專利名稱：一種制備含重組人血管內(nèi)皮抑制素的多孔凝膠的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種制備含重組人血管內(nèi)皮抑制素的多孔聚(N-異丙基丙烯酰胺)凝膠的方法。
背景技術(shù)：
隨著國內(nèi)生物技術(shù)和藥學(xué)的發(fā)展，原位凝膠在一些難以用傳統(tǒng)給藥方式給藥的不穩(wěn)定藥物以及長效控釋制劑、靶向定位制劑方面展示了優(yōu)勢。原位凝膠能夠以液體狀態(tài)自由加載各種性質(zhì)及分子量的藥物。此外，多樣化的膠凝機(jī)制為設(shè)計不同途徑的藥物傳遞系統(tǒng)提供了豐富的選擇，特別是溫度響應(yīng)性水凝膠，通過調(diào)整水凝膠的體積相變溫度或?qū)λz進(jìn)行改性使其對某一生理現(xiàn)象敏感，從而實現(xiàn)靶向給藥的目的。 溫度響應(yīng)性水凝膠結(jié)構(gòu)中具有一定比例的親水和疏水基團(tuán)，溫度的變化可以影響這些基團(tuán)的疏水相互作用或大分子鏈間的氫鍵作用，從而改變水凝膠的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生體積相變。聚N-異丙基丙烯酰胺(PNIPAM)水凝膠是最常用的溫敏高分子，它在32°C左右有一個最低臨界溶解溫度(LCST)。在此溫度附近PNIPAM水凝膠表現(xiàn)出不連續(xù)的可逆的相轉(zhuǎn)變。當(dāng)體系溫度高于LCST時，水凝膠表面會發(fā)生收縮，導(dǎo)致水化層收縮，形成薄的致密皮層，阻止內(nèi)部水分或溶質(zhì)向外釋放；當(dāng)溫度低于LCST時，表面皮層溶脹吸水。通過在凝膠的骨架中引入不同親、疏水基團(tuán)以改變凝膠網(wǎng)絡(luò)的親水/疏水比，而達(dá)到改變水凝膠的LCST的目的。凝膠溶脹或收縮過程主要是高分子網(wǎng)絡(luò)吸收或釋放溶劑，這是一個慢的擴(kuò)散過程，而且接近臨界點時更慢。但對于一個具有相互連接的孔結(jié)構(gòu)的網(wǎng)絡(luò)來說，溶劑的吸收或釋放通過孔由對流產(chǎn)生，這一過程比非孔凝膠中的擴(kuò)散過程快。因此，合成具有孔結(jié)構(gòu)的水凝膠可以提高其響應(yīng)速率。注射用重組人血管內(nèi)皮抑制素(恩度，Endostar)，是首個血管內(nèi)皮抑制素肺癌新藥。恩度目前的給藥方式是病人需要每天靜脈滴注一次，療程為14天，休息一周后，再繼續(xù)下一療程，治療費用高，患者依從性不佳。近期有研究發(fā)現(xiàn)動物體內(nèi)小劑量持續(xù)給予 Endostatin 的藥效要優(yōu)于間歇性給藥(Minoru Kuroiwa, et al. J. Pediatr. Surg.38:1499-1505, 2003; Oliver Kisker, et al. Cancer Res. 61:7669-7674,2001)。因此，將其開發(fā)成注射一次可以持續(xù)釋藥的長效制劑非常必要。制備注射用重組人血管內(nèi)皮抑制素的多孔聚(N-異丙基丙烯酰胺)凝膠，藥物在室溫下被吸收進(jìn)入溶脹的水凝膠內(nèi)，當(dāng)攜帶藥物的凝膠制劑進(jìn)入人體后，由于人體的溫度高于其體積相變溫度，導(dǎo)致凝膠收縮擠出藥物和溶劑，使藥物在體內(nèi)緩慢平穩(wěn)的釋放，延長藥物在體內(nèi)的半衰期，減少腫瘤病人每個療程的給藥次數(shù)，從每天靜脈滴注給藥一次改為1-2周給藥一次，提高了病人順應(yīng)性，降低了用藥的成本，具有良好的臨床療效和市場前景。同時為目前臨床恩度注射液的最佳給藥方式的確定提供理論和實踐的依據(jù)
