呼吸道上皮-多孔絲素蛋白復(fù)合物及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬組織工程和醫(yī)用材料領(lǐng)域，涉及呼吸道上皮-多孔絲素蛋白復(fù)合物及其制備方法和應(yīng)用，尤其是在多孔絲素蛋白上進(jìn)行呼吸道上皮培養(yǎng)的方法，及呼吸道上皮-多孔絲素蛋白復(fù)合物在氣管缺損重建中的應(yīng)用。本發(fā)明采用多孔蛋白絲素作為支架材料，原代人呼吸道上皮細(xì)胞作為種子細(xì)胞，將呼吸道上皮細(xì)胞在多孔絲素蛋白上進(jìn)行復(fù)合培養(yǎng)形成呼吸道上皮-多孔絲素蛋白復(fù)合物。該復(fù)合物覆蓋于人工氣管內(nèi)壁，使人工氣管內(nèi)壁被覆呼吸道粘膜，更接近于正常氣管結(jié)構(gòu)，可進(jìn)一步作為醫(yī)用材料制備組織工程化氣管，以及用于臨床氣管粘膜修復(fù)及臨床重建氣管缺損，以及減少重建氣管術(shù)后并發(fā)癥。
【專利說(shuō)明】呼吸道上皮-多孔絲素蛋白復(fù)合物及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬組織工程和醫(yī)用材料領(lǐng)域，涉及呼吸道上皮-多孔絲素蛋白復(fù)合物及其制備方法和應(yīng)用，尤其是在多孔絲素蛋白上進(jìn)行呼吸道上皮培養(yǎng)的方法，及呼吸道上皮-多孔絲素蛋白復(fù)合物在氣管缺損重建中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]據(jù)報(bào)道，臨床醫(yī)療中常見(jiàn)因腫瘤、外傷和先天畸形等引起的氣管缺損，而且當(dāng)缺損長(zhǎng)度超過(guò)氣管總長(zhǎng)度的一半時(shí)(>6cm)，會(huì)因吻合口張力過(guò)大造成管腔瘺而不能進(jìn)行直接吻合，則需要進(jìn)行氣管重建。臨床實(shí)踐中重建的氣管需具備如下條件:要求有足夠的強(qiáng)度和彈性以保持管腔通暢及頭頸運(yùn)動(dòng)，密封性好、不漏氣，內(nèi)壁有氣管黏膜上皮生長(zhǎng)，具有清潔氣道的功能等。目前，臨床常用的重建方法有:①異體氣管移植:供體來(lái)源有限，術(shù)后需終身使用抗免疫藥物自體組織移植:移植物與正常氣管的組織結(jié)構(gòu)和力學(xué)特性相差較大，而且造成正常組織損傷；③人工材料的應(yīng)用:常見(jiàn)的有金屬和高分子假體，植入后容易出現(xiàn)異物反應(yīng)、排斥。所述的3種重建方法均不能夠完全符合重建的氣管要求，甚至有時(shí)為了確保修復(fù)而達(dá)不到病變的完整切除。
[0003]組織工程化氣管應(yīng)運(yùn)而生，它是將經(jīng)體外擴(kuò)增的種子細(xì)胞接種在具有氣管環(huán)樣結(jié)構(gòu)的支架材料上，通過(guò)細(xì)胞在支架材料中的黏附、生長(zhǎng)繁殖以及分泌細(xì)胞外基質(zhì)，形成一定形狀且具有一定功能的氣管環(huán)，原位移植從而達(dá)到修復(fù)缺損、重建功能的目的?，F(xiàn)有技術(shù)公開(kāi)了組織工程化組織的研究主要包括以下的內(nèi)容:(I)細(xì)胞支架的研究；(2)種子細(xì)胞的選擇、培養(yǎng)和生長(zhǎng)；(3)生物組織工程化組織的構(gòu)建。由于氣管支架的特殊性，組織工程化氣管支架不僅要求(I)較好的生物相容性及表面相容性(即材料表面具有足夠的細(xì)胞吸附能力，有利于細(xì)胞的粘附和生長(zhǎng))；(2)適宜的生物降解度，在組織工程化氣管形成后，可逐步降解；(3)不誘發(fā)機(jī)體的免疫排斥反應(yīng)；(4)具有較高孔隙率的三維多孔結(jié)構(gòu)，在植入初期滲入組織液基質(zhì)提供適合細(xì)胞 再生的微環(huán)境，并有利于毛細(xì)血管網(wǎng)的長(zhǎng)入實(shí)現(xiàn)血管化。