組載體pRC/Ubiquitin C，回收大片段；用限制性內(nèi)切酶Hindlll/Xbal酶切人芳香酶編碼基因的cDNA片段，連接，得到重組表達(dá)載體pRC/Ubiquitin C/cDNA(即芳香酶表達(dá)載體),其結(jié)構(gòu)如圖I所示,得到DNA片段“UbiquitinC基因的啟動(dòng)子、外顯子I和內(nèi)含子I+人芳香酶編碼基因的cDNA+bGH polyA”，其核苷酸序列見序列表中的SEQUENCE 4所示。ニ、轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建將構(gòu)建的芳香酶表達(dá)載體用Bgl II和Dra I進(jìn)行雙酶切，回收DNA片段，SPUbiquitin C基因的啟動(dòng)子、外顯子I和內(nèi)含子I+人芳香酶編碼基因的cDNA+bGHpolyA，將上述DNA片段制成2ng/l·! L的懸液，顯微原核注射入C57BL/6小鼠受精卵中；胚胎移植入待孕母體子宮中；生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因小鼠，得到的轉(zhuǎn)基因小鼠計(jì)作H)代。具體的實(shí)驗(yàn)步驟如下(一)超數(shù)排卵(超排)與取卵I、超數(shù)排卵取4-6周齡的母鼠作超排卵供體，腹腔注射孕馬血清(PMSG)和人絨毛膜促性腺激素(hCG)誘導(dǎo)母鼠排卵，二者注射時(shí)間間隔為45h，排卵發(fā)生在注射hCG后13h，注射劑量為每鼠8ul。注射hCG后每只母鼠置于ー個(gè)単獨(dú)飼養(yǎng)的正常公鼠籠內(nèi)，次日晨檢查陰道栓。2、取卵用頸椎脫臼法處死有陰道栓的雌鼠，把完整的輸卵管帶ー小段子宮剪下，置于PBS平衡鹽溶液中，在解剖鏡下找出輸卵管傘部，用帶針頭的注射器將受精卵沖出，用透明質(zhì)酸酶去除包圍著的顆粒細(xì)胞后立即將卵子換至新鮮培養(yǎng)液內(nèi)洗滌4次即可用于顯微注射。(ニ)注射外源 DNA 顯微注射需用顯微操作儀，用來控制顯微持卵針和顯微注射針。取已制備好的受精卵細(xì)胞和外源DNA懸液，在倒置顯微鏡下做顯微注射。注射時(shí)先用持卵針吸住受精卵，再用注射針吸取外源DNA懸液，然后推動(dòng)注射針，使其刺入受精卵的雄原核，將1-2 μ L DNA注入(DNA濃度2ng/l·! L)。注射完畢，慢慢抽出注射針，將受精卵放入新的培養(yǎng)液中，使其恢復(fù)。50-80%的受精卵在顯微注射后仍保持健康。(三)注射后受精卵(或胚胎)的移植將注射有外源DNA的受精卵在顯微操作當(dāng)天移植到交配后O. 5d假孕雌鼠的輸卵管內(nèi)。外源DNA可直接導(dǎo)入原核內(nèi)，導(dǎo)入的外源DNA在卵裂前與受體基因組整合。待假孕母鼠產(chǎn)出幼仔后，可用幼鼠尾巴提取基因組DNA進(jìn)行檢測。
本實(shí)驗(yàn)采用如下移植方法用戊巴比妥鈉麻醉受體鼠，從假孕鼠陰道向子宮頸管道插入外徑10毫米的粗導(dǎo)管，然后將直徑5毫米的細(xì)導(dǎo)管插入粗導(dǎo)管內(nèi)側(cè)，伸入到子宮體或一側(cè)子宮角。將囊胚連同2毫升保存液一起通過細(xì)導(dǎo)管移植進(jìn)去，具體是用干冰產(chǎn)生出來的ニ氧化碳經(jīng)過導(dǎo)管將囊胚吹入到子宮內(nèi)1-3分鐘。也可以采用如下移植方法用戊巴比妥鈉麻醉受體鼠，沿受體鼠背部中線最后一根肋骨水平切Icm左右切ロ，輕輕撥開切ロ，可見位于卵巣上方的白色脂肪墊.用小鑷子夾住白色脂肪墊將其拉到體外，用小血管夾夾住，并靠其重力起固定作用，以防輸卵管縮回體腔。用移卵管吸15-20個(gè)受精卵準(zhǔn)備移植.將小鼠轉(zhuǎn)到解剖鏡下仔細(xì)尋找到輸卵管?？梢娸斅压鼙哗`層呈半透明的囊膜所包繞，將囊膜撕破而暴露輸卵管，將移卵管內(nèi)受精卵移植到輸卵管膨大部。將輸卵管小心放回，縫合。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。三、轉(zhuǎn)基因小鼠的篩選