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種可用作注射用重組人血管內(nèi)皮抑制素的多孔聚(N-異丙基丙烯酰胺)凝膠的制備方法。在智能水凝膠的實際應(yīng)用中，對其機(jī)械強(qiáng)度、低臨界溶解溫度、溶脹比、溶脹/退溶脹速率等往往有特定要求；此外，對于一些特殊的應(yīng)用，如大分子藥物的控制釋放，要求凝膠有較大的孔徑，有利于大分子藥物的負(fù)載和釋放。以碳酸鈣、聚乙二醇、硅膠為致孔劑也用于制備大孔PNIPAM凝膠。該凝膠制備過程在低溫及生理溫度條件下完成，不涉及高溫處理，這對于穩(wěn)定性差的大分子蛋白非常適合，有助于保持生物活性。本發(fā)明提出的一種可用作注射用重組人血管內(nèi)皮抑制素的多孔聚(N-異丙基丙烯酰胺)凝膠的制備方法，包括以下各步驟
將重組人血管內(nèi)皮抑制素、單體N-異丙基丙烯酰胺、海藻酸鈉、交聯(lián)劑及致孔劑溶于水中；其中所述的重組人血管內(nèi)皮抑制素為重組人血管內(nèi)皮抑制素Endostar，占水重量的59Γ15%;所述的單體N-異丙基丙烯酰胺占水重量的109Γ25%;所述的海藻酸鈉占水重量的O. 59Γ2. 5% ;所述的交聯(lián)劑為丙烯酰胺、亞甲基二丙烯酰胺、N-羥甲基丙烯酰胺、丙烯酸、甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯、雙丙烯酸聚乙二醇酯中的一種，占水重量的O. 259Tl% ;所述的致孔劑為L-精氨酸、氯化鈉、中鏈脂肪酸甘油脂中的一種，占水重量的59Γ15%。在上述水溶液中加入引發(fā)劑及促進(jìn)劑；其中所述的引發(fā)劑為過硫酸銨或過硫酸鉀，占水重量的O. 159ΓΟ. 65% ;所述的促進(jìn)劑為四甲基乙二胺或偏重亞硫酸鈉，占水重量的
O.159Π). 65%。密封，室溫反應(yīng)至形成凝膠。室溫優(yōu)選地為16 26°C，進(jìn)一步優(yōu)選地為18 25。。。將凝膠用水反復(fù)漂洗，除去未反應(yīng)單體。將凝膠置于35 40°C水中，優(yōu)選地為37°C水中，均勻收縮后，取出，真空干燥至恒重，即得含注射用重組人血管內(nèi)皮抑制素的多孔聚(N-異丙基丙烯酰胺)凝膠。本發(fā)明的優(yōu)點有
I、與微球等給藥系統(tǒng)相比，本發(fā)明中多孔聚(N-異丙基丙烯酰胺)凝膠的工藝路線簡單可行，成本低廉；制備條件溫和，可以避免制備過程中高溫的影響，對蛋白活性影響很小，載藥能力大。2、本發(fā)明得到的凝膠具有孔結(jié)構(gòu)，可以提高其響應(yīng)速率，可調(diào)控活性成分的釋放時間，使在體內(nèi)的釋放時間在7天 28天，甚至更長。


圖I凝膠掃描電鏡圖。其中(a)實施例一凝膠，(b)實施例二樣品1，(C)實施例二樣品2，Cd)實施例二樣品3。圖2凝膠累積釋放曲線圖。
具體實施例方式本發(fā)明通過以下實施例作更詳細(xì)的描述，但不能將其解釋為限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。實施例一將Ig重組人血管內(nèi)皮抑制素、I. 5g N-異丙基丙烯酰胺(NIPAM)單體、O. Ig海藻酸鈉和O. 05g丙烯酸溶于IOmL去離子水中，攪拌均勻，加入O. 02g過硫酸銨和O. 02g偏重亞硫酸鈉，密封，室溫下反應(yīng)48h后，取出凝膠用去離子水浸泡一周，每天換水以洗去未反應(yīng)的單體，將凝膠置于37°C去離子水中使其均勻收縮，真空干燥至恒重即得。實施例二
將重組人血管內(nèi)皮抑制素、NIPAM單體、海藻酸鈉、交聯(lián)劑和致孔劑溶于IOmL去離子水中，攪拌均勻，加入引發(fā)劑和促進(jìn)劑，密封，室溫下反應(yīng)48h后，取出凝膠用去離子水浸泡一周，每天換水以洗去未反應(yīng)的單體，將凝膠置于37°C去離子水中使其均勻收縮，真空干燥至恒重即得。反應(yīng)物組成及配比見表I。實施例三
