抑制大腦eIF6基因表達(dá)的核酸抑制分子、其篩選方法和用途
【專利摘要】本發(fā)明基于eIF6對(duì)記憶力的負(fù)調(diào)控和增強(qiáng)谷氨酸受體表達(dá)的作用，提供了一種在體外培養(yǎng)細(xì)胞中篩選有效抑制大腦eIF6基因表達(dá)的核酸抑制分子的方法，通過(guò)該方法篩選的核酸抑制分子，以及所述核酸抑制分子預(yù)防和/或治療運(yùn)動(dòng)性疲勞和/或記憶力減退及其相關(guān)疾病的用途。
【專利說(shuō)明】抑制大腦elF6基因表達(dá)的核酸抑制分子、其篩選方法和用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明提供了一種篩選有效抑制大腦eIF6基因表達(dá)的核酸抑制分子的方法，通過(guò)該方法篩選的核酸抑制分子，以及所述核酸抑制分子預(yù)防和/或治療運(yùn)動(dòng)性疲勞和/或記憶力減退及其相關(guān)疾病的用途。
【背景技術(shù)】
[0002]一、運(yùn)動(dòng)性疲勞
[0003]運(yùn)動(dòng)性疲勞主要是指由運(yùn)動(dòng)引起身體能力下降的現(xiàn)象。1982年第五屆國(guó)際運(yùn)動(dòng)生化會(huì)議將疲勞的定義統(tǒng)一，運(yùn)動(dòng)性疲勞是“機(jī)體生理過(guò)程不能持續(xù)其機(jī)能在一定水平或和各器官不能維持預(yù)定的運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度”。
[0004]目前，按疲勞發(fā)生的部位，習(xí)慣上把運(yùn)動(dòng)性疲勞分為中樞疲勞和外周疲勞兩部分。其中中樞疲勞產(chǎn)生的機(jī)制包括:
[0005]I) 5-羥色胺(5-HT):5-HT是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一種抑制性遞質(zhì)，研究也證實(shí)，動(dòng)物進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間運(yùn)動(dòng)過(guò)程中大腦5-HT含量明顯增加[1，2]。
[0006]2)多巴胺(DA)和去甲腎上腺素(NE):研究結(jié)果顯示，在運(yùn)動(dòng)過(guò)程中中腦、海馬、紋狀體和下丘腦的DA代謝增強(qiáng)[3]。Bailey等發(fā)現(xiàn)大鼠的疲勞與腦干和中腦中多巴胺的合成和代謝的減少有關(guān)，當(dāng)腦DA合成和代謝得以維持時(shí)，疲勞就會(huì)延遲。
[0007]3)乙酰膽堿(Ach) :近年來(lái)，有推測(cè)認(rèn)為耐力運(yùn)動(dòng)中疲勞可能是由于運(yùn)動(dòng)中膽堿利用的衰竭、排空降低了膽堿能系統(tǒng)的活動(dòng)而引發(fā)的[4]。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)員馬拉松跑后，血漿膽堿水平下降約40%，與進(jìn)食無(wú)膽堿的食物有同樣效果[4]，暗示當(dāng)中樞Ach濃度下降時(shí)，中樞疲勞就會(huì)發(fā)生。
[0008]4)谷氨酸，r-氨基丁酸(GABA) =GABA是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主要的抑制性氨基酸，谷氨酸(Glu)是主要的興奮性氨基酸。Coiix)研究發(fā)現(xiàn)GABA可抑制腺垂體對(duì)運(yùn)動(dòng)的反應(yīng)，減弱機(jī)體對(duì)運(yùn)動(dòng)的應(yīng)激，降低機(jī)體的運(yùn)動(dòng)能力[5]。在正常生理情況下，腦內(nèi)興奮性氨基酸與抑制性氨基酸保持平衡。當(dāng)腦內(nèi)谷氨酸含量升高時(shí)，表示大腦皮層興奮過(guò)程占優(yōu)勢(shì)；當(dāng)腦內(nèi)Y-氨基丁酸含量升高時(shí)，表示大腦皮層抑制過(guò)程占優(yōu)勢(shì)，此時(shí)易出現(xiàn)疲勞。
[0009]5)氨濃度:運(yùn)動(dòng)時(shí)，肌肉可產(chǎn)生氨并釋放到血液。氨可通過(guò)血腦屏障，具有毒害作用。腦氨增多可引起多種酶活性及ATP再合成速率下降。氨還可改變腦膜對(duì)氨基酸的通透性，影響各種神經(jīng)遞質(zhì)的代謝，因此氨可能是中樞疲勞的重要原因之一。
[0010]二、學(xué)習(xí)記憶
[0011]學(xué)習(xí)記憶是大腦最基本、最重要的高級(jí)神經(jīng)功能之一，是衡量人類智能發(fā)育的重要指標(biāo)。多年來(lái)人們對(duì)學(xué)習(xí)與記憶在腦內(nèi)的定位問(wèn)題進(jìn)行了大量的研究，目前認(rèn)為邊緣系統(tǒng)中的海馬是學(xué)習(xí)、記憶等高級(jí)神經(jīng)活動(dòng)的重要部位，海馬與學(xué)習(xí)記憶有著密切的聯(lián)系[6，7]。