陽性小鼠的鑒定及繁育運(yùn)用PCR及Southern Blot方法篩選陽性轉(zhuǎn)基因小鼠；(一) PCR 篩選方法模板DNA為假孕母鼠所產(chǎn)Founder幼鼠的鼠尾DNA，(假孕母鼠生產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物稱為Founder)正向引物見序列表中的SEQUENCE 5，反向引物見序列表中的SEQUENCE 6，擴(kuò)增572bp片段，不能擴(kuò)增出該片段的為陰性，能擴(kuò)增出該片段并通過測序正確的為陽性。結(jié)果如圖2所示，6號為陽性，+為陽性對照，將PCR陽性的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，測得的序列如序列表中的SEQUENCE 4的自5'末端起第853-1424位核苷酸所示，表明PCR產(chǎn)物結(jié)果正確。(ニ)Southern Blot 篩選方法I、基因組DNA的制備按常規(guī)鼠尾提取DNA的方法制備DNA ；2、基因組DNA的限制酶切在I. 5ml 離心管中依次加入 20μ g DNA(1 μ g/μ I)，4· 0μ I 10Χ 酶切 buffer，
5.O μ IEcoR KlOU/μ I)，加 ddH20 至 500 μ 1，37°C消化過夜。3、基因組DNA消化產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳制備0. 8%凝膠一般用于Southern雜交的電泳膠取0. 8%。電泳電泳樣品中加入IOXLoading緩沖液,混勻后上樣，留一或兩泳道加DNAMarker。l_2V/cm, DNA從負(fù)極泳向正扱。電泳至溴酚藍(lán)指示劑接近凝膠另一端時(shí)，停止電泳。正常電泳圖譜呈現(xiàn)一連續(xù)的涂抹帯。4, DNA從瓊脂糖凝膠轉(zhuǎn)移到固相支持物(毛細(xì)管法)I)試劑準(zhǔn)備變性液0. 5M NaOH ；1. 5M NaCl;中和液IM Tris-HCl(pH 7.4)；
I.5M NaCl ;轉(zhuǎn)移液(20XSSC):175. 3g NaCl ；82. 2g檸檬酸三鈉，NaOH調(diào) pH至 7· 0，加 ddH20至 IOOOml02)操作步驟堿變性室溫下將凝膠浸入數(shù)倍體積的變性液中30分鐘。中和將凝膠轉(zhuǎn)移到中和液15分鐘。轉(zhuǎn)移按凝膠的大小剪裁帶正電尼龍膜并剪去一角作為標(biāo)記，水浸濕后，浸入轉(zhuǎn)移液中5分鐘。剪ー張比膜稍寬的長條Whatman 3mm濾紙作為鹽橋，再按凝膠的尺寸剪3-5張濾紙和大量的紙巾備用。轉(zhuǎn)移過程一般需要8-24小時(shí)，每隔數(shù)小時(shí)換掉已經(jīng)濕掉的紙巾。轉(zhuǎn)移液用20XSSC。注意在膜與膠之間不能有氣泡。整個(gè)操作過程中要防止膜上沾染其它污物。轉(zhuǎn)移結(jié)束后取出膜，浸入6XSSC溶液數(shù)分鐘，洗去膜上沾染的凝膠顆粒，置于兩張濾紙之間，80°C烘2小吋，然后將NC膜夾在兩層濾紙間，保存于干燥處。5、探針標(biāo)記進(jìn)行Southern雜交的探針一般用放射性物質(zhì)標(biāo)記I)取25-50ng模板DNA(EcoRI酶切構(gòu)建完成的質(zhì)粒載體，回收2. 7K片段)于O. 5ml離心管中，100°C變性5分鐘，立即置冰浴。
