專利名稱：基于抑癌基因ndrg2提高乳腺癌化療敏感性的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于腫瘤的治療技術(shù)領(lǐng)域，涉及提聞化療敏感性的相關(guān)基因，特別涉及基于抑癌基因NDRG2提高乳腺癌化療敏感性的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
乳腺癌是女性最常見的腫瘤之一，發(fā)病率是女性罹患腫 瘤的首位，約占女性全身癌癥的1/4，嚴(yán)重威脅著女性的身體健康。乳腺癌的治療以手術(shù)治療結(jié)合化療、放療為主。目前，化學(xué)藥物仍是乳腺癌治療的常用方法，在乳腺癌的治療過程中發(fā)揮重要作用。但化療存在著敵我不分、副作用大、耐藥性較普遍等問題，嚴(yán)重制約著其臨床療效。阿霉素(Adr)是一種抗腫瘤抗生素，可抑制RNA和DNA的合成，對(duì)各種生長(zhǎng)周期的腫瘤細(xì)胞都有殺傷作用，是乳腺癌治療的一線藥物。其主要的毒性反應(yīng)有白細(xì)胞和血小板減少、脫發(fā)、心臟毒性、惡心、食欲減退等。這些毒副作用嚴(yán)重影響著阿霉素的臨床應(yīng)用效果。因此，發(fā)現(xiàn)新的化療敏感性相關(guān)基因可有效提高化療藥的臨床療效，并降低其毒副作用，成為提高化療敏感性的重要手段。NDRG2基因是一種已報(bào)道的抑癌基因，研究發(fā)現(xiàn)NDRG2在多種腫瘤組織中低表達(dá)或無表達(dá)，并且這種低表達(dá)與患者的不良預(yù)后密切關(guān)系。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決的問題在于提供基于抑癌基因NDRG2提高乳腺癌化療敏感性的應(yīng)用，抑癌基因NDRG2可提聞乳腺癌化療療效，為有效提聞乳腺癌的臨床療效提供新的藥物革巴標(biāo)選擇。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)抑癌基因NDRG2在制備抗乳腺癌的藥物的應(yīng)用。所述的藥物為與化療藥物聯(lián)合使用的藥物。抑癌基因NDRG2依賴于p53蛋白在乳腺癌細(xì)胞的表達(dá)。所述的藥物是促進(jìn)表達(dá)p53蛋白的乳腺癌細(xì)胞損傷的藥物。所述的藥物是促進(jìn)抑制表達(dá)p53蛋白的乳腺癌細(xì)胞的增殖的藥物。所述的藥物是促進(jìn)表達(dá)p53蛋白的乳腺癌細(xì)胞的凋亡的藥物。所述的P53蛋白為野生型的表達(dá)或者外源性的表達(dá)。抑癌基因NDRG2在制備提高乳腺癌化療敏感性的藥物的應(yīng)用。抑癌基因NDRG2通過表達(dá)載體或病毒載體轉(zhuǎn)染到乳腺癌細(xì)胞中。所述的乳腺癌細(xì)胞還進(jìn)行表達(dá)p53蛋白的表達(dá)載體的轉(zhuǎn)染。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果本發(fā)明提供的基于抑癌基因NDRG2提高乳腺癌化療敏感性的應(yīng)用，將抑癌基因NDRG2通過表達(dá)載體或病毒載體轉(zhuǎn)染到乳腺癌細(xì)胞中，結(jié)果表明抑癌基因NDRG2在能夠提高乳腺癌化療敏感性，從而可應(yīng)用相關(guān)藥物的制備
NDRG2促進(jìn)了 Adr誘導(dǎo)p53野生型乳腺癌細(xì)胞的DNA損傷能力，但在p53突變的MDA-MB-231細(xì)胞中，NDRG2的過表達(dá)卻不能促進(jìn)Adr導(dǎo)致的DNA損傷；當(dāng)將p53轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入P53突變的MDA-MB-231細(xì)胞中后，NDRG2依然能夠發(fā)揮相應(yīng)的作用；NDRG2提高了 Adr對(duì)p53野生型乳腺癌細(xì)胞的形態(tài)學(xué)損傷，在NDRG2高表達(dá)的MCF-7細(xì)胞系中不但微絨毛消失，而且可見凋亡小體，出現(xiàn)較明顯的空泡狀溶酶體，表現(xiàn)為較明顯的細(xì)胞凋亡中晚期的細(xì)胞特點(diǎn)；NDRG2提高了 Adr對(duì)p53野生型乳腺癌細(xì)胞的增殖抑制能力，同時(shí)檢測(cè)了 NDRG2表達(dá)對(duì)順鉬的敏感性，發(fā)現(xiàn)NDRG2也能提高藥物順鉬的化療敏感性；這表明NDRG2提高乳腺癌細(xì)胞化療敏感性是非具體化療藥物依賴性的。在p53野生型的乳腺癌細(xì)胞系MCF-7中，NDRG2促進(jìn)了 Adr誘導(dǎo)的p53野生型乳腺癌細(xì)胞的凋亡。