[0012]研究發(fā)現(xiàn)給予海馬短暫重復(fù)的刺激，會(huì)引起突觸傳遞增強(qiáng)，在無(wú)損傷的動(dòng)物體實(shí)驗(yàn)中，增強(qiáng)效應(yīng)將維持?jǐn)?shù)小時(shí)，甚至數(shù)周，這種突觸傳遞的增強(qiáng)被稱作突觸傳遞長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(Long-term potentiation, LTP)。海馬內(nèi)三條主要的興奮性突觸都能產(chǎn)生長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(LTP) ο Richard Morris 于 1986 年首次證明長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(Long-term potentiation, LTP)是體內(nèi)記憶形成所必需的[8]。Susumu Tonegawa于1996年證明海馬CAl區(qū)是活體老鼠空間記憶形成的關(guān)鍵[9]，海馬NMDA受體活性的增強(qiáng)能產(chǎn)生增強(qiáng)的LTP和空間學(xué)習(xí)的整體提高。2001年，Joe Tsien培育了海馬中高表達(dá)NR2B亞基而具有NMDA受體功能增強(qiáng)品系的Doogie小鼠[10] ,Doogie小鼠不僅長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(Long-term potentiation,LTP)較強(qiáng)而且在空間學(xué)習(xí)任務(wù)中也表現(xiàn)出色，進(jìn)一步加強(qiáng)了 LTP對(duì)海馬依賴性記憶形成中的重要性。目前認(rèn)為，LTP產(chǎn)生的分子機(jī)制為興奮性神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸(Glul)和其受體KA/AMPA結(jié)合，激活了 N2甲基2D2天門冬氨酸(NMDA)受體的離子通道進(jìn)而產(chǎn)生的[11]。
[0013] 三、eIF6的基本特征
[0014]eIF6 基因(SEQ ID NO 2，NCBI genebank 登記號(hào)為 NM-002212)在真核生物中高度保守[12，13]，人和小鼠eIF6氨基酸序列有98%序列同源性。在人類基因組中，eIF6定位于20號(hào)染色體的長(zhǎng)臂20qll.2區(qū)，5’端缺少TATA啟動(dòng)子結(jié)合區(qū)，CpG島，mRNA全長(zhǎng)1108bp，含有7個(gè)外顯子和6個(gè)內(nèi)含子，開放讀框含有735個(gè)核苷酸，245個(gè)氨基酸，分子量大小為27KD[14]。eIF6蛋白分布廣泛，研究證實(shí)，在上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、激活的T細(xì)胞、活化的肥大細(xì)胞及肌肉組織纖維中均有eIF6蛋白的表達(dá)，也有研究證實(shí)只要表達(dá)α6β4整合素的細(xì)胞均表達(dá)eIF6[15]。細(xì)胞水平，eIF6蛋白表達(dá)在胞漿(中間絲附近)和胞核(主要位于核仁外周)[16]。
[0015]eIF6的生物學(xué)功能包括:
[0016]I)參與調(diào)控蛋白合成:在真核生物翻譯起始階段，eIF6促進(jìn)40s亞基和60s亞基結(jié)合形成80s亞基，從而啟動(dòng)蛋白質(zhì)的翻譯[17-20]。敲除eIF6基因后核糖體60s亞基丟失，證明其對(duì)核糖體60s的形成具有重要的作用[16]。并且對(duì)胞外信號(hào)的反應(yīng)中eIF6是作為最早的真核細(xì)胞翻譯起始因子參與調(diào)節(jié)蛋白的翻譯[21]。另一方面，eIF6與RISC (RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體)結(jié)合，特異性地促進(jìn)相應(yīng)microRNA的作用，從轉(zhuǎn)錄水平上干擾mRNA形成，抑制其對(duì)應(yīng)靶蛋白的表達(dá)，反之敲除eIF6后則會(huì)解除miciORNA對(duì)靶蛋白的表達(dá)抑制作用而促進(jìn)革巴蛋白的表達(dá)[22,23]。
[0017]2)參與調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附及細(xì)胞骨架的形成:eIF6為β 4整合素結(jié)合蛋白，與中間絲和α6β 4整合素的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的功能區(qū)結(jié)合，介導(dǎo)細(xì)胞的黏附功能[24]。此外，eIF6還存在于核基質(zhì)中，參與細(xì)胞骨架的形成。有實(shí)驗(yàn)已證明eIF6在中間絲和核基質(zhì)上高表達(dá)