更要求其具有(5)足夠的機(jī)械強(qiáng)度和靈活的塑形性，且內(nèi)壁被覆呼吸道黏膜上皮。目前醫(yī)療實(shí)踐使用的細(xì)胞支架主要有:(I)去細(xì)胞化的異體氣管及自體組織，此種方法雖然減少了免疫排斥反應(yīng)，但供體來(lái)源困難；(2)合成類的聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)及二者的共聚物(PL GA)等，及天然類的膠原、糖氨聚糖、殼聚糖，合成類材料的缺點(diǎn)是容易造成局部組織酸性降解產(chǎn)物堆積，在體內(nèi)會(huì)引發(fā)炎癥反癥，明膠是最早應(yīng)用的可降解天然材料，但作為支架材料其機(jī)械性能明顯不足，殼聚糖剛性很強(qiáng)，但其缺陷在于材料脆性高。
[0004]絲素為一種天然的高分子材料，通過(guò)改變制備方法及控制工藝條件，可以控制絲素多孔質(zhì)體孔隙的大小和密度，吸水性，透濕性，斷裂強(qiáng)度，水中溶失率等主要結(jié)構(gòu)和性能指標(biāo)。絲素蛋白主要由甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸等18種氨基酸所組成，與人體角質(zhì)及膠原組成結(jié)構(gòu)相似；有研究通過(guò)生物整體，細(xì)胞和分子生物學(xué)三個(gè)水平對(duì)絲素蛋白與機(jī)體的生物相容性實(shí)驗(yàn)表明，絲素蛋白安全可靠，具有更優(yōu)良的生物相容性。絲素蛋白作為一種蛋白質(zhì)，植入體內(nèi)最終被吸收，降解，已有研究表明，絲素蛋白生物降解后，其降解產(chǎn)物本身不僅對(duì)組織無(wú)毒副作用，還對(duì)如皮膚、牙周組織有營(yíng)養(yǎng)與修復(fù)的能力。國(guó)內(nèi)已有用蠶絲作為體外細(xì)胞培養(yǎng)的支架，進(jìn)行動(dòng)物雪旺細(xì)胞培養(yǎng)；絲素蛋白對(duì)軟骨細(xì)胞具有良好的吸附作用及生物相容性，并能維持軟骨細(xì)胞正常形態(tài)和功能，是適合軟骨細(xì)胞立體培養(yǎng)的良好天然支架。有研究應(yīng)用絲素蛋白膜修復(fù)兔及犬尿道缺損，結(jié)果表明絲素蛋白膜能夠誘導(dǎo)尿道粘膜上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)，用絲素蛋白涂覆的鈦網(wǎng)修復(fù)家兔頸段氣管的缺損，術(shù)后可見(jiàn)氣管腔內(nèi)黏膜光滑，管腔無(wú)明顯狹窄，無(wú)瘢痕及肉芽組織生長(zhǎng)。還有報(bào)道，絲素材料生物相容性好，抗原反應(yīng)不明顯或無(wú)明顯異物排斥反應(yīng)，氣管粘膜在絲素涂層的鈦網(wǎng)表面生長(zhǎng)良好，以及絲素蛋白能誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化及血管化形成等結(jié)果。迄今為止，國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)應(yīng)用絲素蛋白在呼吸道上皮培養(yǎng)中的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種呼吸道上皮-多孔絲素蛋白復(fù)合物及其制備方法，尤其是在多孔絲素蛋白上進(jìn)行呼吸道上皮培養(yǎng)的方法。
[0006]本發(fā)明的進(jìn)一步目的是提供所述的呼吸道上皮培養(yǎng)的方法制得的呼吸道上皮-多孔絲素蛋白復(fù)合物在氣管缺損重建中的用途，
[0007]本發(fā)明采用多孔絲素蛋白作為支架材料，以支氣管黏膜上皮作為種子細(xì)胞，制成呼吸道上皮-多孔絲素支架復(fù)合物。本發(fā)明利用絲素的良好生物相容性和促進(jìn)粘膜細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，為呼吸道管腔的修復(fù)提供必需的內(nèi)壁被襯黏膜。