2)在另一個(gè)O. 5ml離心管中加入10 μ I Labeling 5Xbuffer (含有隨機(jī)引物，隨機(jī)引物是小的核苷酸序列)，2 μ I dNTPmix (含dATP、dGTP、dTTP各O. 5mM)，2 μ IBSA (小牛血清白蛋白)，3μ 1[α -32P] dCTP，5UKl enow 酶。3)將步驟I)中的變性模板DNA加入到步驟2)中的離心管中，加ddH20至50 μ 1，混勻，室溫內(nèi)放置90分鐘。4)加50 μ I終止緩沖液終止反應(yīng)。6、雜交預(yù)雜交膜浸入2XSSC中5分鐘，在雜交瓶中加入雜交液(8cmX8cm的膜加5ml即可)，將膜的背面貼緊雜交瓶壁，正面朝向雜交液。放入42°C雜交爐中，使雜交體系升到42°C，得到預(yù)雜交的雜交液。雜交倒出預(yù)雜交的雜交液，換入等量新的已升溫至42°C的雜交液。將探針100°C加熱5分鐘，使其變性，迅速加到雜交瓶中，42°C雜交過夜。7、洗膜與檢測取出膜，在2XSSC溶液中漂洗5分鐘，然后按照下列條件洗膜2XSSC/0. 1%SDS，42°C，10 分鐘；I X SSC/0. 1%SDS, 42°C，10 分鐘；O. 5XSSC/0. 1%SDS，42°C，10 分鐘；O. 2XSSC/0. 1%SDS，56°C，10 分鐘；O. I X SSC/0. 1%SDS，56°C，10 分鐘。在洗膜的過程中，不斷振搖，不斷用放射性檢測儀探測膜上的放射強(qiáng)度。實(shí)踐證明，當(dāng)放射強(qiáng)度指示數(shù)值較環(huán)境背景高1-2倍吋，是洗膜的終止點(diǎn)。上述洗膜過程無論在哪一歩達(dá)到終點(diǎn)，都必須停止洗膜。洗完的膜浸入2XSSC中2分鐘，取出膜，用濾紙吸干膜表面的水份，并用保鮮膜包裹，注意保鮮膜與膜之間不能有氣泡。將膜正面向上，放入磷板中，三天后掃描磷板，結(jié)果如圖3 (I為陽性對照，是回收的芳香酶基因的探針，6為southernblot分析的含有轉(zhuǎn)芳香酶基因的陽性鼠，2-5分別是轉(zhuǎn)基因小鼠產(chǎn)生的陰性后代。以上結(jié)果表明，篩選得到的陽性轉(zhuǎn)基因小鼠正確。四、遺傳穩(wěn)定性檢測將步驟三篩選得到的陽性雌鼠與野生型C57BL/6公鼠配對，繁育得到Fl代；對卩1代小鼠進(jìn)行篩選，方法同步驟三所述。以此類推，繁育F2代，F(xiàn)3代，F(xiàn)4代，每一代都進(jìn)行陽性篩選，陽性轉(zhuǎn)基因鼠中均能檢測到該插入的基因。五、陽性轉(zhuǎn)基因鼠的表型鑒定及組織學(xué)分析和基因表達(dá)分析
將按照上述方法得到的Fl代和F2代陽性轉(zhuǎn)基因公鼠成年后進(jìn)行生殖泌尿系統(tǒng)表型鑒定、組織病理學(xué)分析、基因表達(dá)分析。(一)表型鑒定結(jié)果陽性轉(zhuǎn)基因公鼠成年后生殖泌尿系統(tǒng)表型鑒定結(jié)果如圖4所示，左邊兩鼠I為陽性轉(zhuǎn)基因的尿潴留小鼠，2為陰性對照組的野生型小鼠，右邊ー鼠為圖3Southernblot分析的含有轉(zhuǎn)芳香酶基因的陽性鼠的解剖學(xué)分析為尿潴留引起的膀胱的形態(tài)學(xué)變化。(ニ)組織學(xué)分析解剖獲取所述轉(zhuǎn)基因小鼠的膀胱及尿道，放入到4%的多聚甲醛溶液中固定48小時(shí)，水洗4小時(shí)后進(jìn)行組織包埋，HE染色及膠原Van Giesan染色，具體步驟如下I、將固定好的組織用PBS洗滌2次，毎次10分鐘。然后進(jìn)行脫水和浸蠟，方法如、下70%こ醇(I小時(shí))，80%こ醇(I小時(shí))，90%こ醇(I小時(shí))，95%こ醇(I小吋)，無水こ醇(I小時(shí)X 2), ニ甲苯(15分鐘一次,5分鐘一次),石臘一 (30分鐘)，石臘ニ(30分鐘)，石臘三(30分鐘)；2、將處理過的組織放在包埋盒底部中央，倒入融化的蠟，室溫中冷卻；3、切片I)將已固定和修好的石蠟塊裝在切片機(jī)的夾物臺上；2)將護(hù)刀蓋推至打開位置；3)搖動(dòng)快速進(jìn)退手輪，使石蠟塊與刀ロ貼近，但不超過刀ロ ；4)調(diào)整石蠟塊與刀ロ之間的角度與位置，刀片與石蠟切片約成15-30度；5)調(diào)整厚度調(diào)節(jié)器到所需的切片厚度，一般5 μ m ;6) 一切調(diào)整好后就可以切片，此時(shí)右手搖動(dòng)大手輪，左手持毛筆將蠟帶提起，搖轉(zhuǎn)速度以每分鐘40-50轉(zhuǎn)為宜。