[15]，并且eIF6還可以調(diào)節(jié)Wnt信號(hào)通路中的β -聯(lián)蛋白的表達(dá)，從而影響細(xì)胞骨架[25]。
[0018]3)與腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移的關(guān)系:有實(shí)驗(yàn)證實(shí)eIF6作為翻譯調(diào)節(jié)因子參與了細(xì)胞的增殖。在對(duì)分化誘導(dǎo)前后的肝癌細(xì)胞核基質(zhì)成分進(jìn)行亞細(xì)胞蛋白組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，eIF6在分化后的細(xì)胞中高表達(dá)，提示可能參與癌細(xì)胞分化[26]。eIF6在正常粘膜細(xì)胞可以檢測(cè)到，但是在癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)，如在結(jié)直腸癌中eIF6的表達(dá)上調(diào)[27]，并且在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中尤為明顯[28]，故而提示eIF6的高表達(dá)可能參與了腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移。
[0019]從上面可以看出，eIF6在核糖體合成、細(xì)胞骨架以及腫瘤的增殖分化和轉(zhuǎn)移中具有重要的作用，但是目前對(duì)于eIF6蛋白的相關(guān)文獻(xiàn)較少，尤其是對(duì)于其與學(xué)習(xí)記憶功能的關(guān)系和在對(duì)抗記憶力減退或記憶障礙方面的作用還未見報(bào)道。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0020]本發(fā)明人通過(guò)大量的實(shí)驗(yàn)，出人意料地發(fā)現(xiàn):eIF6敲基因小鼠有較強(qiáng)平衡能力和抗疲勞傾向，同時(shí)eIF6對(duì)中樞的記憶力具有負(fù)調(diào)控作用，可以增強(qiáng)大腦皮層及海馬突觸后神經(jīng)元中谷氨酸受體的表達(dá)?；谠摪l(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的目的提供一種在體外培養(yǎng)細(xì)胞中篩選有效抑制大腦eIF6基因表達(dá)的核酸抑制分子的方法(在本文中有時(shí)簡(jiǎn)稱“本發(fā)明的方法”)，并且通過(guò)該方法篩選出可以有效抑制大腦eIF6基因表達(dá)的核酸抑制分子(在本文中有時(shí)也稱為“eIF6抑制核酸分子”)，包括長(zhǎng)期抑制分子和瞬時(shí)抑制分子。
[0021]在本發(fā)明中，eIF6抑制核酸分子是指以eIF6核酸分子，優(yōu)選地以SEQID NO:2或3為靶序列的有效抑制eIF6基因表達(dá)的核酸分子(包括，但不限于，例如，反義核酸分子、小RNA(miRNA)、微小非編碼RNA(tncRNA)、小調(diào)節(jié)RNA(smRNA)、短干擾RNA(siRNA)等。通過(guò)本發(fā)明的方法篩選的核酸抑制分子還可以進(jìn)一步被包裝成病毒RNA干擾載體(下文也稱為“eIF6抑制性病毒RNA干擾載體”)或進(jìn)一步篩選出有效抑制eIF6基因表達(dá)的siRNA分子(下文中有時(shí)也稱為“本發(fā)明的siRNA分子”)。
[0022]在本發(fā)明中，β4整合素結(jié)合蛋白eIF6(下面簡(jiǎn)稱為“eIF6蛋白”)涵蓋具有SEQID NO:1所示的氨基酸序列、在SEQ ID NO:1的序列的基礎(chǔ)上發(fā)生1_3個(gè)氨基酸殘基保守置換的同源氨基酸序列或與SEQ ID NO:1的序列具有至少80%以上的同源性且能與β 4整合素，優(yōu)選α6β 4整合素特異性結(jié)合的氨基酸序列的多肽。因此，在本發(fā)明中當(dāng)提及eIF6蛋白時(shí)，并不僅僅特指具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的野生型eIF6蛋白本身，而是涵蓋上述eIF6蛋白的各種衍生物或同源物。“eIF6核酸分子”或“eIF6基因序列”涵蓋SEQID N0:2所示的eIF6基因核酸序列，與SEQ ID NO:2的序列具有至少80%以上同源性的核酸序列的核酸分子，所述eIF6核酸分子在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)可產(chǎn)生eIF6基因表達(dá)產(chǎn)物。
[0023]在本發(fā)明中，當(dāng)提及`“eIF6基因”時(shí)，其不限于鼠eIF6基因，而是泛指各種種屬來(lái)源的eIF6基因，因?yàn)樵谶M(jìn)化中，eIF6基因在真核細(xì)胞中是非常保守的。另外，在本發(fā)明中“eIF6蛋白”、“eIF6核酸分子”或“eIF6抑制核酸分子”的來(lái)源不限于鼠，還可以來(lái)自哺乳動(dòng)物，優(yōu)選人。
