專利名稱：利用慢病毒載體介導(dǎo)PLK1 RNAi在治療食管鱗癌轉(zhuǎn)移中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說涉及到一種針對人PLKl基因RNAi的重組慢病毒載體的構(gòu)建及重組慢病毒的生產(chǎn)，并將這種重組慢病毒應(yīng)用于抑制食管鱗癌的轉(zhuǎn)移。
背景技術(shù)：
在現(xiàn)有技術(shù)中，本領(lǐng)域的技術(shù)人員公知PLKl (Polo-like kinase I)是一種高度保守的哺乳動物細胞的絲氨酸/蘇氨酸激酶。PLKl在細胞有絲分裂的不同時期都起到十分重要的作用，對細胞周期的正常進行、中心體成熟、胞質(zhì)分裂等均有重要影響。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，在大多數(shù)人類腫瘤中PLKl均表現(xiàn)為高表達，而且PLKl的過高表達在非小細胞性肺癌、頭頸部腫瘤、黑色素瘤患者均提不預(yù)后不良。PLKl的聞表達還通過調(diào)節(jié)細胞表面betal 整合素的蛋白水平而誘導(dǎo)了乳腺癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移。所有這些研究結(jié)果表明=PLKl有可能成為惡性腫瘤治療的新靶點。目前，研究人員也紛紛開展了以PLKl為靶點的抗腫瘤藥物的研究。建立了針對PLKl mRNA的反義寡核苷酸，它能特異性地對PLKlmRNA及其蛋白產(chǎn)物表現(xiàn)為劑量依賴性的抑制作用，由此也抑制了 PLKl的絲氨酸/蘇氨酸激酶活性，能有效抑制培養(yǎng)細胞系或裸鼠腫瘤模型中腫瘤細胞的增殖，并且不影響人體正常腎小球系膜細胞和羊膜纖維母細胞的生長及生存能力。與PLKl結(jié)構(gòu)相關(guān)的小分子化合物抑制劑對高表達PLKl的腫瘤也起到一定的抑制作用。而靶向PLKl的干擾RNA作為腫瘤基因治療藥物則具有更高的特異性和有效性。轉(zhuǎn)染靶向PLKl的siRNAs后，各腫瘤細胞系包括乳腺癌細胞MCF-7、宮頸癌細胞HeLaS3、結(jié)腸癌細胞SW-480和肺癌細胞A549，細胞增殖受到明顯抑制，出現(xiàn)細胞凋亡，而且在轉(zhuǎn)染的結(jié)腸癌細胞中，中心體喪失聚合微管進而形成紡錘體的能力。在原位膀胱癌的鼠模型上，應(yīng)用靶向PLKl的siRNA/陽離子脂質(zhì)體，能夠抑制膀胱癌的生長。除了化學(xué)合成PLKlsiRNA途徑外，還有載體介導(dǎo)的PLKlsiRNA表達。但由于RNAi抑制基因表達的作用在很大程度上受到轉(zhuǎn)染效率的限制，提高轉(zhuǎn)染效率是一個關(guān)鍵的環(huán)節(jié)。慢病毒是一種逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，不但能感染分裂期的細胞并整合到其基因組中，而且還可以感染非分裂期的細胞。目前慢病毒作為siRNA載體使RNA干擾技術(shù)已廣泛的應(yīng)用于基因治療領(lǐng)域?，F(xiàn)有技術(shù)中未見報道慢病毒介導(dǎo)的靶向PLKl的siRNA在治療人類食管鱗癌侵襲轉(zhuǎn)移中的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種針對人PLKl基因RNAi的重組慢病毒載體，能有效抑制食管鱗癌細胞中PLKl基因表達，以及進一步提供該重組慢病毒載體在治療食管鱗癌轉(zhuǎn)移中的應(yīng)用。本發(fā)明中有效抑制人食管鱗癌細胞中PLKl基因表達的siRNA序列為正義鏈5’ -GGGCGGCUUUGCCAAGUGCUtt-3’，反義鏈5’ -AGCACUUGGCAAAGCCGCCCtt-3’。本發(fā)明首先根據(jù)siRNA序列設(shè)計原則從人PLKl的cDNA區(qū)域選取候選的siRNA序列，再通過BLAST同源比對保證候選siRNA序列對PLKl基因的特異性，最后選定2個針對PLKl mRNA理論上可行的siRNA序列，詳細序列見表3中的siRNA_PLKl_l和siRNA-PLKI-2。siRNA-NC(上海吉凱基因)是作為陰性對照的siRNA。通過體外化學(xué)合成法合成PLKl siRNA序列和陰性對照的正義鏈和反義鏈，然后正義鏈和反義鏈56°C退火形成雙鏈。將合成的PLKl siRNA及陰性對照同時分別轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的人食管鱗癌細胞，采用RT-PCR和WesternBlot的方法檢測PLKl siRNA的干擾效率，確定高效的siRNA序列。該PLKl siR NA序列瞬時轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的人食管鱗癌細胞，通過TRANSWELL實驗，確定該序列能明顯抑制食管鱗癌細胞的侵襲能力；通過劃痕愈合實驗，結(jié)果顯示該序列對食管鱗癌細胞的遷移能力有明顯抑制作用；通過平板克隆實驗、軟瓊脂克隆形成實驗證實該序列能明顯抑制食管鱗癌細胞的體外惡性增殖；通過體外TUNEL實驗、流式細胞儀檢測說明該序列能誘導(dǎo)食管鱗癌細胞的凋亡。