專利名稱：新、支二聯(lián)滅活疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于獸用生物制品技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及新城疫、傳染性支氣管炎二聯(lián)滅活疫苗及其制備方法。
背景技術(shù)：
新城疫病毒(Newcastledisease virus, NDV)又稱亞洲雞瘟病毒、偽雞瘟病毒或禽肺腦炎病毒。在病毒分類學(xué)中的位置屬于副黏病毒科(Paramyxoviridae)、副黏病毒屬(Paramyxovirus)中的一個(gè)種。該病毒主要危害雞、珠雞和火雞，在被侵襲的雞群中迅速傳播，強(qiáng)毒株可使雞群全群毀滅。弱毒株僅引起雞群呼吸道感染和產(chǎn)蛋量下降，但可迅速康復(fù)。人類可因接觸病禽和活毒疫苗而引起結(jié)膜炎或淋巴腺炎，但很快便康復(fù)。新城疫病毒被OIE規(guī)定為A類疫病，是一種急性、高度接觸性傳染病，發(fā)病率和死亡率都在90%以上，1935年梁英、馬聞天等首次證實(shí)我國有該病的流行，現(xiàn)在本病被我國列為I類疫病。 新城疫病毒的所有毒株都能凝集多種禽類和哺乳動(dòng)物的紅細(xì)胞，在病毒的血凝試驗(yàn)中，雞的紅細(xì)胞最為常用。該病毒可在9-12日齡的雞胚絨毛尿囊膜上和尿囊腔中培養(yǎng)。雞傳染性支氣管炎(Avian Infectious Bornchistis, IB)是由雞傳染性支氣管炎病毒(Infectious Bornchistis Virus, IBV)引起的一種急性、接觸性、病毒性傳染病。該病主要侵害雞的呼吸系統(tǒng)、泌尿生殖系統(tǒng)和消化系統(tǒng)等，其感染的主要特征是氣管鑼音、噴嚏和腎臟腫大。此外，該病還可以引起蛋雞產(chǎn)蛋量下降和蛋品質(zhì)下降，但死亡率通常較低，雛雞可由于呼吸道或腎臟的感染而死亡。IBV能在9-11日齡的雞胚中生長。近年來，伴隨著畜禽養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大，生物制品行業(yè)也得到了迅速發(fā)展，尤其是生物技術(shù)的不斷更新使疫苗產(chǎn)品的種類顯著增加，且品種多樣，如多聯(lián)疫苗，多價(jià)疫苗等，而多聯(lián)疫苗的使用，擴(kuò)大了一次接種的防病范圍，提高了接種效率，減少了接種用器材及勞務(wù)費(fèi)用，有利于免疫計(jì)劃的安排?，F(xiàn)有防治新城疫、傳染性支氣管炎兩種病的二聯(lián)疫苗只是兩種單苗的簡(jiǎn)單組合，抗原的配比混亂，相容性不好，存在免疫反應(yīng)的相互干擾現(xiàn)象，并不能達(dá)到預(yù)期的目的；而且生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單，生產(chǎn)技術(shù)粗糙，造成部分產(chǎn)品污染，抗原組合物中部分抗原效價(jià)降低，不能達(dá)到生產(chǎn)規(guī)程要求。并且目前生產(chǎn)的新城疫、傳染性支氣管炎二聯(lián)疫苗中傳染性支氣管炎病毒對(duì)新城疫病毒存在干擾，因此，所生產(chǎn)的二聯(lián)苗均采用不同雞胚培養(yǎng)增殖病毒，然后將收獲感染的尿囊液混合制備而成，這樣就會(huì)費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而且提高了成本。因此，針對(duì)現(xiàn)有的雞新城疫與傳染性支氣管炎二聯(lián)滅活疫苗的生產(chǎn)方法，需要改進(jìn)新城疫、傳染性支氣管炎二聯(lián)滅活疫苗的組分搭配以及生產(chǎn)工藝中的缺陷，使新城疫、傳染性支氣管炎二聯(lián)疫苗的免疫效果達(dá)到了單苗的效果，甚至超過了單苗的免疫效果，切實(shí)達(dá)到了一針防多病的目的。