專利名稱:陽(yáng)離子大分子蛋白脂質(zhì)基因藥物載體、制備方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及改性大分子聚合物及蛋白構(gòu)建的藥物和基因載體、制備方法及應(yīng)用,進(jìn)一步的說(shuō)是一種轉(zhuǎn)鐵蛋白修飾的陽(yáng)離子高分子脂質(zhì)基因載體、制備方法及應(yīng)用,屬于功能化脂質(zhì)體的制備及應(yīng)用技術(shù)。
背景技術(shù):
近年來(lái),基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)等領(lǐng)域取得了大量的進(jìn)展,獲得了很多有望用于腫瘤基因治療的抑瘤基因、micr0RNA、siRNA等。但是由于缺乏安全、高效的基因治療載體,這些基因還難以用于腫瘤的臨床基因治療。因此,基因載體是腫瘤基因治療成功的關(guān)鍵;而構(gòu)建一個(gè)高效、安全的基因治療載體仍然是目前亟需解決的問(wèn)題。理想的腫瘤基因載體應(yīng)具備以下特征(I)腫瘤靶向性,且不易被免疫系統(tǒng)識(shí)別;
(2)聞度穩(wěn)定,容易制備;(3)無(wú)毒;(4)基因轉(zhuǎn)染效率聞;(5)基因表達(dá)穩(wěn)定并具有腫瘤選擇性。非病毒性載體具有毒性低、免疫原性低、易靶向改造和制備等優(yōu)點(diǎn),因此有望成為腫瘤臨床基因治療載體的選擇。但是,非病毒載體也存在轉(zhuǎn)染效率低、生物相容性差、體內(nèi)腫瘤靶向性差等問(wèn)題,因此仍需進(jìn)一步改進(jìn)。目前所研究的非病毒載體主要包括陽(yáng)離子聚合物(PEI、殼聚糖、PLL等)、脂質(zhì)材料、聚合物嵌段共聚物和膠束等;常用的陽(yáng)離子聚合物作為轉(zhuǎn)基因的載體有其優(yōu)越性,然而存在轉(zhuǎn)染效率低、穩(wěn)定性差、部分材料毒性大及制備工藝復(fù)雜等問(wèn)題。脂質(zhì)材料中的陽(yáng)離子脂質(zhì)體(CL)因具有優(yōu)良的特性(無(wú)免疫原性、制備簡(jiǎn)單、使用方便、轉(zhuǎn)染效率高等)在科研及臨床實(shí)驗(yàn)中被廣泛應(yīng)用,其通常由一個(gè)陽(yáng)離子、兩個(gè)親化合物和一個(gè)中性脂質(zhì)組成;但陽(yáng)離子脂質(zhì)體也存在制備不穩(wěn)定性、細(xì)胞毒性大、體內(nèi)轉(zhuǎn)染效率差等突出問(wèn)題。為解決這些問(wèn)題,可將陽(yáng)離子脂質(zhì)體技術(shù)與陽(yáng)離子聚合物技術(shù)相結(jié)合,將二者的優(yōu)勢(shì)互補(bǔ),開發(fā)新型的陽(yáng)離子高分子脂質(zhì)體(CPL)系統(tǒng);CPL技術(shù)主要采用陽(yáng)離子聚合物來(lái)制備具有雙層膜結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)體納米粒;與CL和陽(yáng)離子聚合物相比,CPL具有更高的理化穩(wěn)定性,易于靶向組裝改造,設(shè)計(jì)靈活,且適合體內(nèi)基因遞送。本發(fā)明為CPL系統(tǒng)的進(jìn)一步延伸和發(fā)展。常津,梁曉飛等人報(bào)道的殼聚糖長(zhǎng)鏈烷基季銨鹽及陽(yáng)離子高分子脂質(zhì)體為本發(fā)明提供了相關(guān)研究基礎(chǔ)(一類雙親性殼聚糖長(zhǎng)鏈烷基季銨鹽及其制備方法,申請(qǐng)?zhí)?00710056993. 4 ;一種高分子脂質(zhì)體及其應(yīng)用,專利申請(qǐng)?zhí)?00810052465)。