專利名稱：一種厚樸果實提取物的提取方法及其抗菌用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種厚樸果實提取物的提取方法及其抗菌用途。
背景技術(shù)：
在世界范圍內(nèi)，尤其是發(fā)展中國家，感染性疾病擁有很高的發(fā)病率和死亡率。抗生素以及農(nóng)藥雖然可以保護人類和 農(nóng)作物免受病原微生物的侵害，但是它們的毒副作用對人類的健康卻是不利的。另一方面，抗生素和農(nóng)藥的濫用也導(dǎo)致了嚴重的生態(tài)和環(huán)境問題。病原體的耐藥性也使得人們不得不尋找更加良好的抗菌劑以用于臨床和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。藥用植物在適應(yīng)自然環(huán)境、對抗自然界中的微生物感染的過程中逐漸形成其固有的化學防御機制，近年來，藥用植物逐漸受到了科學界的廣泛關(guān)注。大量的藥用植物的揮發(fā)油和提取物被證明具有抗菌活性，這為抗微生物感染帶來了新的希望。厚樸為木蘭科植物厚樸(Magnolia officinalis Rehd. et ffils.)或凹葉厚樸(Magnolia officinalis Rehd. et ffils. var. biloba Rehd. et ffils)的干燥干皮、根皮及枝皮。在我國，厚樸主產(chǎn)于四川、湖北和陜西等地，凹葉厚樸主產(chǎn)于浙江、湖南、江西、廣西、安徽等地。厚樸有下氣除滿、燥濕消痰之功效，為我國常用的傳統(tǒng)中藥之一?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》將厚樸列為上品；《本草匯言》中記載“厚樸，寬中化滯，平胃氣之藥也。凡氣滯于中，郁而不散，食積于胃，羈而不行，或濕郁積而不去，用厚樸之溫可以燥濕，苦可以下氣也。”《本經(jīng)》中所述“厚樸溫中益氣，厚腸胃……?！蹦壳笆袌錾纤坜较阏龤馔?、鱉甲煎膠囊、保濟丸、香砂養(yǎng)胃丸等藥物中均以厚樸為其主藥。從以往關(guān)于厚樸化學成分的研究來看，酚類化合物、生物堿、揮發(fā)油應(yīng)為厚樸的主要化學組分；除此之外，還含有其他物質(zhì)如棕櫚酸、二十六烷醇、槲皮素、胡蘿卜苷、皂苷、鞣質(zhì)等。厚樸中酚類化合物主要為厚樸酚與和厚樸酚，這兩種物質(zhì)也被認為是厚樸的主要活性物質(zhì)?，F(xiàn)代藥理學的研究顯示，厚樸及其主要活性物質(zhì)厚樸酚與和厚樸酚具有多種藥理活性，主要為抗菌作用、抗腫瘤作用、抗氧化作用、對消化系統(tǒng)的作用、對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用、鎮(zhèn)痛抗炎作用和其他作用。但是，厚樸是一種木本中藥材，從種植到采收時間漫長，一般要經(jīng)過10年的生長年限后才能開始采收其樹皮，隨著樹齡的增大，樹皮的厚度也增加，所得的藥材質(zhì)量也越高。但是由于過度的砍伐和剝皮，使厚樸資源遭到極大的破壞。且厚樸對保持水土和生態(tài)平衡也起著不可忽視的作用，所以處理這種厚樸藥用與保護生態(tài)環(huán)境之間的矛盾顯得尤為迫切。由于厚樸的廣泛種植，厚樸果實的資源十分豐富、且每年均可再生，但從目前的研究和應(yīng)用狀況來看，對厚樸果實的研究和資源開發(fā)還未見報道，極大的浪費了厚樸的資源。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種厚樸果實提取物的提取方法及其抗菌用途。
