專利名稱：重組人血管內(nèi)皮抑制素脂質(zhì)微泡及其在制備超聲介導(dǎo)下抑制腫瘤血管生成的藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種抗腫瘤血管生成新制劑，具體而言，本發(fā)明制備一種重組人血管內(nèi)皮抑制素的脂質(zhì)微泡，能在超聲輻照使載藥微泡在腫瘤局部破裂釋放藥物，并且利用超聲生物效應(yīng)協(xié)同抑制腫瘤血管生成。
背景技術(shù)：
血管內(nèi)皮抑制素特異性作用于新生血管內(nèi)皮細(xì)胞，抑制其生長(zhǎng)和遷移，誘導(dǎo)凋亡，從而抑制血管生成。重組人血管內(nèi)皮抑制素(recombinant human endostatin, rh_ES)在血管內(nèi)皮抑制素N端添加了 9個(gè)氨基酸，使蛋白質(zhì)純度、穩(wěn)定性及生物活性均得到提高，已 經(jīng)應(yīng)用于臨床抗腫瘤。但由于rh-ES血漿半衰期短，臨床上需要每日靜脈注射給藥，操作麻煩。同時(shí)，由于缺乏對(duì)腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性，靜脈注射后僅極少部分藥物作用于腫瘤局部，療效有限，并可能發(fā)生心血管系統(tǒng)不良反應(yīng)。超聲波在生物組織傳播時(shí)會(huì)產(chǎn)生熱效應(yīng)、空化效應(yīng)、機(jī)械效應(yīng)等，使血管壁通透性增高，血流速度加快，并且增加細(xì)胞膜的通透性，促進(jìn)藥物進(jìn)入靶細(xì)胞內(nèi)。超聲微泡造影劑是一種良好的藥物或基因載體，藥物可通過(guò)包被、非共價(jià)結(jié)合、黏附于微泡表面或嵌入微泡膜中間等方式與微泡結(jié)合。聯(lián)合應(yīng)用微泡造影劑可增強(qiáng)超聲輻照產(chǎn)生的生物效應(yīng)，甚至使微血管破裂。目前研制的載藥超聲微泡粒徑多在微米級(jí)水平，無(wú)法通過(guò)血管內(nèi)皮間隙將藥物直接運(yùn)送到腫瘤細(xì)胞周?chē)?，難以達(dá)到真正的腫瘤靶向治療。rh-ES作用的靶點(diǎn)是血管內(nèi)皮細(xì)胞，制備成載藥微泡靜脈注射后，超聲輻照可使通過(guò)血循環(huán)到達(dá)腫瘤局部的載藥微泡破裂釋放出藥物，同時(shí)產(chǎn)生的生物效應(yīng)可使腫瘤微血管破裂，微循環(huán)障礙，釋放的藥物更容易保留在腫瘤局部，直接作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，發(fā)揮更強(qiáng)大的抗腫瘤血管生成作用，高效且安全。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種重組人血管內(nèi)皮抑制素的脂質(zhì)微泡及其制備方法，重組人血管內(nèi)皮抑制素的脂質(zhì)微泡能在超聲輻照使載藥微泡在腫瘤局部破裂釋放藥物，并且利用超聲生物效應(yīng)協(xié)同抑制腫瘤血管生成。本發(fā)明的另一目的是提供重組人血管內(nèi)皮抑制素脂質(zhì)微泡在制備超聲介導(dǎo)下抑制腫瘤血管生成的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的，所述的重組人血管內(nèi)皮抑制素脂質(zhì)微泡，由下述方法制備獲得的JfDSPE-PEG 2000-Biotin (二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-生物素)、DSPC (二酰基磷脂酰膽堿)以摩爾比1:0. 5-4分散于磷酸鹽緩沖液；通入惰性氣體，機(jī)械振蕩后加入親和素-抗生蛋白鏈菌素，抗生蛋白鏈菌素與DSPE-PEG2000-Biotin摩爾比為1:1-2,室溫孵育；加入生物素化重組人血管內(nèi)皮抑制素,所述親和素與生物素化重組人血管內(nèi)皮抑制素的摩爾比為1:1-2，室溫孵育后制備得攜重組人血管內(nèi)皮抑制素脂質(zhì)微泡。生物素化重組人血管內(nèi)皮抑制素的制備方法為生物素-N-羥基琥珀酰亞胺酯(BNHS-ester)為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品，250mg裝,分子量341. 38,用二甲基亞砜配制成Img/mL溶液配制。將BNHS-ester與重組人血管內(nèi)皮抑制素按摩爾比15 3溶解于pH8. 5的碳酸鹽緩沖液，4°C孵育24h，24h后加入等體積谷氨酸終止反應(yīng)，反應(yīng)液經(jīng)IOOOOrpm超濾離心20min，洗滌3次，得生物素化重組人血管內(nèi)皮抑制素。本發(fā)明所述的重組人血管內(nèi)皮抑制素脂質(zhì)微泡在制備超聲介導(dǎo)下抑制腫瘤血管生成的藥物中的應(yīng)用。所述的腫瘤為乳腺癌、肝癌、頭頸部腫瘤、胰腺癌、腎癌或前列腺癌。