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種陽(yáng)離子大分子蛋白脂質(zhì)基因藥物載體,主要為構(gòu)建一種制備簡(jiǎn)單、成本低廉、安全性好、轉(zhuǎn)染效率高、腫瘤靶向性強(qiáng)的非病毒基因載體系統(tǒng)。本發(fā)明的目的還是提供一種上述陽(yáng)離子大分子蛋白脂質(zhì)基因藥物載體制備方法。本發(fā)明另一目的是提供一種上述陽(yáng)離子大分子蛋白脂質(zhì)基因藥物載體的應(yīng)用。本發(fā)明采用具有雙親性特性的轉(zhuǎn)鐵蛋白陽(yáng)性大分子物質(zhì)來(lái)代替普通陽(yáng)離子脂質(zhì)體中的陽(yáng)性成分,再與普通陽(yáng)離子脂質(zhì)體的脂質(zhì)成分組合來(lái)制備轉(zhuǎn)鐵蛋白大分子陽(yáng)離子脂質(zhì)基因載體,該轉(zhuǎn)鐵蛋白大分子陽(yáng)離子脂質(zhì)基因載體具有與普通脂質(zhì)體相類似的雙層膜結(jié)、構(gòu),可包載藥物、結(jié)合基因,并介導(dǎo)DNA/siRNA的轉(zhuǎn)染,可轉(zhuǎn)染的細(xì)胞種類多,轉(zhuǎn)染效率高,腫瘤靶向性強(qiáng),可在含血清的培養(yǎng)液中使用,制備和操作簡(jiǎn)單。本發(fā)明所述的陽(yáng)離子大分子蛋白脂質(zhì)基因藥物載體,其關(guān)鍵特征在于使用轉(zhuǎn)鐵蛋白陽(yáng)性大分子物質(zhì)來(lái)代替普通陽(yáng)離子脂質(zhì)體中所含有的陽(yáng)性成分,因此可以稱之為陽(yáng)離子大分子蛋白脂質(zhì)體。陽(yáng)離子大分子蛋白脂質(zhì)體是將陽(yáng)離子脂質(zhì)體技術(shù)、蛋白大分子技術(shù)和納米膠束技術(shù)相結(jié)合所開發(fā)的一種與陽(yáng)離子脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)相同的納米基因載體系統(tǒng),其具有更優(yōu)良的特性,并有脂質(zhì)體和高分子膠束的優(yōu)點(diǎn),可將二者的優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)。本發(fā)明的陽(yáng)離子大分子蛋白脂質(zhì)體不僅具備小分子脂質(zhì)體的優(yōu)點(diǎn),且制備方法簡(jiǎn)單,穩(wěn)定性好,藥物滲漏少,同時(shí)含有氨基和羧基等官能團(tuán),易進(jìn)行多功能化組裝。本發(fā)明中的陽(yáng)離子大分子蛋白脂質(zhì)基因藥物載體由轉(zhuǎn)鐵蛋白-長(zhǎng)鏈烷基季銨鹽和脂質(zhì)成分組成,其中,轉(zhuǎn)鐵蛋白-長(zhǎng)鏈烷基季銨鹽與脂質(zhì)成分的質(zhì)量比為O. 05^20:1,轉(zhuǎn)鐵蛋白和長(zhǎng)鏈烷基季銨鹽的質(zhì)量比O. Ofl :1、優(yōu)先選擇的轉(zhuǎn)鐵蛋白-長(zhǎng)鏈烷基季銨鹽 與脂質(zhì)成分的質(zhì)量比為廣8 :1。轉(zhuǎn)鐵蛋白-長(zhǎng)鏈烷基季銨鹽作為主膜材構(gòu)成陽(yáng)離子大分子蛋白脂質(zhì)體的主體,所述的基因載體為具有類似脂質(zhì)體雙層膜結(jié)構(gòu)的納米粒,粒徑在I lOOOOOnm,優(yōu)選 l(T500nm。本發(fā)明中所述的陽(yáng)離子大分子蛋白脂質(zhì)基因藥物載體中,所述的轉(zhuǎn)鐵蛋白-長(zhǎng)鏈烷基季銨鹽是可溶于極性有機(jī)溶劑(氯仿、二氯甲烷、乙醇等)和水,轉(zhuǎn)鐵蛋白-長(zhǎng)鏈烷基季銨鹽在極性有機(jī)溶劑或水溶液中的溶解度均大于0. lmg/mL,轉(zhuǎn)鐵蛋白-長(zhǎng)鏈烷基季銨鹽的蛋白分子量在100(Tl000000之間,優(yōu)選為200(Γ200000,轉(zhuǎn)鐵蛋白-長(zhǎng)鏈烷基季銨鹽的分子結(jié)構(gòu)中可以含有氨基、羧基、羥基等官能團(tuán),具體為轉(zhuǎn)鐵蛋白-長(zhǎng)鏈烷基季銨鹽;其中的轉(zhuǎn)鐵蛋白可用牛血清白蛋白、Protein