[0008]本發(fā)明呼吸道上皮-多孔絲素復(fù)合物可用作臨床氣管缺損修補(bǔ)，能為探討呼吸道上皮-絲素蛋白復(fù)合物在促進(jìn)氣管粘膜修復(fù)及臨床重建氣管缺損、減少重建氣管術(shù)后并發(fā)癥的作用提供有意義的參考。
[0009]本發(fā)明提供了制備呼吸道上皮-多孔絲素蛋白復(fù)合物的方法，其特征在于，包括如下步驟:
[0010]1、制備多孔絲素蛋白
[0011]采用廢桑蠶生絲進(jìn)行脫膠，溶于LiBr水溶液中，過(guò)濾，濃縮后制成20%濃度的絲素蛋白溶液，加入正丁醇后，將混合溶液灌入模具中，經(jīng)冷凍干燥后獲得白色多孔支架，修剪大小備用；
[0012]2、人呼吸道上皮原代培養(yǎng)
[0013]取離體的人肺葉標(biāo)本，浸泡在含10%FBC的RPMI1640培養(yǎng)液中，用含青霉素及鏈霉素的生理鹽水以及PBS沖洗后，浸于含10%FBC的RIPM1640培養(yǎng)液中，再?zèng)_洗后，培養(yǎng)液離心，棄上清，再洗滌，棄上清，加入含10%FBC的RPMI1640培養(yǎng)液，吹打混勻，置多聚賴氨酸預(yù)處理的培養(yǎng)瓶中，37°C，5%C02細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，改用無(wú)血清BEBM培養(yǎng)液，獲得人氣道上皮細(xì)胞；
[0014]3、人呼吸道上皮與多孔絲素支架的復(fù)合培養(yǎng)
[0015]當(dāng)上述人氣道上皮細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到80%融合后，吸除培養(yǎng)液，PBS洗滌，加入0.25%胰酶消化后，加入含10%FBS的RIPM1640培養(yǎng)液終止消化，將細(xì)胞吹下，離心，棄上清，用含10%FBC的RPMI1640培養(yǎng)液再洗滌，棄上清，加入BEBM無(wú)血清培養(yǎng)液，將多孔絲素蛋白放置于24孔培養(yǎng)板中，將所述人氣道上皮細(xì)胞接種到多孔絲素蛋白上，37°C，5%C02培養(yǎng)，掃描電鏡及鈣黃綠素染色觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，制得呼吸道上皮-多孔絲素蛋白復(fù)合物。[0016]結(jié)果顯示:
[0017]培養(yǎng)12~24h可見(jiàn)部分細(xì)胞貼壁，細(xì)胞由圓形逐漸變成卵圓形或多角形，培養(yǎng)第2~3天，細(xì)胞開(kāi)始分裂增殖，培養(yǎng)第7~9天，新生細(xì)胞開(kāi)始增多，邊界清楚，部分區(qū)域細(xì)胞匯合成片，細(xì)胞增殖加速，核分裂象多見(jiàn)，進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)期，細(xì)胞在板底呈簇狀分布，約12-14天細(xì)胞達(dá)80%融合；
[0018]多孔絲素蛋白上接種后呼吸道上皮細(xì)胞3天，3天絲素支架上呼吸道上皮細(xì)胞黏附良好，14天呼吸道上皮在絲素材料上成片狀生長(zhǎng)，21天呼吸道上皮生長(zhǎng)仍活躍；
[0019]活細(xì)胞鈣黃綠素染色(Calcein AM)，證實(shí)細(xì)胞活力良好。
[0020]本發(fā)明培養(yǎng)結(jié)果結(jié)果顯示，呼吸道上皮可以黏附在多孔絲素蛋白上，且生長(zhǎng)良好，延展成片狀覆蓋于多孔絲素蛋白，制得上呼吸道上皮-多孔絲素蛋白復(fù)合物，經(jīng)活細(xì)胞鈣黃綠素染色顯示多孔絲素蛋白上呼吸道上皮活性良好。
[0021]本發(fā)明在多孔絲素蛋白上培養(yǎng)呼吸道上皮細(xì)胞，制成呼吸道上皮-多孔絲素蛋白復(fù)合物，該復(fù)合物可以覆蓋于人工氣管內(nèi)壁，使人工氣管內(nèi)壁被覆呼吸道粘膜，更接近于正常氣管結(jié)構(gòu)，可進(jìn)一步制備組織工程化氣管，以及作為醫(yī)用材料用于臨床氣管粘膜修復(fù)及臨床重建氣管缺損，以及減少重建氣管術(shù)后并發(fā)癥。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0022]圖1人原代支氣管上皮細(xì)胞培養(yǎng)14天結(jié)果(200倍)。