根據(jù)該有效的siRNA序列，設(shè)計出人PLKl基因shRNA序列，詳細序列見表3中的shRNA-PLKl 及陰性對照 shRNA-NC。根據(jù)上述的人PLKl基因ShRNA序列，再結(jié)合載體特點合成其相應(yīng)的雙鏈DNA片段，詳細序列見表3中DNA-shRNA-PLKl及陰性對照DNA_shRNA_NC。 由于雙鏈DNA片段有酶切位點BamH I和EcoR /，所以用BamH I和EcoR I酶切慢病毒載體pGLV/Hl/GFP+Pim)(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司)，把合成的DNA片段連接至慢病毒載體，獲得重組慢病毒載體。重組慢病毒載體Supersilencing-DNA-shRNA-PLKl聯(lián)合包裝質(zhì)粒Helper Vector共轉(zhuǎn)染293T細胞獲得包裝重組慢病毒。分別構(gòu)建裸鼠皮下移植瘤模型和裸鼠肺轉(zhuǎn)移模型，利用重組慢病毒感染體內(nèi)細胞，發(fā)現(xiàn)該重組慢病毒能明顯抑制食管鱗癌細胞的體內(nèi)惡性增殖及肺轉(zhuǎn)移。本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明提供I對能特異性沉默人PLKl基因的siRNA序列，通過體外轉(zhuǎn)染實驗，證實該序列能有效抑制食管鱗癌細胞的侵襲、遷移、惡性增殖和凋亡。構(gòu)建了能夠穩(wěn)定表達上述siRNA序列的慢病毒載體Supersilencing-DNA-shRNA-PLKl，并在293T細胞中生產(chǎn)具有高感染率的該重組慢病毒。通過體內(nèi)感染實驗，該高效穩(wěn)定表達PLKl基因shRNA序列的重組慢病毒能明顯抑制食管鱗癌細胞的體內(nèi)惡性增殖及肺轉(zhuǎn)移。此研究結(jié)果為開發(fā)抗食管鱗癌的新型生物基因藥物提供新思路。


圖I篩選高表達PLKl的食管鱗癌細胞
A圖利用RT-PCR檢測不同食管鱗癌細胞系中PLKl基因mRNA的表達量。B圖利用Western Blot檢測不同食管鱗癌細胞系中PLKl蛋白質(zhì)水平的表達量。以Actin為內(nèi)參，結(jié)果TE-8為高表達PLKl的細胞系。圖2靶向PLKl的有效siRNA轉(zhuǎn)染食管鱗癌細胞TE-8，用Western Blot檢測干擾效率，設(shè)立三個對照，分別轉(zhuǎn)染PBS，Lipo和siRNA-NC。圖3靶向PLKl的RNA干擾能明顯抑制食管鱗癌細胞的侵襲能力A圖TRANSWELL實驗結(jié)果，設(shè)立三個對照，分別轉(zhuǎn)染PBS，Lipo和siRNA-NC。B圖TRANSWELL實驗的統(tǒng)計結(jié)果。圖4劃痕愈合實驗結(jié)果，設(shè)立三個對照，分別轉(zhuǎn)染PBS，Lipo和siRNA-NC。說明靶向PLKl的RNA干擾對食管鱗癌細胞的遷移能力有明顯抑制作用。圖5平板克隆實驗結(jié)果，說明靶向PLKl的RNA干擾能明顯抑制食管鱗癌細胞的體內(nèi)外惡性增殖。圖6軟瓊脂克隆形成實驗結(jié)果，說明靶向PLKl的RNA干擾能明顯抑制食管鱗癌細胞的體內(nèi)外惡性增殖。圖7體外TUNEL實驗(A)和流式細胞儀檢測(B)結(jié)果，說明靶向PLKl的RNA干擾能誘導(dǎo)食管鱗癌細胞的凋亡。 圖8 Supersilencing-DNA-shRNA-PLKl測序結(jié)果圖，下劃線部分為插入慢病毒載體的 DNA-shRNA-PLKl 序列。圖9重組慢病毒感染裸鼠皮下移植瘤模型結(jié)果，說明靶向PLKl的RNA干擾能明顯抑制食管鱗癌細胞的體內(nèi)惡性增殖。圖10重組慢病毒感染裸鼠肺轉(zhuǎn)移模型實驗，說明靶向PLKl的RNA干擾能明顯抑制食管鱗癌細胞的肺轉(zhuǎn)移。
具體實施例方式以下將結(jié)合附圖進一步非限定性的詳細說明本發(fā)明。實施例I用RT-PCR和Western Blot方法篩選高表達PLKl的人食管鱗癌細胞 URT-PCR
Trizol裂解法提取人食管鱗癌細胞總RNA，用分光光度計對總RNA定量，并用Takara公司反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑盒(TaKaRa Code: DRR037A)反轉(zhuǎn)錄為cDNA。用Taq^i (TaKaRaCode: DR001A)進行PCR擴增，具體步驟參考試劑盒說明書。人PLKl和內(nèi)參Actin的引物見表I，反應(yīng)體系見表2。表I PLKl和內(nèi)參Actin的引物序列
基I引物序柯
PLKI-F:W:3A03A6TrCTTTACTTCTGfU
PLKI ............................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................