圖I為MCF-7細(xì)胞系包裝成功熒光顯微鏡觀察感染效率結(jié)果圖；圖2為MDA-MB-231細(xì)胞系包裝成功熒光顯微鏡觀察感染效率結(jié)果圖；圖3-1 3-2為NDRG2穩(wěn)定轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞系的表達(dá)鑒定結(jié)果圖；其中3_1為Real-time PCR檢測(cè)RNA水平的變化，3-2為Western blot檢測(cè)蛋白水平的變化；圖4-1 4-2為MDA-MB-231慢病毒穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系NDRG2表達(dá)鑒定結(jié)果圖；4_1為Real-time PCR檢測(cè)RNA水平的變化，4_2為Western blot檢測(cè)蛋白水平的變化；圖5為MCF-7細(xì)胞中不同Adr濃度導(dǎo)致的DNA損傷程度檢測(cè)結(jié)果圖；圖6為MDA-MB-231細(xì)胞中不同Adr濃度導(dǎo)致的DNA損傷程度檢測(cè)結(jié)果圖；圖7-1 7-2為MCF-7細(xì)胞系中不同濃度Adr應(yīng)激后NDRG2表達(dá)相關(guān)性檢測(cè)結(jié)果圖；7-1為Real-time PCR檢測(cè)RNA水平的變化，7_2為Western blot檢測(cè)蛋白水平的變化；圖8-1 8-2為不同濃度Adr處理MDA-MB231細(xì)胞后NDRG2表達(dá)相關(guān)性檢測(cè)結(jié)果圖； 圖9為MDA-MB231細(xì)胞應(yīng)激后不同時(shí)間點(diǎn)的NDRG2表達(dá)檢測(cè)結(jié)果圖；圖10為在MDA-MB231細(xì)胞中進(jìn)行p53基因補(bǔ)救實(shí)驗(yàn)檢測(cè)NDRG2基因表達(dá)檢測(cè)結(jié)果圖；圖11為不同時(shí)間點(diǎn)的Adr處理MCF-7細(xì)胞后的細(xì)胞損傷檢測(cè)結(jié)果圖；圖12為Adr處理MCF-7NDRG2穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系后細(xì)胞損傷程度檢測(cè)(圖中綠色點(diǎn)表示損傷后表達(dá)的YH2AX)；圖13為Western Blot檢測(cè)NDRG2可明顯增加Adr對(duì)MCF-7細(xì)胞的損傷程度(Y H2AX的表達(dá)量)；圖14為Western Blot檢測(cè)NDRG2不能增加Adr對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞的損傷程度；圖15為透射電鏡檢測(cè)MCF-7細(xì)胞中NDRG2過表達(dá)后細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變；圖16為透射電鏡檢測(cè)MDA-MB-231細(xì)胞中NDRG2過表達(dá)后細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變；圖17為MTT分析Adr誘導(dǎo)的MCF-7細(xì)胞增殖抑制；圖18為Edu染色分析Adr誘導(dǎo)的MCF-7細(xì)胞增殖抑制；
圖19為Edu染色分析順鉬誘導(dǎo)的MCF-7細(xì)胞增殖抑制；圖20為MTT分析Adr誘導(dǎo)的MDA-MB-231細(xì)胞增殖抑制；圖21為Edu分析Adr導(dǎo)致的MDA-MB-231細(xì)胞增殖抑制；圖22-1 2為MTT分析NDRG2腺病毒感染MDA-MB-231細(xì)胞后的細(xì)胞增殖狀態(tài)檢測(cè)；圖23為AnnexinV染色檢測(cè)Adr誘導(dǎo)的MCF-7細(xì)胞凋亡情況；圖24為TUNEL染色檢測(cè)Adr誘導(dǎo)的MCF-7細(xì)胞凋亡情況；圖25為AnnexinV染色檢測(cè)Adr誘導(dǎo)的MDA-MB-231細(xì)胞凋亡情況；