A、Protein G、甲胎蛋白、表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)的抗體、英夫利西單抗、人纖維蛋白單鏈抗體、癌胚抗原、組織多肽抗原、淀粉酶、乳酸脫氫酶、核糖核酸酶、5-核苷酸酶、促腎上腺皮質(zhì)激素、抗利尿激素、生長(zhǎng)激素、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子、雌激素、孕激素代替。本發(fā)明中所述的陽(yáng)離子大分子蛋白脂質(zhì)基因藥物載體中,其中構(gòu)成轉(zhuǎn)鐵蛋白-長(zhǎng)鏈烷基季銨鹽的長(zhǎng)鏈烷基季銨鹽為十二烷基三甲基溴化銨、十四烷基三甲基溴化銨、十六烷基三甲基溴化銨、二甲基雙十八烷基溴化銨、I,2- 二油酰-3- 二甲基-羥乙基溴化銨、I,2- 二油酰氧丙基-3- 二甲基-羥乙基溴化銨、I,2- 二油酰氧丙基-3- 二甲基-羥丙基溴化銨、I,2- 二油酰氧丙基-3- 二甲基-羥丁基溴化銨、I,2- 二油酰氧丙基-3- 二甲基-羥戊基溴化銨、I,2- 二掠櫚酸氧丙基-3- 二甲基_輕乙基溴化銨、I,2- 二硬脂酸氧丙基-3- 二甲基-羥乙基溴化銨、1,2_ 二肉豆蘧酰氧丙基-3- 二甲基-羥乙基溴化銨及其上述季銨鹽相應(yīng)的氯化物;或者是含環(huán)氧基團(tuán)的長(zhǎng)鏈烷基季銨鹽二甲基十八烷基環(huán)氧丙基氯化銨、二甲基十六烷基環(huán)氧丙基氯化銨、二甲基十四烷基環(huán)氧丙基氯化銨、二甲基十二烷基環(huán)氧丙基氯化銨及其上述季銨鹽相應(yīng)的溴化物。本發(fā)明中所述的陽(yáng)離子大分子蛋白脂質(zhì)基因藥物載體的制備方法為脂質(zhì)體的通用制備方法包括薄膜分散法、逆向蒸發(fā)法、復(fù)乳法、離心法、PH梯度法、注入法和混溶法等,其中可優(yōu)選為薄膜分散法和逆向蒸發(fā)法;薄膜分散法的基本步驟為將轉(zhuǎn)鐵蛋白-長(zhǎng)鏈烷基季銨鹽和脂質(zhì)成分共溶于極性有機(jī)溶劑中,所述的轉(zhuǎn)鐵蛋白-長(zhǎng)鏈烷基季銨鹽和脂質(zhì)成分的質(zhì)量比為0. 05^20 :1,所述的極性有機(jī)溶劑指二氯甲烷、氯仿、丙酮;混勻作為有機(jī)相,除去有機(jī)溶劑使成薄膜,然后加入水相使脂質(zhì)膜水化,水相為O. 9%的生理鹽水或pH=5、的緩沖溶液;逆向蒸發(fā)法的基本步驟為將轉(zhuǎn)鐵蛋白-長(zhǎng)鏈烷基季銨鹽和脂質(zhì)成分共溶于極性有機(jī)溶劑中,所述的轉(zhuǎn)鐵蛋白-長(zhǎng)鏈烷基季銨鹽和脂質(zhì)成分的質(zhì)量比為O. 05^20 :1,所述的極性有機(jī)溶劑指二氯甲烷、 氯仿、丙酮;混勻作為有機(jī)相;水相為O. 9%的生理鹽水或pH=6 9的緩沖溶液;將水相與有機(jī)相混合,水相和有機(jī)相的體積比為I :6飛1,超聲乳化后,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑;透析法的基本步驟為將轉(zhuǎn)鐵蛋白-長(zhǎng)鏈烷基季銨鹽和脂質(zhì)成分共溶于極性有機(jī)溶劑中,所述的轉(zhuǎn)鐵蛋白-長(zhǎng)鏈烷基季銨鹽和脂質(zhì)成分的質(zhì)量比為O. 05^20 :1,所述的極性有機(jī)溶劑指二氯甲烷、氯仿、丙酮;,混勻作為極性有機(jī)相;將極性有機(jī)相放入透析袋中在水相溶液中透析1飛00小時(shí),水相溶液為O. 