專利名稱：一種細(xì)胞外基質(zhì)支架材料及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物材料領(lǐng)域，涉及一種細(xì)胞外基質(zhì)支架材料及其制備方法，具體涉及一種基于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的細(xì)胞外基質(zhì)支架材料及其制備方法。
背景技術(shù)：
關(guān)節(jié)軟骨是無(wú)血管、淋巴及神經(jīng)支配的特殊組織。關(guān)節(jié)軟骨本身自我修復(fù)能力非常有限，一旦受損傷直徑大于3mm將無(wú)法自行修復(fù)。目前治療軟骨缺損的主要方法有關(guān)節(jié)鏡下灌洗術(shù)、關(guān)節(jié)清理術(shù)、軟骨下骨鉆孔術(shù)(subchondralbone drilling)、微骨折術(shù)(microfracture)、自體或異體骨軟骨移植術(shù)(auto or alio osteochondral
transplantation)、自體軟骨細(xì)胞移植術(shù)(autologous chondrocyte implantation, ACI)及人工關(guān)節(jié)置換術(shù)。上述方法各有手術(shù)適應(yīng)癥及優(yōu)、缺點(diǎn)，并非盡善人意。近年來(lái)，隨著組織工程學(xué)相關(guān)研究的突飛猛進(jìn)，給軟骨再生技術(shù)帶來(lái)了希望。組織工程學(xué)的研究涉及種子細(xì)胞、生物可降解材料和組織構(gòu)建三個(gè)方面的內(nèi)容。其中，成功的關(guān)鍵是理想的可降解生物材料的制備。作為種子細(xì)胞的理想支架一般認(rèn)為應(yīng)具有以下特性良好的生物相容性和生物降解性、三維多孔立體結(jié)構(gòu)、可塑性和一定的機(jī)械強(qiáng)度、良好的細(xì)胞界面和消毒性能。目前，根據(jù)材料的來(lái)源將生物材料支架可分為人工合成的高分子聚合物和天然生物材料兩大類。高分子聚合物包括聚乳酸(PLA)、聚羥基乙酸(PGA)及PGA/PLA共聚物(PLGA)等；天然生物材料包括膠原(Collagen)、纖維蛋白(Fibrin)、明膠(Gelatin)、糖氨聚糖(GAG)、海藻鹽酸(Alginate)等。盡管這些生物材料在實(shí)驗(yàn)室及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中觀察到了良好的軟骨再生能力，但因生物毒性、降解速度及機(jī)械強(qiáng)度等諸多不足未能應(yīng)用到臨床。有時(shí)甚至還需行復(fù)雜表面修飾，以便給種子細(xì)胞提供一個(gè)良好的人工細(xì)胞外基質(zhì)環(huán)境。鑒于此，許多學(xué)者致力于以天然的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)作為載體的研究，如小腸粘膜下層(small intestinal submucosa, SIS)、人類羊膜(human amniotic membrane, HAM)、異體脫細(xì)胞膀胱粘膜下層、異種(豬)軟骨細(xì)胞分泌的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)等。細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)支架較上述的天然或人工合成的生物材料支架具有以下優(yōu)點(diǎn)1、細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)支架主
要成分為功能性和結(jié)構(gòu)性蛋白-膠原纖維(collagen)、蛋白多糖(proteoglycans)、糖氨
聚糖(GAGs)，它們可有機(jī)的結(jié)合成超微結(jié)構(gòu)供組織構(gòu)建；2、細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)表面的三肽RGD，及富含硫酸軟骨素、硫酸肝素的蛋白聚糖(如多配體蛋白聚糖)和CD44，在細(xì)胞黏附方面也有重要的作用；3、它還含有多種生長(zhǎng)因子，如TGF-P、bFGF、VEGF等，特別是TGF-@和bFGF分別在促進(jìn)干細(xì)胞的軟骨細(xì)胞分化和促進(jìn)細(xì)胞分泌細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)方面起著非常重要的作用；4、具有良好的天然的生物降解性能；5、可通過(guò)整合蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞變形，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)及分化。目前，這些細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)支架已廣泛應(yīng)用于皮膚創(chuàng)面修復(fù)、輸尿管重建、消化管及硬腦膜修復(fù)中。近年來(lái)也有collagen支架與自體軟骨細(xì)胞移植術(shù)和PGA支架與微骨折骨髓刺激術(shù)相結(jié)合來(lái)再生軟骨的報(bào)道。上述異體組織來(lái)源或異種細(xì)胞來(lái)源細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)支架有很多優(yōu)點(diǎn)，但仍然不能完全消除免疫排斥反應(yīng)和疾病傳播的風(fēng)險(xiǎn)。為了解決上述問(wèn)題，這些細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)支架的制備都必須要經(jīng)過(guò)復(fù)雜的脫細(xì)胞過(guò)程。脫細(xì)胞過(guò)程中所使用的蛋白質(zhì)變性劑和助溶劑SDS，不但會(huì)使正常組織結(jié)構(gòu)發(fā)生斷裂、氨基蛋白糖丟失和膠原破壞，且丟失大量生長(zhǎng)因子(可高達(dá)39 72%)，進(jìn)而降低了細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)支架的生物學(xué)功能。