另外，目前，預(yù)防和控制家禽傳染病除生物安全措施外，主要依靠疫苗免疫，特別是通過油乳劑疫苗的免疫。油性佐劑疫苗是已公認(rèn)的可有效強(qiáng)化免疫性的疫苗。油乳劑疫苗的生物安全性高，具有用最小量的抗原，最少的接種次數(shù)，延長免疫刺激時(shí)間，使機(jī)體產(chǎn)生足夠量的抗體的特點(diǎn)，所以乳化品質(zhì)優(yōu)良的油乳劑苗是保證免疫效果的前提。在現(xiàn)有的油乳劑疫苗(簡(jiǎn)稱“油苗”)生產(chǎn)過程中，通常添加2%的硬脂酸鋁來增加其穩(wěn)定性，但其粘度較大引起免疫注射的應(yīng)激反應(yīng)較大，如導(dǎo)致嚴(yán)重接種反應(yīng)、形成無菌性化膿損害和接種部位周圍形成肉芽腫等，可產(chǎn)生外部可見的浮腫、腫脹、硬結(jié)和壞死。而且人們懷疑在接種部位有殘留的可能，這便妨礙了疫苗的使用，這種現(xiàn)象在肉雞免疫中表現(xiàn)得尤為明顯?；谶@個(gè)原因，使用含有礦物油的油性佐劑的疫苗有時(shí)是受到一定限制的。對(duì)于油性佐劑疫苗而言，已知這種疫苗不僅在免疫強(qiáng)化作用方面，而且在疫苗的穩(wěn)定性方面，都在相當(dāng)大的程度上受到乳劑類型、所用油性成分以及所結(jié)合的表面活性劑種類等因素的影響。尤其就滅活疫苗來說，制備出一種具有在較長時(shí)間內(nèi)能誘導(dǎo)產(chǎn)生充分免疫保護(hù)作用，并有著良好再現(xiàn)性的疫苗，是非常困難的。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的主要目的在于提供一種雞新城疫、傳染性支氣管炎二聯(lián)滅活·疫苗的生產(chǎn)方法，步驟包括I)調(diào)整新城疫、傳染性支氣管炎種毒的濃度，以達(dá)到合理搭配；2)將調(diào)整后濃度的新城疫、傳染性支氣管炎種毒按比例混合；3)將混合毒種接種于9-11日齡易感雞胚；4)孵化，收胚液；5)將收獲的胚液進(jìn)行滅活；6)滅活后加入佐劑乳化，即成新城疫、傳染性支氣管炎二聯(lián)滅活疫苗。本發(fā)明的另一目的在于提供一種不含硬脂酸鋁的新城疫、傳染性支氣管炎二聯(lián)油乳劑滅活疫苗。技術(shù)效果本發(fā)明通過大量實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，創(chuàng)造性的發(fā)現(xiàn)新城疫、傳染性支氣管炎兩種病毒共存的最佳濃度比例，克服了傳染性支氣管炎病毒對(duì)新城疫病毒產(chǎn)生干擾的不利影響，從而使兩種病毒能同胚接種培養(yǎng)成為可能。本發(fā)明通過調(diào)整新城疫、傳染性支氣管炎種毒的濃度，以使新城疫、傳染性支氣管炎兩種病毒能夠產(chǎn)生共存，通過同胚接種技術(shù)生產(chǎn)兩種病毒，簡(jiǎn)化生產(chǎn)工藝，節(jié)約了工時(shí)和原材料，并且操作更為簡(jiǎn)便和快速。根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的結(jié)果，本發(fā)明生產(chǎn)的二聯(lián)滅活疫苗在免疫雞群后新城疫和傳染性支氣管炎免疫力同時(shí)產(chǎn)生,無任何干擾,提高了免疫質(zhì)量,并且減少了免疫次數(shù),真正實(shí)現(xiàn)了一針兩防的功效。本發(fā)明的禽用油乳劑疫苗，通過不斷的探索研究，確定了添加了丙二醇、卵磷脂和異甘露醇單油酸脂三種成份，并以合適的比例構(gòu)成，達(dá)到了替代硬脂酸鋁的目的，降低了疫苗粘度更利于吸收，從而減少留存，在接種部位表現(xiàn)出優(yōu)異的局部安全性，并且在較長時(shí)間內(nèi)表現(xiàn)出較強(qiáng)的誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生能力。