9%的生理鹽水或pH=6、的緩沖溶液;本發(fā)明中所述的脂質(zhì)成分為構(gòu)成普通脂質(zhì)體和陽(yáng)離子脂質(zhì)體的基本成分,具體為膽固醇、二油酰脂酰乙醇胺(DOPE)、3i3- [N-(N’,N’_ 二甲基胺乙基)胺基甲?;鵠膽固醇(DC-Chol)、卵磷脂、二硬脂酰磷脂酰膽堿、棕櫚酰油酰磷脂酰膽堿、二油酰磷脂酰乙醇胺、二棕櫚酰油酰磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺或棕櫚酰油酰磷脂酰乙醇胺中的一種或多種,如2-3種的脂質(zhì)成分,優(yōu)選為膽固醇、DOPE和DC-Chol。本發(fā)明所述的陽(yáng)離子大分子蛋白脂質(zhì)基因藥物載體可以用于制備基因藥物。所述的基因藥物可為有機(jī)藥物、水溶性藥物、水不溶性藥物、基因DNA/siRNA、探針和診斷試劑,如抑癌基因(如乙酰膽堿酯酶基因)、RB基因和p53基因、紫杉醇、消炎痛、抗葉酸類(如甲氨蝶呤)、抗嘌呤類(如巰嘌呤)、抗嘧啶類(如氟尿嘧啶、替加氟)、核苷酸還原酶抑制藥(如羥基脲)、脫氧核糖核苷酸多聚酶抑制藥(如環(huán)胞苷)、直接影響和破壞DNA結(jié)構(gòu)及其功能的藥物(如氮芥、環(huán)磷酰胺、氮甲、順鉬、絲裂霉素、喜樹堿)、抑制蛋白質(zhì)合成的藥(如阿霉素、柔紅霉素、光輝霉素)、影響微管蛋白質(zhì)組裝和紡錘絲形成的藥物(長(zhǎng)春堿、依托泊苷)。本發(fā)明所述的陽(yáng)離子大分子蛋白脂質(zhì)基因藥物載體可通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)鐵蛋白陽(yáng)離子脂質(zhì)基因載體進(jìn)行修飾或組裝而增加納米粒的使用功能,所用的修飾制劑包括抗體配體(腫瘤相關(guān)抗原標(biāo)志物)、蛋白和酶(酶類標(biāo)志物)、轉(zhuǎn)鐵蛋白、激素、肽類、聚乙二醇(PEG)、基因和小分子制劑等;優(yōu)選為甲胎蛋白、癌胚抗原、組織多肽抗原、淀粉酶、乳酸脫氫酶、核糖核酸酶、5-核苷酸酶、促腎上腺皮質(zhì)激素、抗利尿激素、生長(zhǎng)激素、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子、雌激素、孕激素、兒茶酚胺類及其衍生物、ras基因家族及其表達(dá)產(chǎn)物、myc基因家族及其表達(dá)產(chǎn)物、表皮生長(zhǎng)因子受體、葉酸、三苯氧胺、磁性顆粒。使用以上物質(zhì)對(duì)基因載體進(jìn)行改性時(shí)所使用的方法包括直接對(duì)基因載體納米粒的表面修飾或先制備含活性成分的前體物質(zhì)再進(jìn)行組裝等方法。其中PEG修飾的陽(yáng)離子大分子蛋白脂質(zhì)基因藥物載體具有體內(nèi)長(zhǎng)循環(huán)功能和被動(dòng)靶向功能,其制備方法優(yōu)選為a:制備前體物質(zhì)PEG修飾的大分子季銨鹽即轉(zhuǎn)鐵蛋白-長(zhǎng)鏈烷基季銨鹽的制備方法將轉(zhuǎn)鐵蛋白溶解到去離子水和醇的混合溶液中;再將長(zhǎng)鏈烷基季銨鹽緩慢的加入到體系中,其中去離子水和醇的質(zhì)量比為I :(Γ3 ;體系中轉(zhuǎn)鐵蛋白和長(zhǎng)鏈烷基季銨鹽的質(zhì)量比為I :0. OflOO ;所述的醇為甲醇、乙醇、或異丙醇;在室溫下攪拌24小時(shí)后將反應(yīng)液透析1飛00小時(shí),最后凍干,得轉(zhuǎn)鐵蛋白-長(zhǎng)鏈烷基季銨鹽的白色粉末;b:將大分子季銨鹽(質(zhì)量濃度1°/Tl00%)和脂質(zhì)成分(質(zhì)量濃度0. 1%"60%)溶于氯仿中,將PEG修飾的大分子季銨鹽(質(zhì)量濃度0. 19^39%)溶于水相,然后使用薄膜分散法或逆向蒸發(fā)法制備PEG修飾的大分子蛋白季銨鹽陽(yáng)離子脂質(zhì)納米粒。