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圖26為TUNEL染色檢測(cè)Adr誘導(dǎo)的MDA-MB-231細(xì)胞凋亡情況。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，所述是對(duì)本發(fā)明的解釋而不是限定。I、NDRG2基因的表達(dá)載體的構(gòu)建及病毒包裝NDRG2 的表達(dá)載體構(gòu)建基于 Invitrogen 公司的 Gateway 系統(tǒng) pLenti6. 3/V5-DEST載體。首先利用分子克隆技術(shù)將NDRG2克隆至入門載體pENTR-3C(通過BamH I和EcoR I位點(diǎn)進(jìn)行克隆)，隨后利用LR重組酶將NDRG2重組至pLenti6. 3/V5-DEST載體，得到Plenti6. 3-NDRG2載體，經(jīng)DNA測(cè)序驗(yàn)證載體中的NDRG2基因序列正確。2、建立NDRG2高表達(dá)的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株分別選用乳腺癌細(xì)胞MCF-7、MDA-MB-231作為目標(biāo)細(xì)胞，在親本細(xì)胞中分別用藥物Blasticidin S處理(殺稻瘟菌素)，篩選合適的藥物濃度。殺稻瘟菌素是一種從鏈霉素中分離的核苷類選擇試劑，具有很強(qiáng)的翻譯抑制作用，對(duì)多數(shù)真核細(xì)胞具有增殖抑制作用。而穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Plenti6. 3-NDRG2載體的細(xì)胞具有抗性，能夠存活，可以在2周左右獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。按Lipofectamine2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染說明書將Plenti6. 3-NDRG2重組質(zhì)粒和病毒包裝質(zhì)粒(PMD2G、pSPAX2)共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞包裝慢病毒，6小時(shí)后更換培養(yǎng)液，約48小時(shí)后收
取慢病毒。將收取的慢病毒原液用0. 45 y m過濾器過濾并進(jìn)行分裝。利用慢病毒分別感染MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞，48小時(shí)后利用8 y g/mL的Blasticidin S篩選細(xì)胞，過表達(dá)NDRG2的細(xì)胞將繼續(xù)存活。篩選約I月左右，細(xì)胞穩(wěn)定生長(zhǎng)并且狀態(tài)良好后，大量擴(kuò)增細(xì)胞，凍存?zhèn)溆?。利用Gateway慢病毒系統(tǒng)Plenti6. 3-NDRG2載體成功構(gòu)建了乳腺癌MDA-MB-231 (p53Mut)和MCF-7 (p53WT)細(xì)胞系的NDRG2高表達(dá)穩(wěn)定細(xì)胞株。對(duì)獲得的穩(wěn)定細(xì)胞株分別利用Western blot和qRT_PCR對(duì)目的基因NDRG2的表達(dá)狀態(tài)進(jìn)行分析。利用紅色熒光Cherry標(biāo)記(陰性對(duì)照組)，顯示MCF-7和MDA-MB-231穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系構(gòu)建成功，其熒光顯微鏡觀察感染效率結(jié)果分別如圖I、圖2所示。同時(shí)，對(duì)NDRG2的表達(dá)進(jìn)行了鑒定，分別利用qPCR和Western blot確證了所篩選細(xì)胞的NDRG2的高表達(dá)狀態(tài)，MCF-7細(xì)胞系、MDA-MB-231細(xì)胞系的檢測(cè)結(jié)果分別如圖3_1 3-2、圖4-1 4-2所不,可以看出不論Real-time PCR檢測(cè)還是Western blot檢測(cè)均顯不轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞系中NDRG2的表達(dá)明顯要高過對(duì)照。結(jié)果顯示，NDRG2高表達(dá)的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株構(gòu)建成功。為了對(duì)NDRG2表達(dá)與乳腺癌細(xì)胞，以及兩種細(xì)胞不同p53表達(dá)情況下所起到的效果的差異，分別采用了以下檢測(cè)手段，對(duì)其分別進(jìn)行說明。