通過調(diào)整油相和水相的配方及其比例，減少了免疫注射引起的應(yīng)激反應(yīng)，且不影響疫苗的穩(wěn)定性及免疫效果，從而也就提高了疫苗質(zhì)量。這種疫苗即使在低粘度區(qū)域穩(wěn)定性也較高，副反應(yīng)較小，誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生能力以及保持高水平的抗體產(chǎn)生的能力都很強(qiáng)。根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的結(jié)果，本發(fā)明油乳劑疫苗既使不含硬脂酸鋁，它所顯示的免疫作用比含硬脂酸鋁疫苗的作用要好，且與含硬脂酸鋁的油苗相比，本發(fā)明的疫苗有更好的局部吸收能力。此外，本發(fā)明實(shí)施例的結(jié)果也表明，按照本發(fā)明的方法制備的油乳劑疫苗同樣具有高穩(wěn)定性，在長時(shí)間內(nèi)顯示出極好的功效，同時(shí)粘度更低，易于注射，注射引起的應(yīng)激反應(yīng)更小，對(duì)動(dòng)物體更安全，而且不會(huì)產(chǎn)生常規(guī)油佐劑疫苗所引起的較大應(yīng)激反應(yīng)，如常見的免疫注射部位浮腫、腫脹、硬結(jié)和壞死等問題都得以解決。另一方面，由于疫苗黏度降低，在接種家禽后，更容易吸收，不會(huì)產(chǎn)生藥物殘留的情況，符合食品安全的要求，有利于禽類產(chǎn)品的出口。
具體實(shí)施例方式為使本發(fā)明更加容易理解，下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍，下列實(shí)施例中未提及的具體實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行。本發(fā)明實(shí)施例中，除另有說明外，所有份數(shù)和百分比均按體積計(jì)算。實(shí)施例I本發(fā)明制備的新、支二聯(lián)滅活疫苗制造本品用新城疫毒種LaSota株，效檢用強(qiáng)毒優(yōu)選是雞新城疫病毒強(qiáng)毒北京株(CVCC AV1611)。制苗及效檢用傳染性支氣管炎毒株為M41株。將新城疫毒種LaSota株毒種稀釋成IO4EID5tl,傳染性支氣管炎毒株M41株稀釋成IO6EID5tl，稀釋后將兩種病毒液以1:1的比例混合。將混合后毒種接種9-11日齡易感雞胚，每胚接種尿囊腔0. Iml,用蠟封接種孔和氣孔，37°C孵化，棄去72h前死亡胚，收集72_96h死亡胚和96h活胚胚液。將胚液經(jīng)0. 1%甲醛37°C滅活20小時(shí)，以10:1的比例加入經(jīng)3倍體積水稀釋121°C滅菌30min的吐溫-80混合均勻?yàn)樗?。將白油、丙二醇、卵磷脂和異甘露醇單油酸脂?0 :1:1:1的比例混合均勻?yàn)樽魟倥c司盤-80以10:1的比例混勻?yàn)橛拖?，?jīng)121°C高壓滅菌30min，冷卻至室溫備用。按油相水相=2 I的體積比例，先將油相倒入乳化罐，攪拌轉(zhuǎn)速為11，OOOrpm,溫度18°C的情況下,水相加入油相的速度為0. 6ml/s,再繼續(xù)以速度15，500rpm乳化5min，制備三批疫苗，批號(hào)分別為1201、1202和1203。實(shí)施例2常規(guī)異胚接種生產(chǎn)的含硬脂酸鋁的新、支二聯(lián)滅活疫苗制造本品用新城疫毒種LaSota株，效檢用強(qiáng)毒優(yōu)選是雞新城疫病毒強(qiáng)毒北京株(CVCC AV1611)。制苗及效檢用傳染性支氣管炎毒株為M41株。2.