其中EGFR抗體修飾的陽(yáng)離子大分子蛋白脂質(zhì)納米粒對(duì)EGFR受體高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞具有靶向性,如腫瘤細(xì)胞SMMC-7721和MCF-7等;EGFR抗體修飾的高分子季銨鹽陽(yáng)離子脂質(zhì)納米粒的制備方法優(yōu)選為可先制備在水相當(dāng)中濃度為0. r5mg/mL的高分子季銨鹽陽(yáng)離子脂質(zhì)基因載體納米粒,然后使用偶聯(lián)劑將EGFR抗體偶聯(lián)到高分子季銨鹽陽(yáng)離子脂質(zhì)基因載體的表面既得EGFR抗體修飾的高分子季銨鹽陽(yáng)離子脂質(zhì)基因載體,其中高分子季銨鹽、脂質(zhì)成分和EGFR抗體的質(zhì)量組成依次為1% 100%,0. 1% 60%,0. 1% 39%。
本發(fā)明所述的陽(yáng)離子大分子蛋白脂質(zhì)基因藥物載體的用途,包括對(duì)藥物和基因的遞送、緩控釋、逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的耐藥特性及對(duì)疾病的診斷和治療;陽(yáng)離子大分子蛋白脂質(zhì)基因藥物載體作為基因轉(zhuǎn)染的非病毒載體時(shí),與商用陽(yáng)離子脂質(zhì)體Lipofectamine 2000相t匕,具有更低的細(xì)胞毒性和更高的基因轉(zhuǎn)染效率。本發(fā)明所述的陽(yáng)離子大分子蛋白脂質(zhì)基因藥物載體納米粒,采用與陽(yáng)離子脂質(zhì)體具有更大相似性的陽(yáng)離子蛋白脂質(zhì)基因載體來(lái)構(gòu)建功能化的、安全性好、效率高的納米基因載體系統(tǒng),并充分利用大分子脂質(zhì)體所具有的優(yōu)點(diǎn)以克服陽(yáng)離子脂質(zhì)體的缺點(diǎn)。本發(fā)明所述的陽(yáng)離子大分子蛋白脂質(zhì)基因藥物載體系統(tǒng)具有以下特點(diǎn)(I)將功能強(qiáng)大的陽(yáng)離子大分子蛋白脂質(zhì)用做基因載體。(2)陽(yáng)離子大分子蛋白脂質(zhì)體具有靈活多樣、基因轉(zhuǎn)染效率高、毒性低、制備方法簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)。(3)將陽(yáng)離子大分子蛋白脂質(zhì)體進(jìn)行靶向性設(shè)計(jì)可得到專一性好的基因載體系統(tǒng)。為提高載體系統(tǒng)針對(duì)特定腫瘤的基因遞送效率,即專一性,則可充分利用陽(yáng)離子大分子蛋白脂質(zhì)體相對(duì)陽(yáng)離子脂質(zhì)體所具有的功能化修飾容易的優(yōu)點(diǎn)。利用腫瘤細(xì)胞表面的特異性受體配體結(jié)合原理,可選擇對(duì)肝癌具有較好靶向功能的葉酸或EGFR抗體對(duì)陽(yáng)離子大分子蛋白脂質(zhì)體進(jìn)行修飾來(lái)增強(qiáng)其針對(duì)肝癌的基因轉(zhuǎn)染效果,同時(shí)也采用多靶點(diǎn)聯(lián)用的方法來(lái)提高載體的專一性。
圖I為轉(zhuǎn)鐵蛋白-十六烷基季銨鹽的核磁(1H-NMR)圖譜;由圖可見轉(zhuǎn)鐵蛋白和十六烷基季銨鹽的特征吸收峰均存在,說(shuō)明轉(zhuǎn)鐵蛋白-十六烷基季銨鹽的成功制備。圖2為使用逆向蒸發(fā)法所制備的陽(yáng)離子大分子轉(zhuǎn)鐵蛋白脂質(zhì)體的原子力顯微鏡照片;由圖可見陽(yáng)離子大分子轉(zhuǎn)鐵蛋白脂質(zhì)體的粒徑較小,且分布均勻。圖3是轉(zhuǎn)鐵蛋白-十六烷基季銨鹽和陽(yáng)離子大分子蛋白脂質(zhì)體的SDS-PAGE電泳;其中從右到左依次為I =Marker ;2 :陽(yáng)離子大分子轉(zhuǎn)鐵蛋白脂質(zhì)體(薄膜法);3 :陽(yáng)離子大分子轉(zhuǎn)鐵蛋白脂質(zhì)體(反向法);4 :陽(yáng)離子大分子轉(zhuǎn)鐵蛋白脂質(zhì)體(反向法,Tf-HQ量為3的2倍);5 :轉(zhuǎn)鐵蛋白-十六烷基季銨鹽;6 :轉(zhuǎn)鐵蛋白;由圖可見陽(yáng)離子大分子轉(zhuǎn)鐵蛋白脂質(zhì)體表面所存在的轉(zhuǎn)鐵蛋白和十六烷基季銨鹽改性后的轉(zhuǎn)鐵蛋白均可用SDS-PAGE電泳跑出,說(shuō)明轉(zhuǎn)鐵蛋白存在于大分子蛋白脂質(zhì)體的表面。