本發(fā)明所述的重組人血管內(nèi)皮抑制素脂質(zhì)微泡的制備方法，包括如下步驟將二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-生物素與二?；字Ｄ憠A以摩爾比1:0. 5-4分 散于磷酸鹽緩沖液；通入惰性氣體，機(jī)械振蕩后加入親和素，親和素與二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-生物素的摩爾比為1:1-2，室溫孵育；加入生物素化重組人血管內(nèi)皮抑制素，所述親和素與生物素化重組人血管內(nèi)皮抑制素的摩爾比為1:1-2,室溫孵育后制備得攜重組人血管內(nèi)皮抑制素脂質(zhì)微泡。所述的重組人血管內(nèi)皮抑制素脂質(zhì)微泡的制備方法，其特征在于親和素為抗生蛋白鏈菌素。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)為rh_ES作用的靶點(diǎn)是血管內(nèi)皮細(xì)胞，經(jīng)本發(fā)明制備成載藥微泡靜脈注射后，超聲輻照可使通過(guò)血循環(huán)到達(dá)腫瘤局部的載藥微泡破裂釋放出藥物，同時(shí)產(chǎn)生的生物效應(yīng)可使腫瘤微血管破裂，微循環(huán)障礙，釋放的藥物更容易保留在腫瘤局部，直接作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，發(fā)揮更強(qiáng)大的抗腫瘤血管生成作用，高效且安全；重組人血管內(nèi)皮抑制素的脂質(zhì)微泡聯(lián)合超聲輻照組具有較明顯的抑制腫瘤生長(zhǎng)作用，抑瘤率可達(dá)41. 3%，明顯優(yōu)于單純的重組人血管內(nèi)皮抑制素的脂質(zhì)微泡的抑制效果，因而只有重組人血管內(nèi)皮抑制素的脂質(zhì)微泡與超聲輻照協(xié)同作用才能獲得良好的效果，由此可見(jiàn)本發(fā)明的重組人血管內(nèi)皮抑制素脂質(zhì)微泡在制備超聲介導(dǎo)下抑制腫瘤血管生成的藥物中的應(yīng)用。


圖I為本發(fā)明的載藥微泡在熒光顯微鏡觀察見(jiàn)FITC標(biāo)記的載藥微泡發(fā)出綠色熒光的圖。圖2A本發(fā)明的載藥微泡超聲造影圖。圖2B SonoVue超聲造影圖。圖3為原代培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定圖。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例I.生物素化重組人血管內(nèi)皮抑制素的制備
生物素-N-羥基琥珀酰亞胺酯(BNHS-ester)為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品，250mg裝，分子量341. 38,用二甲基亞砜配制成lmg/mL溶液。將BNHS-ester與重組人血管內(nèi)皮抑制素按摩爾比15 3溶解于pH8. 5的碳酸鹽緩沖液，4°C孵育24h，24h后加入等體積谷氨酸終止反應(yīng)，反應(yīng)液經(jīng)IOOOOrpm超濾離心20min，洗滌3次，得生物素化重組人血管內(nèi)皮抑制素。2.攜rh-ES脂質(zhì)微泡的制備
將DSPE-PEG2000-Biotin與DSPC按摩爾比I: I分散于I毫升的pH 7. 40的磷酸鹽緩沖液；通入惰性氣體SF6，機(jī)械振蕩40s ;加入親和素(親和素DSPE-PEG2000-Biotin摩爾比為1:2),室溫孵育Ih ;加入步驟I制得的生物素化重組人血管內(nèi)皮抑制素(親和素生物素化重組人血管內(nèi)皮抑制素摩爾比為1:2),室溫孵育Ih,制備攜重組人血管內(nèi)皮抑制素脂質(zhì)微泡。上述的DSPE-PEG2000_Biotin為美國(guó)Avanti公司產(chǎn)品，二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-生物素，分子量3016. 81，IOOmg包裝。親和素為抗生蛋白鏈菌素。 DSPC為二?；字Ｄ憠A。2.載藥微泡的理化性質(zhì)測(cè)定
普通光學(xué)顯微鏡觀察載藥微泡呈圓形，分散良好；平均測(cè)定粒徑為(3.0±0.4) ym，不低于82. 4%的微泡直徑在2 7 ii m范圍內(nèi)；血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀測(cè)定微泡濃度約(5. 2±0. I) X IO8/mL ;酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)得每IO8微泡載藥量為(800 ±10. 5)ug ;熒光顯微鏡觀察見(jiàn)FITC標(biāo)記的載藥微泡發(fā)出綠色熒光，見(jiàn)圖1，因?yàn)樘峁┑暮诎讏D、所以顯示不出綠色熒光，但實(shí)際上是綠色熒光圖。3.載藥微泡體內(nèi)超聲造影檢查