7)切成的蠟帶到20-30厘米時(shí)，右手用另ー支毛筆將蠟帶挑起，平放在蠟帶盤上(注意靠刀面的一面較光滑朝下)。4、貼片切好的蠟帶置于撈片機(jī)溫水中(注意蠟片光面向下)，待其完全展開后，取一清潔的以粘片劑處理的載玻片撈取至片上中間部位。并作好標(biāo)記。5、烤片把玻片標(biāo)本置于片架上，37°C溫度烤片24小吋。6、HE 染色I(xiàn))組織芯片置于ニ甲苯中浸泡15分鐘；2)更換ニ甲苯后再浸泡7分鐘；3)無水こ醇I中浸泡5分鐘；4)無水こ醇II中浸泡5分鐘；5) 95%こ醇中浸泡5分鐘；6) 90%こ醇中浸泡5分鐘；7) 80%こ醇中浸泡5分鐘；8) 70%こ醇中浸泡5分鐘；9)蘇木精中浸泡15分鐘；10)水洗2分鐘；11)鹽酸酒精分化10秒；
12) 80%こ醇中2分鐘；13) 70%こ醇中2分鐘;14)伊紅中79秒；15) 90%こ醇中浸泡3分鐘；16) 95%こ醇中浸泡3分鐘；17)無水こ醇II中浸泡3分鐘；18)無水こ醇I中浸泡5分鐘；19) ニ甲苯II中3分鐘；
20) ニ甲苯I中3分鐘；21)中性樹膠封片，鏡檢。7、Van Gieson 染色I(xiàn))試劑的配制Weigert 氏蘇木素A 液lg 蘇木素(haematoxylin), IOOml 無水酒精；B 液:4ml30% 三氯化鐵(ferric chloride), 95ml 蒸懼水，Iml 鹽酸。Van Gieson 氏液A 液:lg 酸性品紅(acid fuchsin), IOOml 蒸懼水。B 液1. 22%苦味酸飽和水溶液(picric acid)。Weigert氏蘇木素臨用前取A液和B液等份混合,幾個(gè)小時(shí)內(nèi)用完,最長不得超過一天。蘇木素配后經(jīng)二十多天才能成熟，必須提前配制。該液能抵抗弱酸性染液，對已著染的細(xì)胞核在酸性染液的作用，不易被脫去顔色，如果不特別深染，則無須分化。Van Gieson氏液取B液9ml,加入A液Iml,即可使用。2)操作方法切片脫蠟至水；用Weigert氏蘇木素染20min ;水洗；必要時(shí)可分化；流水沖洗IOmin ;染VanGieson氏液Imin ;用95%酒精快速分化；無水酒精脫水,ニ甲苯透明，封固。染色結(jié)果如圖5所示(A表示HE染色結(jié)果，B表示膠原纖維染色(Van Gieson染色)結(jié)果，其中，I表示野生型小鼠，2表示陽性轉(zhuǎn)基因小鼠；粉紅的部分a表示膠原纖維(在黑白圖片為黒色線絲狀物)，橙色的部分b表示肌纖維，(在黑白圖片為淺灰色部分)結(jié)果表明，陽性轉(zhuǎn)基因小鼠膀胱尿潴留，膀胱中固有層增厚，逼尿肌排列紊亂，逼尿肌層萎縮，尿道括約肌萎縮。Van Gieson染色顯示膠原增多。(三)基因表達(dá)分析快速解剖獲取轉(zhuǎn)基因小鼠的膀胱于液氮中速凍，-80°C保存，留待提取RNA和蛋白質(zhì)，通過RT-PCR和Western Blot方法做基因表達(dá)檢測，具體方法如下I、RT-PCR :I)總RNA的提取及檢測A迅速從液氮中取出膀胱，剪取50mg左右，剪碎放入勻漿杯中，加入ImlTrizol，用勻漿器勻漿l_2min，將組織勻漿液轉(zhuǎn)入I. 5ml離心管中，室溫放置5min。B加入200 μ I體積比為1:24的異戊醇/氯仿，充分混勻，務(wù)必成乳白色，冰中放置IOmin0
C 4°C,以 12000 轉(zhuǎn) /min 離心 IOmin0D取上清，加入等體積異丙醇(預(yù)冷)混勻。E-20°C放置 Ih 后，4。。，10000 轉(zhuǎn) /min 離心 IOmin0F棄上清，沉淀溶于800 μ I 75%的こ醇，室溫放置lOmin，4°C，10000轉(zhuǎn)/min離心IOmin0G重復(fù)步驟6) —次。H小心棄上清，在恒溫箱中65°C烘干；核酸分析儀測定總RNA的0D26(l/0D28(l，根據(jù)A260值計(jì)算RNA樣品濃度RNA樣品濃度(ng/ μ I) =A260 XDNA稀釋倍數(shù)X 50。