圖4是使用熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)陽(yáng)離子大分子轉(zhuǎn)鐵蛋白脂質(zhì)體的體內(nèi)(荷瘤裸鼠,肝癌SMMC-7721細(xì)胞)基因遞送能力。
由圖可見,陽(yáng)離子大分子轉(zhuǎn)鐵蛋白脂質(zhì)體(Tf-CPL)對(duì)荷肝癌裸鼠的體內(nèi)基因遞送能力高于陽(yáng)離子高分子脂質(zhì)體(CPL),且腫瘤內(nèi)的基因表達(dá)水平明顯高于CPL。圖4中Tf_CPL :陽(yáng)離子大分子轉(zhuǎn)鐵蛋白脂質(zhì)體;CPL :陽(yáng)離子高分子脂質(zhì)體;RLU 相關(guān)光數(shù) Relative light unit ;DNA:脫氧核糖核酸 Deoxyribonucleic acid ;Heart:心臟,Liver:肝臟,Spleen:脾臟,Lung:肺,kidney:腎臟,Tumor:腫瘤。
具體實(shí)施例方式下面的實(shí)施例中將對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的闡述,但本發(fā)明不限于此。實(shí)施例中,DOPE :二油酰脂酰乙醇胺;DC_Chol :3 P - [N_(N’,N’ - 二甲基胺乙基)胺基甲?;鵠膽固醇;TQCMC :十四烷基羧甲基殼聚糖季銨鹽。實(shí)施例I :本實(shí)施例探討轉(zhuǎn)鐵蛋白-長(zhǎng)鏈烷基季銨鹽的制備方法將轉(zhuǎn)鐵蛋白(Tf) IOmg溶解到去離子水和異丙醇的混合溶液IOml (水和異丙醇的體積比為1:1)中;再將二甲基十六烷基環(huán)氧丙基氯化銨IOOmg緩慢的加入到該體系中;室溫下攪拌24小時(shí)后將反應(yīng)液用去離子水透析3天,凍干,得轉(zhuǎn)鐵蛋白-十六烷基季銨鹽(Tf-HQ)的白色粉末12. Omg。其中二甲基十六烷基環(huán)氧丙基氯化銨可用其他長(zhǎng)鏈烷基季銨鹽代替,其它的長(zhǎng)鏈烷基季銨鹽成分包括二甲基十八烷基環(huán)氧丙基氯化銨、二甲基二十二烷基環(huán)氧丙基氯化銨、二甲基十四烷基環(huán)氧丙基氯化銨、二甲基十二烷基環(huán)氧丙基氯化銨。實(shí)施例2 本實(shí)施例探討采用逆向蒸發(fā)法時(shí)轉(zhuǎn)鐵蛋白-十六烷基季銨鹽(Tf-HQ)、十四烷基羧甲基殼聚糖季銨鹽(TQCMC)和膽固醇的不同配比對(duì)陽(yáng)離子大分子轉(zhuǎn)鐵蛋白脂質(zhì)體粒徑產(chǎn)生的影響。將不同配比的Tf-HQ (蛋白分子量為79,000)、TQCMC和膽固醇共溶于二氯甲烷中,混勻得溶液I ;準(zhǔn)備去離子水溶液II,其中溶液I和溶液II的比例為I :2 ;將兩種溶液混合后,充分超聲乳化,在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減壓蒸餾除盡二氯甲烷得轉(zhuǎn)鐵蛋白脂質(zhì)體溶液。由表2可見,調(diào)整Tf-HQ和膽固醇的質(zhì)量配比可以得到不同粒徑大小的轉(zhuǎn)鐵蛋白脂質(zhì)體,所得的陽(yáng)離子轉(zhuǎn)鐵蛋白脂質(zhì)體在水溶液中的粒徑大小分布也都比較均勻。其中圖2為Tf-HQ/膽固醇陽(yáng)離子轉(zhuǎn)鐵蛋白脂質(zhì)體的原子力顯微鏡照片。表 權(quán)利要求