取腹腔接種H22肝癌的小鼠I只，抽取腹水用生理鹽水稀釋成IXioVmL,小鼠右前肢根部皮下接種200 y L細(xì)胞懸液，建立小鼠肝癌皮下移植瘤模型；選取腫瘤最大徑約I. 5cm小鼠10只，分成載藥微泡組與SonoVue對(duì)照組，每組5只。抽取0. 2mL造影劑經(jīng)尾靜脈快速團(tuán)注造影，脫機(jī)啟動(dòng)Syngo US Workplace軟件,建立腫瘤時(shí)間-強(qiáng)度曲線,測(cè)量始增時(shí)間AT、達(dá)峰時(shí)間TTP和峰值基礎(chǔ)強(qiáng)度差PBD。
結(jié)果，小鼠腫瘤先從周邊迅速?gòu)?qiáng)化，繼而向腫瘤實(shí)質(zhì)充填式快速?gòu)?qiáng)化，載藥微泡和SonoVue超聲造影表現(xiàn)相似；二者的超聲造影時(shí)間_強(qiáng)度曲線相似，見(jiàn)圖2A、圖2B，造影參數(shù)AT、TTP及PBD差異無(wú)顯著性意義，見(jiàn)表I。表I載藥微泡和SonoVue超聲造影的TIC參數(shù)比較
權(quán)利要求
1.一種重組人血管內(nèi)皮抑制素脂質(zhì)微泡，由下述方法制備獲得的UfDSPE-PEG2000-Biotin與DSPC以摩爾比1:0. 5-4分散于磷酸鹽緩沖液；通入惰性氣體，機(jī)械振蕩后加入抗生蛋白鏈菌素，抗生蛋白鏈菌素與DSPE-PEG2000-Biotin的摩爾比為1:1_2，室溫孵育；加入生物素化重組人血管內(nèi)皮抑制素，所述的抗生蛋白鏈菌素與生物素化重組人血管內(nèi)皮抑制素的摩爾比為1:1-2，室溫孵育后制備得攜重組人血管內(nèi)皮抑制素脂質(zhì)微泡。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的重組人血管內(nèi)皮抑制素脂質(zhì)微泡，其特征在于所述的生物素化重組人血管內(nèi)皮抑制素由如下方法制得將生物素-N-羥基琥珀酰亞胺酯與重組人血管內(nèi)皮抑制素按摩爾比15 3溶解于pH8. 5的碳酸鹽緩沖液，4°C孵育24h后加入等體積谷氨酸終止反應(yīng)，反應(yīng)液經(jīng)IOOOOrpm超濾離心20min，洗滌3次，得生物素化重組人血管內(nèi)皮抑制素。
3.權(quán)利要求I或2所述的重組人血管內(nèi)皮抑制素脂質(zhì)微泡在制備超聲介導(dǎo)下抑制腫瘤血管生成的藥物中的應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于腫瘤為乳腺癌、肝癌、頭頸部腫瘤、胰腺癌、腎癌或前列腺癌。
5.權(quán)利要求I或2所述的重組人血管內(nèi)皮抑制素脂質(zhì)微泡的制備方法，包括如下步驟將二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-生物素與二?；字Ｄ憠A以摩爾比1:0. 5-4分散于磷酸鹽緩沖液；通入惰性氣體，機(jī)械振蕩后加入親和素，親和素與二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-生物素的摩爾比為1:1-2，室溫孵育；加入生物素化重組人血管內(nèi)皮抑制素，所述親和素與生物素化重組人血管內(nèi)皮抑制素的摩爾比為1:1-2,室溫孵育后制備得攜重組人血管內(nèi)皮抑制素脂質(zhì)微泡。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的重組人血管內(nèi)皮抑制素脂質(zhì)微泡的制備方法，其特征在于親和素為抗生蛋白鏈菌素。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種重組人血管內(nèi)皮抑制素脂質(zhì)微泡，由下述方法制備獲得的將DSPE-PEG2000-Biotin與DSPC以摩爾比1:0.5-4分散于磷酸鹽緩沖液；通入惰性氣體，機(jī)械振蕩后加入抗生蛋白鏈菌素，抗生蛋白鏈菌素與DSPE-PEG2000-Biotin的摩爾比為1:1-2，室溫孵育；加入生物素化重組人血管內(nèi)皮抑制素，所述的抗生蛋白鏈菌素與生物素化重組人血管內(nèi)皮抑制素的摩爾比為1:1-2，室溫孵育后制備得攜重組人血管內(nèi)皮抑制素脂質(zhì)微泡。所述的重組人血管內(nèi)皮抑制素脂質(zhì)微泡在制備超聲介導(dǎo)下抑制腫瘤血管生成的藥物中的應(yīng)用；抑瘤率可達(dá)41.3%，明顯優(yōu)于單純的重組人血管內(nèi)皮抑制素的脂質(zhì)微泡的抑制效果。
文檔編號(hào)A61K9/00GK102727893SQ20121023872
公開(kāi)日2012年10月17日 申請(qǐng)日期2012年7月10日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月10日
發(fā)明者張秀娟, 楊菁, 林禮務(wù), 薛恩生, 陳志奎 申請(qǐng)人:福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院