痕量DNA的消化A 向 RNA 水溶液中加入 10 μ I 的 IOxDNase-I 緩沖液，O. 5 μ IRnsin (40-200U/ μ I)，
2.Ομ I DNase-1 (5U/μ I)，4.0 μ 10. 1MDTT，用 DEPC 水調(diào)至 100ml，37°C 保溫 15min。B加入等體積的酚氯仿(I: I)混勻。C 4°C, 12000r/min 離心 lOmin。D取上清，加入1/10體積的3mol/l的NaAc和2. 5倍體積的預(yù)冷的こ醇混勻。E_20°C沉淀 30min 以上，10000r/min, 4°C離心 15min。F沉淀用こ醇淋洗兩次，烘干，溶于無核酸酶水中，存于_70°C備用。G紫外分光光度計(jì)檢測所提RNA的含量。2)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈
A反轉(zhuǎn)錄體系如表I所示表I:反轉(zhuǎn)錄體系
權(quán)利要求
1.他莫昔芬在制備治療男性膀胱出口梗阻及其引起的下尿道綜合征的藥物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的應(yīng)用，其特征在于，所述男性膀胱出ロ梗阻的癥狀是尿頻、尿急、排尿困難、淋滴不盡、排尿時(shí)間延長。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的應(yīng)用，其特征在于，所述膀胱出口梗阻引起的下尿道綜合征的癥狀是尿頻、尿急、尿痛。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任ー項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于，所述膀胱出口梗阻及其引起的下尿道綜合征是由雌/雄激素比例失調(diào)引起的。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-3任ー項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于，所述他莫昔芬為含他莫昔芬的制劑，由他莫昔芬與藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑組成。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述制劑為片劑、膠囊、顆粒劑、丸剤、ロ服液或注射劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的應(yīng)用，其特征在于，所述他莫昔芬的用量為l-50mg/Kg/d。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述他莫昔芬的用量為5-25mg/Kg/d。
全文摘要
本發(fā)明涉及他莫昔芬的新用途，具體是在制備治療男性膀胱出口梗阻及其引起的下尿道綜合征的藥物中的應(yīng)用。該藥物能夠快速有效的治療雄性小鼠膀胱出口梗阻及其引起的下尿道綜合征，更好的切合臨床應(yīng)用，為臨床治療提供理論基礎(chǔ)，為治療膀胱出口梗阻提供了一種新方法。
文檔編號A61P13/10GK102716106SQ20121021197
公開日2012年10月10日 申請日期2012年6月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月20日
發(fā)明者于萬鵬, 李向東 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)