1.一種陽(yáng)離子大分子蛋白脂質(zhì)基因藥物載體,其特征在于所述的陽(yáng)離子大分子蛋白脂質(zhì)基因藥物載體由轉(zhuǎn)鐵蛋白-長(zhǎng)鏈烷基季銨鹽和脂質(zhì)成分組成,其中,轉(zhuǎn)鐵蛋白和長(zhǎng)鏈烷基季銨鹽的質(zhì)量比為O. Ofl 1 ;轉(zhuǎn)鐵蛋白-長(zhǎng)鏈烷基季銨鹽與脂質(zhì)成分的質(zhì)量比為O. 05 20 1 ;粒徑在 I IOOOOOnm ; 所述的轉(zhuǎn)鐵蛋白-長(zhǎng)鏈烷基季銨鹽是在極性有機(jī)溶劑或水中的溶解度大于O. lmg/mL,蛋白分子量在100(Γ1000000之間,其中的季銨鹽為氯化物和溴化物; 所述的脂質(zhì)成分為膽固醇、二油酰脂酰乙醇胺、3 β- [Ν-(Ν’,Ν’_ 二甲基胺乙基)胺基甲?;鵠膽固醇、卵磷脂、二硬脂酰磷脂酰膽堿、棕櫚酰油酰磷脂酰膽堿、二油酰磷脂酰乙醇胺、二棕櫚酰油酰磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺或棕櫚酰油酰磷脂酰乙醇胺中的一種或2-3種,優(yōu)選為膽固醇、二油酰脂酰乙醇胺或3β- [Ν-(Ν’,N’ - 二甲基胺乙基)胺基甲酰基]膽固醇; 所述的轉(zhuǎn)鐵蛋白-長(zhǎng)鏈烷基季銨鹽中的長(zhǎng)鏈烷基季銨鹽為十二烷基三甲基溴化銨、十四烷基三甲基溴化銨、十六烷基三甲基溴化銨、二甲基雙十八烷基溴化銨、I,2- 二油酰-3- 二甲基-羥乙基溴化銨、1,2- 二油酰氧丙基-3- 二甲基-羥乙基溴化銨、1,2- 二油酰氧丙基-3- 二甲基-羥丙基溴化銨、I,2- 二油酰氧丙基-3- 二甲基-羥丁基溴化銨、I,2- 二油酰氧丙基-3- 二甲基-羥戊基溴化銨、I,2- 二棕櫚酰氧丙基-3- 二甲基-羥乙基溴化銨、I,2- 二硬脂酰氧丙基-3- 二甲基-羥乙基溴化銨、I,2- 二肉豆蘧酰氧丙基-3- 二甲基-羥乙基溴化銨及其上述季銨鹽相應(yīng)的氯化物;或者是含環(huán)氧基團(tuán)的長(zhǎng)鏈烷基季銨鹽二甲基十八烷基環(huán)氧丙基氯化銨、二甲基十六烷基環(huán)氧丙基氯化銨、二甲基十四烷基環(huán)氧丙基氯化銨、二甲基十二烷基環(huán)氧丙基氯化銨及其上述季銨鹽相應(yīng)的溴化物。
2.如權(quán)利要求I所述的陽(yáng)離子大分子蛋白脂質(zhì)基因藥物載體,其特征在于所述的轉(zhuǎn)鐵蛋白-長(zhǎng)鏈燒基季銨鹽中的轉(zhuǎn)鐵蛋白可由牛血清白蛋白、ProteinA、Protein G、甲胎蛋白、表皮生長(zhǎng)因子受體EGFR的抗體、英夫利西單抗、人纖維蛋白單鏈抗體、癌胚抗原、組織多肽抗原、淀粉酶、乳酸脫氫酶、核糖核酸酶、5-核苷酸酶、促腎上腺皮質(zhì)激素、抗利尿激素、生長(zhǎng)激素、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子、雌激素或孕激素代替。
3.—種如權(quán)利要求書I所述的陽(yáng)離子大分子蛋白脂質(zhì)基因藥物載體的制備方法,其特征在于通過(guò)步驟I)及2)獲得 1)轉(zhuǎn)鐵蛋白-長(zhǎng)鏈烷基季銨鹽的制備方法 將轉(zhuǎn)鐵蛋白溶解到去離子水和醇的混合溶液中;再將長(zhǎng)鏈烷基季銨鹽緩慢的加入到體系中,其中去離子水和醇的質(zhì)量比為I :(Γ3 ;體系中轉(zhuǎn)鐵蛋白和長(zhǎng)鏈烷基季銨鹽的質(zhì)量比為I :0. OflOO ;所述的醇為甲醇、乙醇、或異丙醇;在室溫下攪拌24小時(shí)后將反應(yīng)液透析Γ500小時(shí),最后凍干,得轉(zhuǎn)鐵蛋白-長(zhǎng)鏈烷基季銨鹽的白色粉末; 2)轉(zhuǎn)鐵蛋白-長(zhǎng)鏈烷基季銨鹽與脂質(zhì)成分進(jìn)行組裝;組裝的方法為薄膜分散法、逆向蒸發(fā)法或透析法 薄膜分散法的基本步驟為 將步驟I)獲得的轉(zhuǎn)鐵蛋白-長(zhǎng)鏈烷基季銨鹽和脂質(zhì)成分共溶于極性有機(jī)溶劑中,所述的轉(zhuǎn)鐵蛋白-長(zhǎng)鏈烷基季銨鹽和脂質(zhì)成分的質(zhì)量比為O. 