[0024]因此，在第一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種篩選有效抑制大腦中eIF6基因表達(dá)的eIF6核酸抑制分子的方法，該方法包括以下步驟:
[0025]I)將以eIF6基因序列(例如，SEQ ID NO:2所示核酸序列)為靶序列的長(zhǎng)度為20~40個(gè)，優(yōu)選21~27個(gè)核苷酸的候選eIF6核酸抑制分子包裝到帶有報(bào)告基因，例如螢光素酶基因、熒光蛋白基因，優(yōu)選綠色熒光蛋白、紅色熒光蛋白或黃色熒光蛋白基因的病毒表達(dá)載體中，形成病毒干擾載體；
[0026]2)將步驟I)中獲得的病毒干擾載體與體外培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞(所述成纖維細(xì)胞可以是市售的人皮膚成纖維細(xì)胞系，如BJ等等；也可以是取自與eIF6基因相同或不同來(lái)源的動(dòng)物的皮膚制成的原代或傳代培養(yǎng)細(xì)胞，如取自人皮膚瘢痕組織并培養(yǎng)的增生性瘢痕成纖維細(xì)胞)共孵育使得所述病毒干擾載體感染成纖維細(xì)胞；
[0027]3)觀察被感染的成纖維細(xì)胞中的報(bào)告基因表達(dá)產(chǎn)物(例如，突光)表達(dá)，將所述報(bào)告基因表達(dá)產(chǎn)物(例如，熒光)表達(dá)達(dá)到80%以上的細(xì)胞用于下一步篩選；[0028]4)提取步驟3)中篩選的報(bào)告基因表達(dá)產(chǎn)物表達(dá)(例如，熒光)達(dá)到80%以上的成纖維細(xì)胞的RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以SEQ ID NO: 11、12、13、14作為引物以反轉(zhuǎn)錄的cDNA作為模板，通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)(例如，實(shí)時(shí)熒光定量PCR)檢測(cè)eIF6mRNA的表達(dá)；
[0029]5)將與陰性對(duì)照病毒載體感染的成纖維細(xì)胞相比eIF6mRNA表達(dá)相比減少50%以上的候選eIF6核酸抑制分子作為初始篩選分子；
[0030]6)將包裝有步驟5)中確定的初始篩選分子的病毒干擾載體感染小鼠48小時(shí)，采用Western Blot檢測(cè)小鼠腦中突觸后神經(jīng)元的谷氨酸受體蛋白NMDAR的表達(dá)量，若NMDAR的表達(dá)量與野生型小鼠相比升高30%以上，則所述初始篩選分子被確定為有效抑制eIF6基因表達(dá)的eIF6核酸抑制分子。
[0031]在本發(fā)明中，候選eIF6抑制核酸分子的設(shè)計(jì)可以采用以下的思路:
[0032]I)從轉(zhuǎn)錄本(mRNA) (NM_002212.3，eIF6 mRNA剪切本I)的ATG起始密碼開始，尋找第一個(gè)“AA”二連序列，并記下其3'端的19個(gè)堿基序列，作為潛在的eIF6抑制核酸分子靶位點(diǎn)。有研究結(jié)果顯示GC含量在30% -50%左右的eIF6抑制核酸分子要比那些GC含量偏高的更為有效。在設(shè)計(jì)eIF6抑制核酸分子時(shí)不要針對(duì)5'和3'端的非編碼區(qū)；
[0033]2)將潛在的序列和相應(yīng)的基因組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較，排除那些和其他編碼序列/EST同源的序列；
[0034]3)選出合適的目標(biāo)序列進(jìn)行合成，從而得到候選eIF6抑制核酸分子。
[0035]在第二個(gè)方面，本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種篩選瞬時(shí)抑制大腦eIF6基因表達(dá)的siRNA分子的方法，該方法包 括以下步驟:
[0036]I)將上述初始篩選分子通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的方式轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞，將轉(zhuǎn)染的海馬神經(jīng)元細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)72小時(shí)；
[0037]2)提取步驟I)中被轉(zhuǎn)染的海馬神經(jīng)元細(xì)胞的蛋白，通過(guò)western blot技術(shù)檢測(cè)eIF6蛋白的表達(dá)；
[0038]3)將與陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染的海馬神經(jīng)元細(xì)胞中eIF6蛋白表達(dá)相比減少30%以上的海馬神經(jīng)元細(xì)胞所對(duì)應(yīng)的候選eIF6核酸抑制分子確定為瞬時(shí)抑制eIF6基因表達(dá)的siRNA分子。