一種厚樸果實提取物，其特征如下I)所述的提取物是按下述提取方法獲得的稱取干燥的厚樸果實粉，加入無水乙醇，常溫下超聲提取40-60分鐘后，旋蒸濃縮至20-30mL，加入5-7倍量的蒸餾水，繼續(xù)旋蒸至無乙醇味，冷凍干燥即得厚樸果實提取物。2)所述的提取物中含有18%_20%總酚，10%_15%厚樸酚，7%-10%和厚樸酚。作為優(yōu)選方案所述的厚樸果實粉與無水乙醇的比例為厚樸果實粉/無水乙 醇=lg/(10 15)ml。在本發(fā)明中，根據(jù)美國臨床實驗室標準化委員會(NCCLS)制定的M27-A3微量稀釋法測定厚樸果實提取物對四種細菌、四種霉菌和四種念珠菌的最低抑菌濃度(MIC)。供試菌為大腸桿菌Escherichia coli (CCAM 080173)、金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus (CCAM080177)、枯草芽抱桿菌 Bacillus subtil is (CMCC 63501)、施氏假單胞菌Pseudomonas stutzeri (CCAM 080041)、黃曲霉 Aspergillus flavus (CCAM 080001)、米曲霉 Aspergillus oryzae (CCAM 080006)、黑曲霉 Aspergillus niger (CCAM 080002)、米根霉 Rhizopus oryzae (CCAM 080148)、白色念珠菌 Candida albicans (ATCC 64550)、熱帶念珠菌 Candida tropicalis (032)、克柔念珠菌 Candida krusei (09-1394)、近平滑念珠菌Candida parasilosis(07-305)。實驗結(jié)果表明厚樸果實提取物對各菌種都有很好的抑制活性的作用。對四種細菌的MIC均為62. 5 μ g/mL，對四種霉菌的MIC在250-500 μ g/mL之間，對四種念珠菌的MIC在500-1000 μ g/mL 之間。厚樸果實提取物對黑曲霉菌絲生長、生物量、孢子產(chǎn)率和孢子萌發(fā)率有好的抑制作用。實驗表明I)對黑曲霉菌絲生長的抑制效果厚樸果實提取物在2mg/mL時能完全抑制黑曲霉菌絲的生長；另外，在濃度低于2mg/mL時，提取物也表現(xiàn)出了延遲黑曲霉菌絲生長的效果，在濃度為I. 5mg/mL時能延遲黑曲霉菌絲生長5天，在濃度為lmg/mL時延遲時間為4天，在濃度為0. 25mg/mL和0. 5mg/mL時能延遲黑曲霉菌絲生長I天。2)對黑曲霉菌生物量的抑制效果不同濃度的提取物都能不同程度的降低黑曲霉生物量的擴增，各提取物濃度越高，黑曲霉生物量擴增越低，厚樸果實提取物在2mg/mL時能完全抑制黑曲霉生物量的擴增。3)對黑曲霉菌孢子產(chǎn)率和孢子萌發(fā)率的抑制效果不同濃度的提取物能不同程度的減少黑曲霉孢子的產(chǎn)生和孢子的萌發(fā)，且隨著提取物的濃度增加，抑制活性增強，可見提取物對黑曲霉孢子產(chǎn)率和萌發(fā)率的抑制均呈現(xiàn)濃度依賴性。厚樸果實提取物在2mg/m時能完全抑制黑曲霉孢子的產(chǎn)生和萌發(fā)。另外，厚樸果實提取物在所試的濃度范圍內(nèi)對黑曲霉孢子產(chǎn)生表現(xiàn)出很強的抑制活性。在其濃度為0. 25mg/mL-l. 5mg/mL時，對黑曲霉孢子產(chǎn)量抑制率為 79. 85%-99. 05%。總之，本發(fā)明厚樸果實的提取方法中資源十分豐富、且每年均可再生，制備方法簡單易行，容易操作；所制備的提取物有較好的抗菌用途，可作為抗菌類藥物制劑的原料，制成片劑、注射劑、膠囊、栓劑、緩釋劑、復(fù)方制劑等抗菌藥物。