05^20 :1,所述的極性有機(jī)溶劑指二氯甲烷、氯仿、丙酮;混勻作為有機(jī)相,除去有機(jī)溶劑使成薄膜,然后加入水相使脂質(zhì)膜水化,水相為O. 9%的生理鹽水或pH=5、的磷酸鹽緩沖溶液;逆向蒸發(fā)法的基本步驟為 將步驟I)獲得的轉(zhuǎn)鐵蛋白-長(zhǎng)鏈烷基季銨鹽和脂質(zhì)成分共溶于極性有機(jī)溶劑中,所述的轉(zhuǎn)鐵蛋白-長(zhǎng)鏈烷基季銨鹽和脂質(zhì)成分的質(zhì)量比為O. 05^20 :1,所述的極性有機(jī)溶劑指二氯甲烷、氯仿、丙酮;混勻作為有機(jī)相;水相為O. 9%的生理鹽水或pH=6、的磷酸鹽緩沖溶液;將水相與有機(jī)相混合,水相和有機(jī)相的體積比為I :6飛1,超聲乳化后,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑; 透析法的基本步驟為 將步驟I)獲得的轉(zhuǎn)鐵蛋白-長(zhǎng)鏈烷基季銨鹽和脂質(zhì)成分共溶于可與水互溶的極性有機(jī)溶劑中,所述的轉(zhuǎn)鐵蛋白-長(zhǎng)鏈烷基季銨鹽和脂質(zhì)成分的質(zhì)量比為O. 05^20 :1,所述的極性有機(jī)溶劑指丙酮、異丙醇、乙醇、二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺;混勻作為極性有機(jī)相;將極性有機(jī)相放入透析袋中在水相溶液中透析1飛00小時(shí),水相溶液為O. 9%的生理鹽水或pH=6、的磷酸鹽緩沖溶液;所述的轉(zhuǎn)鐵蛋白-長(zhǎng)鏈烷基季銨鹽、脂質(zhì)成分和長(zhǎng)鏈烷基季銨鹽同權(quán)利要求I或2所述。
4.如權(quán)利要求書3所述的陽(yáng)離子大分子蛋白脂質(zhì)基因藥物載體的制備方法,其特征在于步驟I)中所述的長(zhǎng)鏈烷基季銨鹽為二甲基十八烷基環(huán)氧丙基氯化銨。
5.一種如權(quán)利要求I或2所述的陽(yáng)離子大分子蛋白脂質(zhì)基因藥物載體的用途,其特征是用于制備基因藥物。
6.如權(quán)利要求5所述的陽(yáng)離子大分子蛋白脂質(zhì)基因藥物載體的用途,其特征是所述的基因藥物為乙酰膽堿酯酶抑癌基因、RB基因和p53基因、siRNA、mRNA、紫杉醇、消炎痛、甲氨蝶呤、巰嘌呤、氟尿嘧啶、氮芥、環(huán)磷酰胺、順鉬、絲裂霉素、喜樹堿、阿霉素、柔紅霉素、光輝霉素、長(zhǎng)春堿、依托泊苷中的一種或幾種。
全文摘要
本發(fā)明公開了陽(yáng)離子大分子蛋白脂質(zhì)基因藥物載體、制備方法及應(yīng)用。其中陽(yáng)離子大分子蛋白脂質(zhì)基因藥物載體為由轉(zhuǎn)鐵蛋白-長(zhǎng)鏈烷基季銨鹽和脂質(zhì)成分按質(zhì)量比為0.05~201制備的大分子轉(zhuǎn)鐵蛋白脂質(zhì)體?;蜣D(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明大分子轉(zhuǎn)鐵蛋白脂質(zhì)體在293T、NIH-3T3、肝癌Huh-7、SMMC-7721、肺癌A549細(xì)胞中的基因轉(zhuǎn)染效率與陽(yáng)性對(duì)照陽(yáng)離子脂質(zhì)體LipofectamineTM2000相當(dāng)。所述的陽(yáng)離子大分子蛋白脂質(zhì)基因藥物載體系統(tǒng)具有較好的生物相容性,細(xì)胞毒性低,可作為優(yōu)良的非病毒基因給藥載體。
文檔編號(hào)A61P35/00GK102716500SQ20121021960
公開日2012年10月10日 申請(qǐng)日期2012年6月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月28日
發(fā)明者李宗海, 梁曉飛, 石必枝 申請(qǐng)人:上海市腫瘤研究所