將實施例一中的凝膠樣品及實施例二中的樣品1，樣品2和樣品3用冷凍干燥機(jī)除去水分，切取干燥后的小塊樣品表面經(jīng)噴金后，用掃描電子顯微鏡觀察(參見圖I)。未加入致 孔劑的凝膠表面致密，而加入致孔劑的凝膠表面形成孔洞。實施例四
取實施例二中的樣品I，樣品4，樣品7形成的凝膠分別置于37°C恒溫水浴震蕩器中，加入IOOmL磷酸鹽緩沖液PBS 7. 4。每個取樣點取釋放液2mL，同時補(bǔ)充同體積新鮮的磷酸緩沖液。釋放樣品中Endostar的含量用BCA法測定。用藥物的累積釋放百分率與釋藥時間作圖(參見圖2)。凝膠釋放時間可以調(diào)節(jié)為疒28天。表I制備凝膠的反應(yīng)物組成及配比
權(quán)利要求
1.一種制備含重組人血管內(nèi)皮抑制素的多孔聚(N-異丙基丙烯酰胺)凝膠的方法，其特征在于 步驟(I)將重組人血管內(nèi)皮抑制素、單體N-異丙基丙烯酰胺、海藻酸鈉、交聯(lián)劑及致孔劑溶于水中； 步驟(2)加入引發(fā)劑及促進(jìn)劑； 步驟(3)密封，室溫反應(yīng)至形成凝膠。
2.根據(jù)權(quán)利要求I中所述的制備方法，其特征在于形成的凝膠用水反復(fù)漂洗，除去未反應(yīng)單體；然后將凝膠置于溫度為T的水中，均勻收縮后，取出，真空干燥至恒重；所述T為35 40 °C。
3.根據(jù)權(quán)利要求2中所述的制備方法，其特征在于所述T為37°C。
4.根據(jù)權(quán)利要求I 3中任一項所述的制備方法，其特征在于所述的重組人血管內(nèi)皮抑制素為重組人血管內(nèi)皮抑制素Endostar,占步驟(I)水重量的5°/Γ 5%。
5.根據(jù)權(quán)利要求I 3中任一項所述的制備方法，其特征在于所述的單體N-異丙基丙烯酰胺占步驟(I)水重量的109Γ25%。
6.根據(jù)權(quán)利要求I 3中任一項所述的制備方法，其特征在于所述的海藻酸鈉占步驟(I)水重量的O. 5% 2. 5%O
7.根據(jù)權(quán)利要求I 3中任一項所述的制備方法，其特征在于所述的交聯(lián)劑選自丙烯酰胺、亞甲基二丙烯酰胺、N-羥甲基丙烯酰胺、丙烯酸、甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯、雙丙烯酸聚乙二醇酯中的一種，占步驟(I)水重量的O. 25°/Γ %。
8.根據(jù)權(quán)利要求I 3中任一項所述的制備方法，其特征在于所述的致孔劑選自L-精氨酸、氯化鈉、中鏈脂肪酸甘油脂中的一種，占步驟(I)水重量的59Γ15%。
9.根據(jù)權(quán)利要求I 3中任一項所述的制備方法，其特征在于所述的引發(fā)劑為過硫酸銨或過硫酸鉀，占步驟(I)水重量的O. 159ΓΟ. 65%。
10.根據(jù)權(quán)利要求I 3中任一項所述的制備方法，其特征在于所述的促進(jìn)劑為四甲基乙二胺或偏重亞硫酸鈉，占步驟(I)水重量的O. 159ΓΟ. 65%。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種可用作注射用重組人血管內(nèi)皮抑制素的多孔聚(N-異丙基丙烯酰胺)凝膠的制備方法。該方法包括將重組人血管內(nèi)皮抑制素、單體N-異丙基丙烯酰胺、海藻酸鈉、交聯(lián)劑及致孔劑溶于水中；加入引發(fā)劑及促進(jìn)劑；密封，室溫反應(yīng)至形成凝膠；將凝膠用水反復(fù)漂洗，除去未反應(yīng)單體；將凝膠置于水中，均勻收縮后，取出，真空干燥至恒重，即得含重組人血管內(nèi)皮抑制素的多孔聚(N-異丙基丙烯酰胺)凝膠。
文檔編號A61K9/00GK102895176SQ20121023503
公開日2013年1月30日 申請日期2012年7月9日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月9日
發(fā)明者許向陽, 李玲, 王青松, 劉春暉 申請人:江蘇先聲藥物研究有限公司