[0023]圖2人原代支氣管上皮細(xì)胞培養(yǎng)角蛋白染色陽(yáng)性(200倍)。
[0024]圖3多孔絲素支架上呼吸道上皮生長(zhǎng)的電鏡觀察結(jié)果，
[0025]其中，A培養(yǎng)3天細(xì)胞粘附于多孔絲素支架，B培養(yǎng)14天細(xì)胞在支架上生長(zhǎng)成片狀，C培養(yǎng)21天細(xì)胞在支架上生長(zhǎng)良好。
[0026]圖4多孔絲素支架上呼吸道上皮生長(zhǎng)的Calcein AM染色，
[0027]其中，A培養(yǎng)3天200倍，B培養(yǎng)7天100倍，
[0028]C培養(yǎng)14天100倍，D培養(yǎng)21天100倍。
【具體實(shí)施方式】
[0029]實(shí)施例1制備多孔絲素蛋白
[0030]將廢桑蠶生絲脫膠，并將脫膠絲溶于LiBr水溶液中，過(guò)濾，濃縮后制成大約20%濃度的絲素蛋白溶液。按2: I的體積比率加入正丁醇，低速攪拌后把絲素蛋白和正丁醇混合溶液灌入自備模具中，經(jīng)過(guò)冷凍干燥后即獲得白色多孔支架。支架平均孔徑為100-200 μ m。修剪為直徑0.5cm、厚1mm、大小備用。
[0031]實(shí)施例2人呼吸道上皮原代培養(yǎng)
[0032]取人肺葉切除術(shù)后標(biāo)本遠(yuǎn)離腫瘤部位支氣管約1cm，立即浸泡在含10%FBC的RPMI1640培養(yǎng)液中，用含1X105U/L青霉素及I X 105U/L鏈霉素的生理鹽水沖洗支氣管粘膜三遍，再用PBS沖洗三遍，置于60cm培養(yǎng)皿里，浸于含10%FBC的RIPM1640培養(yǎng)液中，內(nèi)鏡用細(xì)胞刷(AF-1810XB)在支氣管粘膜上每處輕輕刮刷約7-8次。RPMI1640培養(yǎng)液沖洗支氣管粘膜表面，將培養(yǎng)皿里培養(yǎng)液離心1000轉(zhuǎn)/分X5分鐘。棄上清，用含10%FBC的RPMI1640培養(yǎng)液再洗滌一遍(離心1000轉(zhuǎn)/分X5分鐘)，棄上清，加入3ml含10%FBC的RPMI1640培養(yǎng)液，一次性無(wú)菌吸管輕輕吹打混勻，置多聚賴氨酸預(yù)處理的25cm2培養(yǎng)瓶中，370C，5%C02細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。培養(yǎng)24h后，改用無(wú)血清BEBM培養(yǎng)液，每2_3天更換培養(yǎng)液，結(jié)果顯示:培養(yǎng)12~24h可見(jiàn)部分細(xì)胞貼壁，細(xì)胞由圓形逐漸變成卵圓形或多角形，培養(yǎng)第2~3天，細(xì)胞開(kāi)始分裂增殖，培養(yǎng)第7~9天，新生細(xì)胞開(kāi)始增多，邊界清楚，部分區(qū)域細(xì)胞匯合成片，細(xì)胞增殖加速，核分裂象多見(jiàn)，進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)期，細(xì)胞在板底呈簇狀分布，約12-14天細(xì)胞達(dá)80%融合；
[0033]實(shí)施例3人呼吸道上皮與多孔絲素支架的復(fù)合培養(yǎng)
[0034]當(dāng)人氣道上皮細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到80%融合后，胰酶消化，調(diào)整細(xì)胞濃度為IX IOVcm2的密度將人氣道上皮細(xì)胞接種到多孔絲素蛋白上，在37°C，5%C02細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)21天。定期掃描電鏡及鈣黃綠素染色觀察生長(zhǎng)情況。