3、檢測(cè)方法的說明3. IqRT-PCR 檢測(cè) NDRG2 的 mRNA 表達(dá)弓丨物設(shè)計(jì)人NDRG2qRT_PCR引物UP: 5，-GAGATATGCTCTTAACCACCCG-3，DOWN: 5，-GCTGCCCAATCCATCCAA-3，人GAPDH qRT-PCR 引物UP: 5 ’ -TTCGACAGTCAGCCGCATCTTCTT-3，DOWN: 5，-CAGGCGCCCAATACGACCAAATC-3 ’3. 2提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄提取重組NDRG2包裝病毒的MCF-7、MDA-MB-231的總RNA，并將提取的中的2 y LRNA溶解于98 ii L TE buffer中，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其A260和A280值，分析RNA的純度。取提取好的0. 5 ii g總RNA,用TaKaRa公司的PrimeScript RT逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)，具體按照說明操作進(jìn)行。反應(yīng)體系為
權(quán)利要求
1.抑癌基因NDRG2在制備抗乳腺癌的藥物的應(yīng)用。
2.如權(quán)利要求I所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的藥物為與化療藥物聯(lián)合使用的藥物。
3.如權(quán)利要求I所述的應(yīng)用，其特征在于，抑癌基因NDRG2依賴于p53蛋白在乳腺癌腫瘤細(xì)胞的表達(dá)。
4.如權(quán)利要求I所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的藥物是促進(jìn)表達(dá)p53蛋白的乳腺癌細(xì)胞損傷的藥物。
5.如權(quán)利要求I所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的藥物是促進(jìn)抑制表達(dá)P53蛋白的乳腺癌細(xì)胞的增殖的藥物。
6.如權(quán)利要求I所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的藥物是促進(jìn)表達(dá)p53蛋白的乳腺癌細(xì)胞的凋亡的藥物。
7.如權(quán)利要求3 6任何一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的p53蛋白為野生型的表達(dá)或者外源性的表達(dá)。
8.抑癌基因NDRG2在制備提高乳腺癌化療敏感性的藥物的應(yīng)用。
9.如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，抑癌基因NDRG2通過表達(dá)載體或慢病毒載體轉(zhuǎn)染到乳腺癌細(xì)胞中。
10.如權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的乳腺癌細(xì)胞還進(jìn)行表達(dá)p53蛋白的表達(dá)載體的轉(zhuǎn)染。
全文摘要
本發(fā)明公開了基于抑癌基因NDRG2提高乳腺癌化療敏感性的應(yīng)用，將抑癌基因NDRG2通過表達(dá)載體或病毒載體轉(zhuǎn)染到乳腺癌細(xì)胞中，結(jié)果表明抑癌基因NDRG2在能夠提高乳腺癌化療敏感性，從而可應(yīng)用相關(guān)藥物的制備。NDRG2促進(jìn)了Adr誘導(dǎo)p53野生型乳腺癌細(xì)胞的DNA損傷能力，NDRG2提高了Adr對(duì)p53野生型乳腺癌細(xì)胞的形態(tài)學(xué)損傷，NDRG2提高了Adr對(duì)p53野生型乳腺癌細(xì)胞的增殖抑制能力，NDRG2提高乳腺癌細(xì)胞化療敏感性是非具體化療藥物依賴性的。NDRG2還促進(jìn)了Adr誘導(dǎo)的p53野生型乳腺癌細(xì)胞的凋亡。
文檔編號(hào)A61P35/00GK102784399SQ20121023914
公開日2012年11月21日 申請(qǐng)日期2012年7月11日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月11日
發(fā)明者張健, 張永平, 張璟, 藥立波, 陳蘇寧 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)