[0039]在本發(fā)明的方法中，病毒表達(dá)載體可選自慢病毒載體或腺病毒載體。
[0040]在第三個(gè)方面，本發(fā)明提供了根據(jù)本發(fā)明上述方法篩選的eIF6核酸抑制分子，其長(zhǎng)度為20~40個(gè)，優(yōu)選21~27個(gè)核苷酸。
[0041]在第四個(gè)方面，本發(fā)明涉及包含eIF6核酸抑制分子的病毒干擾載體，所述病毒選自腺病毒載體或慢病毒載體。
[0042]在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，上述eIF6核酸抑制分子或siRNA分子包含SEQID NO:3-8,15-16中任一個(gè)所不的序列。
[0043]在第五個(gè)方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明的eIF6核酸抑制分子或siRNA分子在制備用于治療和/或預(yù)防運(yùn)動(dòng)性疲勞和/或記憶力減退的藥物中的用途。
[0044]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，運(yùn)動(dòng)性疲勞是由突觸后神經(jīng)元的谷氨酸受體表達(dá)增加介導(dǎo)的。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，記憶力減退是由于海馬功能受損相關(guān)的疾病或功能障礙引起的。
[0045]在本發(fā)明中，本發(fā)明的eIF6核酸抑制分子或siRNA分子可以用于預(yù)防和/或治療選自下列的因素、疾病、疾病狀態(tài)或功能障礙:慢性疲勞綜合征、衰老、抑郁癥、腦部腫瘤、糖尿病、阿爾茲海默病、帕金森病、腦動(dòng)脈硬化、慢性鼻竇炎、老年癡呆癥、匹克氏病(Pick’ sdisease)、亨廷頓病、肝豆?fàn)詈俗冃?、精神分裂癥或癲癇、神經(jīng)退行性疾病、睡眠障礙、慢性酒精中毒酒精中毒、甲狀腺功能低下和神經(jīng)性梅毒。
[0046]本發(fā)明的eIF6抑制性病毒RNA干擾載體或siRNA分子還可以與適宜的一種或多種藥用載體一起制成藥物組合物。
[0047]在第六個(gè)方面，本發(fā)明還涉及一種藥物組合物，其包含與遞送載體結(jié)合的本發(fā)明的eIF6核酸抑制分子或病毒干擾載體,和任選的一種或多種藥用載體,其中所述遞送載體選自膽固醇、納米顆粒、聚乙烯亞胺、魚精蛋白、陽(yáng)離子多肽、殼聚糖或脂質(zhì)體。為了增加核酸的使用效果，還可輔以專用的穩(wěn)定劑和特異性免疫增強(qiáng)劑。
[0048]本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該 理解，本發(fā)明的eIF6抑制性病毒RNA干擾載體或siRNA分子或包含它們的藥物組合物優(yōu)選地可以通過(guò)局部定向給藥，尤其是腦室內(nèi)給藥(根據(jù)需要還可以海馬局部給藥)，靜脈內(nèi)注射、輸注，肌內(nèi)注射，還更優(yōu)選通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的靶向遞送方式給藥。
[0049]在本發(fā)明中，eIF6抑制性慢病毒RNA干擾載體可以用于長(zhǎng)期敲降eIF6基因，適合長(zhǎng)期給藥以治療無(wú)法通過(guò)臥床休息而緩解的長(zhǎng)期嚴(yán)重疲勞，如慢性疲勞綜合征；以及與記憶力減退或記憶障礙相關(guān)的疾病或疾病狀態(tài)。
[0050]本發(fā)明的siRNA分子可用于短期施用，以暫時(shí)緩解、減輕或消除運(yùn)動(dòng)性中樞疲勞癥狀，諸如軀體性疲勞癥狀如肌肉運(yùn)動(dòng)能力下降(由于長(zhǎng)時(shí)間運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練導(dǎo)致)，和心理性疲勞癥狀如情緒低迷、注意力不集中、失眠、精力不濟(jì)等；以及記憶力減退或記憶障礙的癥狀。換句話說(shuō)，本發(fā)明的siRNA分子可用于短期對(duì)癥治療。
[0051]本領(lǐng)域技術(shù)人員通過(guò)常規(guī)試驗(yàn)?zāi)軌蚍謩e確定eIF6抑制性病毒RNA干擾載體或siRNA分子或包含它們的藥物組合物的劑量水平(例如，I μ g~100mg/kg體重)。應(yīng)該理解，關(guān)于任何具體受試者的具體劑量水平依賴于多種因素，包括受試者的年齡、體重、一般健康狀態(tài)、性別、飲食、施用時(shí)間、施用途徑和排泄率、藥物聯(lián)合和疾病的嚴(yán)重性等。此外，eIF6抑制性病毒RNA干擾載體或siRNA分子或包含它們的藥物組合物還可以與其記憶力減退抑制劑或記憶增強(qiáng)劑同時(shí)、或間隔一定時(shí)間聯(lián)合給藥。