.P-LKI-Ry<:A 傷:^miCC/CTCATTCTACIJ
IAct.F5^TGAC3TG<3A CATCCGCAAAG-Ir
Actin I
___j Actm-R I 5'CTGGAACKJTG.GACA<3e6AGGJ
表2 PCR反應(yīng)體系
ii劑I加入試劑的f
IOXPCRbuffer (Mg2+free)5 U I
MgCl2 (25mM)3u I
2.5mMdNTPmix4 u I
10 u MPrimer 上游I U I
10 u MPrimer 下游I U I
TemplatecDNAIul
權(quán)利要求
1.有效抑制人食管鱗癌細胞PLKl表達的siRNA序列特征為根據(jù)人PLKl基因mRNA序列設(shè)計，上述人PLKl基因mRNA序列Gene Bank登錄號為NM-005030. 3 ;正義鏈和反義鏈的長度均為22個核苷酸，其中3'有tt懸掛。并且互補配對，GC含量為59. 1%。正義鏈5’ -GGGCGGCUUUGCCAAGUGCUtt-3，反義鏈5’ -AGCACUUGGCAAAGCCGCCCtt-3’
2.權(quán)利要求I所述的針對人PLKl基因的siRNA序列，能夠有效抑制PLKl基因的表達及食管鱗癌細胞的體外侵襲、遷移、增殖和凋亡。根據(jù)該有效的siRNA序列，設(shè)計出人PLKl基因shRNA序列如下5，-GGGCGGCUUUGCCAAGUGCUUUCAAGAGAAGCACUUGGCAAAGCCGCCC-3，
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的人PLKl基因shRNA序列，合成其相應(yīng)的雙鏈DNA片段；并構(gòu)建一種針對人PLKl基因RNAi的重組慢病毒載體，其特征在于自身失活的慢病毒載體pGLV/Hl/GFP+Puro的MCS區(qū)連接了針對人PLKl基因shRNA的雙鏈DNA片段。上述雙鏈DNA片段的序列如下正義鏈5，-GATCCGGGCGGCTTTGCCAAGTGCTTTCAAGAGAAGCACTTGGCAAAGCCGCCCTTTTTT-3，反義鏈5，-AATTCAAAAAGGGCGGCTTTGCCAAGTGCTTCTCTTGAAAGCACTTGGCAAAGCCGCCC-3 ’
4.權(quán)利要求3所述的針對人PLKl基因RNAi的重組慢病毒載體，與包裝質(zhì)粒載體Helper Vector共轉(zhuǎn)染293T細胞獲得包裝重組慢病毒。
5.權(quán)利要求4中所述的重組慢病毒在治療食管鱗癌轉(zhuǎn)移中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種針對PLK1基因RNA干擾的重組慢病毒載體的構(gòu)建及其在治療食管鱗癌轉(zhuǎn)移中的應(yīng)用。重組慢病毒載體包括一段核苷酸序列和慢病毒載體pGLV/H1/GFP+Puro，能夠表達人PLK1基因siRNA分子的正義鏈和反義鏈，使人PLK1mRNA發(fā)生特異性降解而導(dǎo)致其表達沉默。在293T細胞中進行慢病毒包裝，得到的重組慢病毒顆粒感染人食管鱗癌細胞，發(fā)現(xiàn)能夠明顯抑制食管鱗癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。因此本發(fā)明介導(dǎo)PLK1RNAi的重組慢病毒載體可能成為食管鱗癌基因治療的有力工具。
文檔編號A61P35/04GK102719437SQ20121024048
公開日2012年10月10日 申請日期2012年7月11日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月11日
發(fā)明者馮衛(wèi)國, 劉曉影, 杜長青, 趙春玲, 陳麗梅, 高志芹 申請人:濰坊醫(yī)學(xué)院