圖I為本發(fā)明厚樸果實提取物對黑曲霉菌絲生長的影響，圖中數(shù)據(jù)為數(shù)值為平均值(n=3) 土標準偏差
圖2為本發(fā)明厚樸果實提取物對黑曲霉孢子產(chǎn)率的影響，圖中數(shù)值為平均值(n=6) +SD圖3為本發(fā)明厚樸果實提取物對黑曲霉孢子萌發(fā)率的影響，圖中數(shù)值為平均值(n=6) +SD
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明及其抗菌效果作進一步的描述，本具體實施方式
并非對其保護范圍的限制。實施例I厚樸果實提取物的制備
稱取干燥的厚樸果實粉20g，加入無水乙醇200mL，常溫下超聲提取40分鐘后，旋蒸濃縮至30mL，加入7倍量的蒸餾水，繼續(xù)旋蒸至無乙醇味，冷凍干燥即得厚樸果實提取物。此法獲得的厚樸果實提取物得率可達20. 0%以上。實施例2稱取干燥的厚樸果實粉20g，加入無水乙醇300mL，常溫下超聲提取60分鐘后，旋蒸濃縮至20mL，加入5倍量的蒸餾水，繼續(xù)旋蒸至無乙醇味，冷凍干燥即得厚樸果實提取物。此法獲得的厚樸果實提取物得率可達20. 0%以上。對實施例I和2的提取物進行含量測定總酚含量的測定精密稱取沒食子酸對照品5mg，轉(zhuǎn)入燒杯中，在燒杯中加入適量的75%乙醇使沒食子酸完全溶解后，轉(zhuǎn)移至25mL棕色容量瓶中，用少量75%乙醇蕩洗燒杯后，同樣轉(zhuǎn)入該容量瓶，再次加入75%乙醇定容至刻度，即得對照品溶液母液。分別從母液中取出lmL、2mL、3mL、4mL、5mL加入到IOmL棕色容量瓶，分別用75%乙醇定容至刻度，即得濃度分別為20 μ g/mL>40 μ g/mL>60 μ g/mL>80 μ g/mL、100 μ g/mL的沒食子酸對照品溶液，放置備用。精密量取上述沒食子酸對照品溶液各O. 5mL，加入2. 5mL Folin酚試劑(10倍稀釋)，混勻后放置3min，加入2mL濃度為75g/L的Na2CO3溶液，在50°C下水浴5min后，冷卻至室溫，在760nm下檢測吸光度，并繪制標準曲線。每個對照品平行測定三次。取提取物
O.5mL，按前述方法進行檢測，將結(jié)果帶入標準曲線方程，計算總酚含量，每個樣品平行測定三次。得到厚樸果實提取物中總酚含量約為18%-20%。厚樸酚與和厚樸酚含量的測定參照《中國藥典2010年版》中方法，即以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇-水(78 22)為流動相；檢測波長為294nm。用HPLC分離檢測厚樸酚與和厚樸酚。結(jié)果顯示厚樸果實中含10%-15%厚樸酚，7%-10%和厚樸酚。實施例3 :厚樸果實提取物MIC值得測定根據(jù)美國臨床實驗室標準化委員會(NCCLS)制定的M27-A3微量稀釋法測定厚樸果實提取物對四種細菌、四種霉菌和四種念珠菌的最低抑菌濃度(MIC)。供試菌為大腸桿菌 Escherichia coli (CCAM 080173)、金黃色葡萄球菌 Staphylococcus aureus (CCAM080177)、枯草芽抱桿菌 Bacillus subtil is (CMCC 63501)、施氏假單胞菌 Pseudomonasstutzeri (CCAM 080041)、黃曲霉Aspergillus fIavusCCCAM 080001)、米曲霉Aspergillusoryzae (CCAM 080006)、黑曲霉 Aspergillus niger (CCAM 080002)、米根霉 Rhizopusoryzae (CCAM 080148)、白色念珠菌 Candida albicans (ATCC 64550)、熱帶念珠菌Candida tropicalis (032)、克柔念珠菌 Candida krusei (09-1394)、近平滑念珠菌 Candidaparasilosis(07-305)采用二倍稀釋法，首先向96孔板每孔中放入100 μ I培養(yǎng)基，然后在第一孔中加入100 μ I厚樸果實提取物(4000 μ g/ml),依次自左向右進行二倍性稀釋，最后所得的孔中分別含乙醇提取物濃度范圍為31. 