[0052]本發(fā)明的有益效果:
[0053]1.本發(fā)明通過(guò)Morris (Morris water maze,MWM)水迷宮系統(tǒng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)eIF6敲基因小鼠有較強(qiáng)學(xué)習(xí)和空間定位能力。
[0054]2.通過(guò)免疫組織化學(xué)方法顯示，eIF6蛋白在大腦皮層、海馬及其周邊組織的神經(jīng)元和神經(jīng)節(jié)中的過(guò)度表達(dá)與記憶力下降或記憶障礙有關(guān)，而eIF6蛋白的低表達(dá)則具有明顯增強(qiáng)學(xué)習(xí)記憶作用。
[0055]3.通過(guò)轉(zhuǎn)棒式疲勞儀測(cè)試，發(fā)現(xiàn)eIF6敲基因小鼠有較強(qiáng)平衡能力和抗疲勞傾向，提示敲基因小鼠有較強(qiáng)延緩疲勞出現(xiàn)能力。
[0056]4.基于本發(fā)明的發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明人利用海馬神經(jīng)元細(xì)胞通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄定量PCR等技術(shù)篩選出了特異性抑制eIF6基因表達(dá)的病毒RNA干擾載體和siRNA分子。本發(fā)明的病毒RNA干擾載體和siRNA分子可以用于對(duì)抗疲勞和/或記憶力減退的癥狀及其相關(guān)疾病或功能障礙。[0057]5.eIF6基因在真核細(xì)胞中序列高度保守。通過(guò)clustalw2序列比對(duì)顯示，發(fā)現(xiàn)eIF6基因在真核細(xì)胞中序列高度保守。人與小鼠eIF6氨基酸序列有98%同源性(見圖
8)，人和小鼠eIF6核苷酸序列高度保守，有91%同源性(見圖9)。因此可以預(yù)期，各種真核來(lái)源的eIF6蛋白或eIF6核酸分子均可以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0058]從下面結(jié)合附圖的詳細(xì)描述中，本發(fā)明的上述特征和優(yōu)點(diǎn)將更明顯，其中:
[0059]圖1.野生型和eIF6敲基因鼠曠場(chǎng)測(cè)試。A:小鼠在曠場(chǎng)中央?yún)^(qū)域停留時(shí)間。B:小鼠在曠場(chǎng)中央?yún)^(qū)域走過(guò)路程。C:小鼠在曠場(chǎng)中30分鐘內(nèi)跳躍次數(shù)。D:小鼠在曠場(chǎng)中走過(guò)的總路程。10-12周雄性小鼠，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物野生型12只，敲基因小鼠13只，*p < 0.05，**p
<0.01。
[0060]圖2.野生型和eIF6敲基因鼠在轉(zhuǎn)棒式疲勞儀停留時(shí)間。A:單只小鼠在疲勞儀停留時(shí)間分布。B:野生型和敲基因小鼠在疲勞儀上平均停留時(shí)間。8-10周雄性小鼠，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物野生型12只，敲基因小鼠13只，*p < 0.05，**p < 0.01。
[0061]圖3.野生型和eIF6敲基因鼠水迷宮測(cè)試。A:小鼠水迷宮中潛伏期。B:小鼠在目標(biāo)象限停留時(shí)間百分比。C:小鼠水迷宮中游泳總路程。D:小鼠水迷宮中平均游泳速度。10-12周雄性小鼠，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物野生型12只，敲基因小鼠13只，*p < 005，**p < 0.01。
[0062]圖4.野生型和eIF6敲基因在水迷宮中空間搜索策略。A:野生型小鼠在水迷宮中的空間搜索策略。B:敲基因小鼠在水迷宮中的空間搜索策略。
[0063]圖5.免疫組織化學(xué)檢測(cè)eIF6基因在小鼠大腦內(nèi)表達(dá)情況。A:eIF6在小鼠海馬中表達(dá)情況。B:eIF6在大腦皮層中表達(dá)。C:海馬中eIF6表達(dá)放大圖。D:大腦皮層中eIF6表達(dá)放大圖。
[0064]圖6.免疫組織化學(xué)檢測(cè)eIF6基因在海馬表達(dá)。A:eIF6在小鼠大腦海馬中表達(dá)情況。B:eIF6在CA區(qū)中表達(dá)。C:eIF6在DG區(qū)中表達(dá)。D:海馬CA區(qū)中eIF6亞細(xì)胞定位情況。
[0065]圖7.大腦海馬區(qū)和非海馬區(qū)不同的蛋白表達(dá)。Hippo:海馬組織，non-hippo:除海馬的大腦組織，WT:野生型小鼠，ko:敲基因型小鼠。
[0066]圖8.小鼠與人eIF6氨基酸序列同源性比對(duì)。黑色表示匹配，灰色表示不匹配。Homo:人類Mus:小鼠。
[0067]圖9.小鼠與人eIF6核苷酸序列同源性比對(duì)。黑色表示匹配，灰色表示不匹配。Homo:人類Mus:小鼠。