將新城疫毒種LaSota株毒種，傳染性支氣管炎毒株M41株，分別接種9-11日齡易感雞胚，每胚接種尿囊腔0. Iml,用蠟封接種孔和氣孔，37°C孵化，棄去72h前死亡胚，收集72-96h死亡胚和96h活胚胚液。3.將收獲的胚液分別經(jīng)0. 1%甲醛37°C滅活20小時(shí)，后以3:2的比例將新城疫和傳染性支氣管炎病毒液混合。取96份混合后的抗原液，加入滅菌的吐溫-804份，充分搖勻制備水相。油相制備取94份白油，加硬脂酸鋁2份，再加司本-804份，混合后高壓滅菌備用。乳化按油相水相=7 3的體積比例，先將油相倒入乳化罐，攪拌轉(zhuǎn)速為11，OOOrpm，溫度18°C的情況下,水相加入油相的速度為0. 6ml/s,再繼續(xù)以速度15，500rpm乳化5min,制備三批疫苗，批號(hào)分貝為1211、1212、1213。實(shí)施例3兩種方法生產(chǎn)的新、支二聯(lián)滅活疫苗性狀比較
I.外觀兩者均為乳白色均勻乳劑。2.劑型兩者均呈油包水型。在潔凈的水面上，滴一滴油乳劑，觀察其形態(tài)、是否分散、分散開的時(shí)間。結(jié)果顯示兩者形狀均為規(guī)則圓形、不擴(kuò)散。3.粘度用Iml吸管(上口內(nèi)徑2. 7mm，下口內(nèi)徑I. 2mm)，吸取25°C左右的疫苗Iml,令其垂直自然流出，記錄流出0. 4ml所需要的時(shí)間。結(jié)果顯示兩者3次流出時(shí)間均在5s內(nèi)，符合規(guī)程要求，以本發(fā)明方法制備的疫苗黏度更低，均在3s內(nèi)。4.穩(wěn)定性(I)取IOml疫苗置于離心管中以3000r/min離心15min，管底析出的水相^ 0. 5ml。(2)取疫苗在37°C左右放置21d，結(jié)果顯示不分層，沒有破乳現(xiàn)象。5.安全性檢驗(yàn) 用14日齡SPF(無特定病原體)雞，每種疫苗免疫10只雞，每只腿部肌肉注射疫苗1ml，空白對(duì)照10只。每天觀察免疫雞只，接種后14天剖檢雞只，觀察局部及全身反應(yīng)，觀察局部疫苗吸收情況。兩種方法制備的疫苗檢測(cè)性狀對(duì)比見表I。表I兩種疫苗檢測(cè)性狀對(duì)比
疫苗類型批號(hào)黏度-- 安全性檢驗(yàn)
_離心實(shí)驗(yàn)37°C放置2M_
本發(fā)明方法 120〗 2.9s 良好良好無不良反應(yīng)制備疫苗 1202 2.8s 良好良好無不良反應(yīng)
12032.5s良好良好無不良反應(yīng)
常規(guī)方法添丨2丨14.6s良好良好局部吸收不完全
加岐脂酸鋁 12124.5s良好良好局部吸收不完全
制備多更苗 12134.3s良好良好局調(diào)>及4欠不冗全實(shí)施例4兩種方法生產(chǎn)的新、支二聯(lián)滅活疫苗效力及攻毒對(duì)比試驗(yàn)試驗(yàn)雞共分7組，即1201、1202、1203、1211、1212、1213、非免疫對(duì)照組，每組各30只雞。免疫劑量為試驗(yàn)組每只雛雞頸背皮下注射0. 5ml，免疫前和免疫后每周采集血清測(cè)定抗體，第4周以后每2周采血一次，試驗(yàn)期為16周。免疫后第4周本發(fā)明二聯(lián)苗組各抽16只，非免疫對(duì)照組抽8只，分別進(jìn)行新城疫、傳染性支氣管炎強(qiáng)毒攻擊保護(hù)試驗(yàn)，攻毒劑量為新城疫IO5ELD5tl肌注lml，傳染性支氣管炎M41 (10倍稀釋)滴鼻2滴。攻毒后觀察死亡、發(fā)病雞剖檢病理變化，計(jì)算其保護(hù)率。本發(fā)明二聯(lián)苗免疫3周后抗體明顯上升，其新城疫HI抗體效價(jià)達(dá)6. 0-7. 01og2。常規(guī)異胚接種二聯(lián)苗新城疫HI抗體水平明顯低于本發(fā)明二聯(lián)苗，試驗(yàn)期內(nèi)抗體水平一直在41og2以下。本發(fā)明二聯(lián)苗免疫后4周攻毒保護(hù)率為8/8，非免疫對(duì)照組4/4死亡。本發(fā)明二聯(lián)苗試驗(yàn)雞在免疫后3周VN抗體可達(dá)1:8，與常規(guī)異胚接種二聯(lián)苗差異不明顯，免疫后4周攻毒，本發(fā)明三批二聯(lián)苗保護(hù)率為8/8，非免疫對(duì)照組4/4死亡。表2 二聯(lián)苗免疫后ND血凝抑制抗體(HI)抗體消長