[0035]結(jié)果顯示，多孔絲素蛋白上接種后呼吸道上皮細(xì)胞3天，3天絲素支架上呼吸道上皮細(xì)胞黏附良好，14天呼吸道上皮在絲素材料上成片狀生長(zhǎng)，21天呼吸道上皮生長(zhǎng)仍活躍；活細(xì)胞鈣黃綠素染色(Calc ein AM)，證實(shí)細(xì)胞活力良好。
【權(quán)利要求】
1.一種呼吸道上皮-多孔絲素蛋白復(fù)合物，其特征在于，采用多孔絲素蛋白為支架材料，以人呼吸道上皮細(xì)胞為種子細(xì)胞，復(fù)合培養(yǎng)制成呼吸道上皮-多孔絲素蛋白復(fù)合物。
2.按權(quán)利要求1所述的呼吸道上皮-多孔絲素蛋白復(fù)合物，其特征在于，通過(guò)如下步驟制備: (1)制備多孔絲素蛋白 采用廢桑蠶生絲進(jìn)行脫膠，溶于LiBr水溶液中，過(guò)濾，濃縮后制成20%濃度的絲素蛋白溶液，加入正丁醇后，將混合溶液灌入模具中，經(jīng)冷凍干燥后獲得白色多孔支架，修剪大小備用; (2)人呼吸道上皮原代培養(yǎng) 取離體的人肺葉標(biāo)本，浸泡在含10%FBC的RPMI1640培養(yǎng)液中，用含青霉素及鏈霉素的生理鹽水以及PBS沖洗后，浸于含10%FBC的RIPM1640培養(yǎng)液中，再?zèng)_洗后，培養(yǎng)液離心，棄上清，再洗滌，棄上清，加入含10%FBC的RPMI1640培養(yǎng)液，吹打混勻，置培養(yǎng)瓶中，37°C，5%C02細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，改用無(wú)血清BEBM培養(yǎng)液，獲得人氣道上皮細(xì)胞； (3)人呼吸道上皮與多孔絲素支架的復(fù)合培養(yǎng) 上述人氣道上皮細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到80%融合后，吸除培養(yǎng)液，PBS洗滌，加入0.25%胰酶消化后，加入含10%FBS的RIPM1640培養(yǎng)液終止消化，將細(xì)胞吹下，離心，棄上清，用含10%FBC的RPMI1640培養(yǎng)液再洗滌，棄上清，加入BEBM無(wú)血清培養(yǎng)液，將多孔絲素蛋白放置于24孔培養(yǎng)板中，將所述人氣道上皮細(xì)胞接種到多孔絲素蛋白上，370C，5%C02培養(yǎng)，掃描電鏡及鈣黃綠素染色觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，制得呼吸道上皮-多孔絲素蛋白復(fù)合物。`
3.按權(quán)利要求1所述的呼吸道上皮-多孔絲素蛋白復(fù)合物，其特征在于，所述步驟(1)制得的白色多孔支架平均孔徑為100-200μπι。
4.按權(quán)利要求2所述的呼吸道上皮-多孔絲素蛋白復(fù)合物，其特征在于，所述步驟(2)中，采用含1X105U/L青霉素及I X 105U/L鏈霉素的生理鹽水沖洗支氣管粘膜。
5.按權(quán)利要求2所述的呼吸道上皮-多孔絲素蛋白復(fù)合物，其特征在于，所述步驟(2)中，所述的培養(yǎng)瓶是多聚賴氨酸預(yù)處理的25cm2培養(yǎng)瓶。
6.按權(quán)利要求2所述的呼吸道上皮-多孔絲素蛋白復(fù)合物，其特征在于，所述步驟(3)中，接種到多孔絲素蛋白上的人氣道上皮細(xì)胞濃度為lX105/Cm2。
7.權(quán)利要求1所述的呼吸道上皮-多孔絲素蛋白復(fù)合物在制備組織工程化氣管材料中的用途。
8.權(quán)利要求1所述的呼吸道上皮-多孔絲素蛋白復(fù)合物在制備氣管粘膜修復(fù)及氣管缺損重建醫(yī)用材料中的用途。
【文檔編號(hào)】A61L27/54GK103505760SQ201210223511
【公開(kāi)日】2014年1月15日 申請(qǐng)日期:2012年6月29日 優(yōu)先權(quán)日:2012年6月29日
【發(fā)明者】陳仲春, 趙霞, 文建川, 陳新, 嚴(yán)文洪, 邵正中 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院, 復(fù)旦大學(xué)