[0068]圖10.篩選eIF6基因干擾用的有效慢病毒干擾載體。1#、2#和3#分別表示慢病毒-FIV-Hl/U6-copGFP-1TGB4BPRNAil#、2#、3#。
[0069]圖11.pFIV-Hl/U6_copGFP 質(zhì)粒圖譜。
[0070]圖12.A.小鼠eIF6蛋白的氨基酸序列和B.小鼠eIF6基因序列。
【具體實(shí)施方式】
[0071]術(shù)語(yǔ)定義
[0072]記憶力減退:在本發(fā)明中，記憶力減退除與衰老相關(guān)的記憶力下降以外，還包括由心理因素和/或軀體器質(zhì)性病變引起的記憶力下降。與記憶力下降有關(guān)的疾病或疾病狀態(tài)如神經(jīng)退行性疾病、睡眠障礙、腦動(dòng)脈硬化、慢性鼻竇炎、慢性酒精中毒、腦部腫瘤、糖尿病、酒精中毒、甲狀腺功能低下或神經(jīng)性梅毒等。同時(shí)長(zhǎng)期處于社會(huì)壓力大、抑郁、自卑、焦慮等心理狀態(tài)時(shí)也會(huì)引起記憶障礙。記憶力下降常常令病人陷入焦慮和緊張狀態(tài)，而抑郁也是造成病人注意力不集中的原因，表現(xiàn)為注意力下降。
[0073]記憶障礙(Impaired Memory):指?jìng)€(gè)體處于一種不能記住或回憶信息或技能的狀態(tài)，有可能是由于病理生理性的或情境性的原因引起的永久性或暫時(shí)性的記憶障礙。在本發(fā)明中，當(dāng)指?jìng)€(gè)體的記憶力狀態(tài)或臨床表現(xiàn)時(shí)，記憶力減退和記憶障礙兩個(gè)術(shù)語(yǔ)可以互換使用。
[0074]疾病狀態(tài):是指具有相關(guān)疾病的癥狀或功能障礙表現(xiàn)，但可能具有或不具有相關(guān)器官器質(zhì)性病變的狀態(tài)。
[0075]與海馬功能受損相關(guān)的疾病或功能障礙:原發(fā)或繼發(fā)引起的海馬神經(jīng)元器質(zhì)性病變(例如，死亡)和/或功能紊亂而導(dǎo)致海馬暫時(shí)或永久性功能受損的各種病因諸如創(chuàng)傷、器官萎縮、應(yīng)激或其他有害刺激、中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性或進(jìn)行性疾病或綜合征(例如，神經(jīng)退行性疾病如阿爾茲海默病，大腦認(rèn)知功能進(jìn)行性退化綜合征如老年癡呆癥等)、生理性過(guò)程(例如，衰老、睡眠障礙等)或其他疾病(例如，糖尿病、抑郁癥等)等。
[0076]負(fù)對(duì)照:在本發(fā)明中，作為負(fù)對(duì)照的eIF6核酸抑制分子與選中的siRNA序列有相同的組成，但是和mRNA沒有明顯的同源性。在具體實(shí)驗(yàn)中將選中的eIF6核酸抑制分子打亂作為負(fù)對(duì)照，同樣要檢查結(jié)果以保證它和其他基因沒有同源性。
[0077]篩選用細(xì)胞系:在本發(fā)明中為盡可能使實(shí)驗(yàn)結(jié)果接近于臨床應(yīng)用，我們選擇敲降eIF6人源序列。然而人海馬神經(jīng)元元代分離取材有限制。為了克服這一困難，我們?cè)诔醪胶Y選實(shí)驗(yàn)中采用相對(duì)較易取材的瘢痕成纖維細(xì)胞系(可以采用采集自臨床標(biāo)本的細(xì)胞培養(yǎng)物，也可以采用市售的人或動(dòng)物成纖維細(xì)胞系)作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，體外檢測(cè)eIF6慢病毒敲降結(jié)果。由于eIF6高度保守，在不同組織中廣泛表達(dá)，在瘢痕組織成纖維細(xì)胞中取得的結(jié)果，特別是采用病毒干擾載體的長(zhǎng)期敲降，也完全適用于海馬神經(jīng)元細(xì)胞中。在獲得初步篩選結(jié)果后，為保證進(jìn)一步篩選更有效的瞬時(shí)敲降的siRNA分子，則采用從小鼠分離的海馬神經(jīng)元細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。
[0078]以下通過(guò)實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步闡明本發(fā)明。但是應(yīng)該理解，所述實(shí)施例只是舉例說(shuō)明的目的，并不意欲限制本發(fā)明的范圍和精神。
[0079]本發(fā)明所用的實(shí)驗(yàn)儀器和材料及其來(lái)源如下:
[0080]
【權(quán)利要求】