權(quán)利要求
1.一種新城疫、傳染性支氣管炎二聯(lián)油乳劑滅活疫苗，其特征在于由I體積的水相與2體積的油相構(gòu)成，其中水相由能夠誘導(dǎo)宿主免疫應(yīng)答的疫苗抗原、親水性非離子型表面活性劑和水構(gòu)成，油相由礦物油、卵磷脂、丙二醇、異甘露醇單油酸脂和親油性非離子型表面活性劑構(gòu)成。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述油乳劑滅活疫苗，其特征在于，所述疫苗抗原為通過同胚接種而得到的新城疫、傳染性支氣管炎兩種抗原混合物。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述油乳劑滅活疫苗，其特征在于，所述親水性非離子型表面活性劑為吐溫-80。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述油乳劑滅活疫苗，其特征在于，所述親油性非離子型表面活性劑為司盤-80。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述油乳劑滅活疫苗，其特征在于，所述礦物油為白油佐劑。
6.—種如權(quán)利要求I、任意一項(xiàng)的油乳劑滅活疫苗的制備方法，其特征在于，包括以下步驟 1)調(diào)整新城疫、傳染性支氣管炎種毒的濃度，以達(dá)到合理搭配； 2)將調(diào)整后濃度的新城疫、傳染性支氣管炎種毒按比例混合； 3)將混合毒種接種于9-11日齡易感雞胚； 4)孵化，收胚液； 5)將收獲的胚液進(jìn)行滅活； 6)滅活后加入佐劑乳化，即成新城疫、傳染性支氣管炎二聯(lián)滅活疫苗。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述油乳劑滅活疫苗，其特征在于，步驟I)中新城疫種毒的稀釋濃度為IO4EID5tl，傳染性支氣管炎種毒的稀釋濃度為IO6EID5tlt5
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述油乳劑滅活疫苗，其特征在于，步驟2)中新城疫、傳染性支氣管炎種毒的混合比例為1:1。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種二聯(lián)油乳劑疫苗的生產(chǎn)方法，具體地說，是雞新城疫、傳染性支氣管炎二聯(lián)滅活疫苗的生產(chǎn)方法，包括同胚接種，調(diào)整新城疫、傳染性支氣管炎兩種病毒的濃度及比例，以達(dá)到合理搭配，并且通過調(diào)整疫苗中佐劑的成分，使其不含有硬脂酸鋁。該疫苗能使新城疫及傳染性支氣管炎抗體同時(shí)產(chǎn)生，減少干擾現(xiàn)象，不含硬脂酸鋁，能在較長時(shí)間內(nèi)保持較高的抗體產(chǎn)生能力，并解決注射疫苗引起的動(dòng)物的應(yīng)激反應(yīng)以及疫苗殘留問題。
文檔編號(hào)A61P31/14GK102716478SQ201210212838
公開日2012年10月10日 申請(qǐng)日期2012年6月26日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月26日
發(fā)明者喬榮岑, 孫進(jìn)忠, 張?jiān)S科 申請(qǐng)人:普萊柯生物工程股份有限公司