25 2000 μ g/ml，再接種100 μ I細菌菌懸液(I X IO8CFU/ml)或霉菌孢子懸浮液(I X 106CFU/ml)或念珠菌菌懸液(I X 104CFU/ml),最終所得的每孔終體積為200 μ 1，倒數(shù)第二孔中加入200 μ I所用的培養(yǎng)基作為培養(yǎng)基對照組，倒數(shù)第一孔中加入100 μ I菌懸液和100 μ I培養(yǎng)基作為生長對照組，將96孔板加蓋后，用封口膜密封以減少培養(yǎng)過程中水分的蒸發(fā)，細菌置于37°C、霉菌和念珠菌置于28°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，肉眼觀察無菌生長孔所含最低藥物濃度即為最小抑菌濃度(MIC)，實驗重復(fù)3次。實驗結(jié)果如下表所示，表明厚樸果實提取物對所試的各菌種都有很好的抑制活 性。對四種細菌的MIC均為62. 5 μ g/mL,對四種霉菌的MIC在250-500 μ g/mL之間，對四種念珠菌的MIC在500-1000 μ g/mL之間。表I厚樸果實提取物的MIC
權(quán)利要求
1.一種厚樸果實提取物，其特征在于 1)所述的提取物是按下述提取方法獲得的 稱取干燥的厚樸果實粉，加入無水乙醇，常溫下超聲提取40-60分鐘后，旋蒸濃縮至20-30mL，加入5-7倍量的蒸餾水，繼續(xù)旋蒸至無乙醇味，冷凍干燥即得厚樸果實提取物； 2)所述的提取物中含有18%-20%總酚，10%-15%厚樸酚，7%-10%和厚樸酚。
2.如權(quán)利要求I所述的一種厚樸果實提取物，其特征在于所述的提取方法中厚樸果實粉與無水乙醇的比例為厚樸果實粉/無水乙醇=Ig/(10 15)ml。
3.權(quán)利要求I所述厚樸果實提取物的抗細菌用途。
4.權(quán)利要求I所述厚樸果實提取物的抗霉菌用途。
5.權(quán)利要求I所述厚樸果實提取物的抗念珠菌用途。
6.如權(quán)利要求3所述的用途，其中細菌為大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、施氏假單胞菌。
7.如權(quán)利要求4所述的用途，其中曲霉菌為黃曲霉菌、米曲霉菌、黑曲霉菌、米根霉菌。
8.如權(quán)利要求5所述的用途，其中念珠菌為白色念珠菌、熱帶念珠菌、克柔念珠菌、近平滑念珠菌。
全文摘要
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種厚樸果實提取物的提取方法及其抗菌用途，本發(fā)明采用超聲提取方法，制備的厚樸果實提取物含有18%-20%總酚，10%-15%厚樸酚，7%-10%和厚樸酚；本發(fā)明的提取方法簡單易行，容易操作；所制備的提取物有較好的抗菌用途，可作為抗菌類藥物制劑的原料。
文檔編號A61K131/00GK102716188SQ20121023925
公開日2012年10月10日 申請日期2012年7月11日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月11日
發(fā)明者王有為, 田俊, 胡國清, 臧曉燕, 陳玉欣, 陳玲, 馬冰馨 申請人:武漢大學