1.一種篩選有效抑制大腦eIF6基因表達(dá)的eIF6核酸抑制分子的方法，該方法包括以下步驟: 1)將以eIF6基因序列為靶序列的長(zhǎng)度為20~40個(gè)，優(yōu)選21~27個(gè)核苷酸的候選eIF6核酸抑制分子包裝到帶有報(bào)告基因的病毒表達(dá)載體中，形成病毒干擾載體； 2)將步驟I)中獲得的病毒干擾載體與體外培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞共孵育使得所述病毒干擾載體感染成纖維細(xì)胞； 3)觀察被感染的成纖維細(xì)胞中的報(bào)告基因表達(dá)產(chǎn)物表達(dá)，將所述報(bào)告基因表達(dá)產(chǎn)物表達(dá)達(dá)到80%以上的細(xì)胞用于下一步篩選； 4)提取步驟3)中篩選的報(bào)告基因表達(dá)產(chǎn)物表達(dá)達(dá)到80%以上的成纖維細(xì)胞的RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以SEQ ID NO:11、12、13、14作為引物以反轉(zhuǎn)錄的cDNA作為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)eIF6mRNA的表達(dá)； 5)將與陰性對(duì)照病毒載體感染的成纖維細(xì)胞相比eIF6mRNA表達(dá)相比減少50%以上的候選eIF6核酸抑制分子作為初始篩選分子； 6)將包裝有步驟5)中確定的初始篩選分子的病毒干擾載體感染小鼠48小時(shí)，采用Western Blot檢測(cè)小鼠大腦中突觸后神經(jīng)元的谷氨酸受體蛋白NMDAR的表達(dá)量，若NMDAR的表達(dá)量與野生型小鼠相比升高30 %以上，則所述初始篩選分子被確定為有效抑制eIF6基因表達(dá)的eIF6核酸抑制分子。
2.一種篩選瞬時(shí)抑制大腦eIF6基因表達(dá)的SiRNA分子的方法，該方法包括以下步驟: 1)將權(quán)利要求1中篩選的初 始篩選分子通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的方式轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞，將轉(zhuǎn)染的海馬神經(jīng)元細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)72小時(shí)； 2)提取步驟I)中被轉(zhuǎn)染的海馬神經(jīng)元細(xì)胞的蛋白，通過(guò)westernblot技術(shù)檢測(cè)eIF6蛋白的表達(dá)； 3)將與陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染的海馬神經(jīng)元細(xì)胞中eIF6蛋白表達(dá)相比減少30%以上的海馬神經(jīng)元細(xì)胞所對(duì)應(yīng)的候選eIF6核酸抑制分子確定為瞬時(shí)抑制eIF6基因表達(dá)的siRNA分子。
3.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述病毒表達(dá)載體為慢病毒載體或腺病毒載體。
4.一種有效抑制大腦eIF6基因表達(dá)的eIF6核酸抑制分子，其是根據(jù)權(quán)利要求1_3中任一項(xiàng)所述的方法篩選的eIF6核酸抑制分子或siRNA分子，所述eIF6核酸抑制分子或siRNA分子的長(zhǎng)度為20~40個(gè)，優(yōu)選21~28個(gè)核苷酸。
5.包含權(quán)利要求4所述的eIF6核酸抑制分子的病毒干擾載體，所述病毒選自腺病毒載體或慢病毒載體。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的eIF6核酸抑制分子或siRNA分子，其特征在于所述eIF6核酸抑制分子或siRNA分子包含SEQ ID NO:3_8，15-16中任一個(gè)所示的序列。
7.一種藥物組合物，其包含與遞送載體結(jié)合的權(quán)利要求4-6中任一項(xiàng)所述的eIF6核酸抑制分子或病毒干擾載體，和任選的一種或多種藥用載體，其中所述遞送載體選自膽固醇、納米顆粒、聚乙烯亞胺、魚精蛋白、陽(yáng)離子多肽、殼聚糖或脂質(zhì)體。
8.根據(jù)權(quán)利要求4-7中任一項(xiàng)所述的eIF6核酸抑制分子或siRNA分子或藥物組合物在制備用于治療和/或預(yù)防運(yùn)動(dòng)性疲勞和/或記憶力減退的藥物中的用途。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的用途，其特征所述藥物用于預(yù)防和/或治療選自下列的疾病或功能障礙:慢性疲勞綜合征、衰老、抑郁癥、腦部腫瘤、糖尿病、阿爾茲海默病、帕金森病、腦動(dòng)脈硬化、慢性鼻竇炎、老年癡呆癥、匹克氏病(Pick’s disease)、亨廷頓病、肝豆?fàn)詈俗冃?、精神分裂癥或癲癇、神經(jīng)退行性疾病、睡眠障礙、慢性酒精中毒酒精中毒、甲狀腺功能低下和神經(jīng)性梅毒。`
【文檔編號(hào)】A61P35/00GK103525900SQ201210234087
【公開日】2014年1月22日 申請(qǐng)日期:2012年7月6日 優(yōu)先權(quán)日:2012年7月6日
【發(fā)明者】崔艷艷, 吳軍, 羅高興, 桂莉, 譚江琳, 賀偉峰 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院