本發(fā)明涉及的是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的三維多孔狀細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)支架，不僅能消除免疫排斥反應(yīng)和疾病傳播的風(fēng)險(xiǎn)，還能提供種子細(xì)胞(軟骨細(xì)胞或干細(xì)胞)黏附、增殖及軟骨化分化所需的微環(huán)境，是日后骨科臨床進(jìn)而探索出一種簡(jiǎn)易而有效的軟骨缺損修復(fù)的新技術(shù)，為今后臨床應(yīng)用提供必要的理論依據(jù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種細(xì)胞外基質(zhì)支架材料。本發(fā)明的另一目的是提供該細(xì)胞外基質(zhì)支架材料的制備方法。本發(fā)明的目的可通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)一種基于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的細(xì)胞外基質(zhì)支架材料，該細(xì)胞外基質(zhì)支架是通過(guò)如下方法獲得的(I)全骨髓培養(yǎng)法原代培養(yǎng)幼兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞取2-3周齡幼兔雙股骨和/或脛骨，消毒后置裝有無(wú)菌生理鹽水的培養(yǎng)皿中，在無(wú)菌條件下開(kāi)放股骨和/或脛骨兩端骨髓腔，用生理鹽水沖洗骨髓腔，收集骨髓沖洗液，8001200轉(zhuǎn)/分速度離心8 10分鐘，棄上清液，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞沉淀用DMEM培養(yǎng)基混懸，并計(jì)數(shù)，以I X IO8細(xì)胞密度將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞接種于直徑為150mm培養(yǎng)皿，每皿加含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液20ml，置二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行單層高密度培養(yǎng)，6 8天后進(jìn)行第一次換液，之后每3天換液一次，整個(gè)培養(yǎng)周期為30 40天；(2)收集細(xì)胞外基質(zhì)，并冷凍干燥棄步驟(I)培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液，將皿底膜狀或膠凍狀的細(xì)胞外基質(zhì)收集至裝有含IOmM EDC和IOmM NHS的交聯(lián)液的棕色玻璃容器中，浸泡20 25小時(shí)后先用5mM Na2HPO4洗2飛遍，每次20 30分鐘，再用雙蒸水漂洗2飛次，每次20^30分鐘，然后120(Tl800轉(zhuǎn)/分速度離心8 15分鐘，收集沉淀物經(jīng)冷凍干燥得到基于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的細(xì)胞外基質(zhì)支架材料。其中，所述的經(jīng)凍干得到的細(xì)胞外基質(zhì)支架材料根據(jù)軟骨缺損區(qū)或體外實(shí)驗(yàn)所需修剪成合適的大小和形狀，經(jīng)環(huán)氧乙烷滅菌得到整體分裝包。步驟(2)所述的冷凍干燥是將所述的沉淀物放入_80°C的深低溫冰箱或液氮罐內(nèi)冷凍成型，冷凍至少24小時(shí)后，即可將得到的細(xì)胞外基質(zhì)固體物置冷凍干燥機(jī)的托盤(pán)上；冷凍干燥機(jī)需事先啟動(dòng)I 1.5小時(shí)預(yù)凍達(dá)到-65°C，然后將細(xì)胞外基質(zhì)固體物在-55 _75°C、真空度I IOKPa條件下，經(jīng)冷凍干燥處理24 48小時(shí)得到白色或銀白色或象牙色的三維多孔狀基于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的細(xì)胞外基質(zhì)支架材料。所述的基于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的細(xì)胞外基質(zhì)支架材料的制備方法，包含如下步驟(I)全骨髓培養(yǎng)法原代培養(yǎng)幼兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞取幼兔雙股骨和/或脛骨，消毒后置裝有無(wú)菌生理鹽水的培養(yǎng)皿中，在無(wú)菌條件下開(kāi)放股骨和/或脛骨兩端骨髓腔，用生理鹽水沖洗骨髓腔，收集骨髓沖洗液，800^1200轉(zhuǎn)/分速度離心8 10分鐘，棄上清液，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞沉淀用DMEM培養(yǎng)基混懸，并計(jì)數(shù)，以I X IO8細(xì)胞密度將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞接種于150mm培養(yǎng)皿，每皿加含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液20ml，置二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行單層高密度培養(yǎng)，61天后進(jìn)行第一次換液，之后每2 3天換液一次，整個(gè)培養(yǎng)周期為30 40天；(2)收集細(xì)胞外基質(zhì)，并冷凍干燥棄步驟(I)培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液，將皿底膜狀或膠凍狀的細(xì)胞外基質(zhì)收集至裝有含IOmM EDC和IOmM NHS的交聯(lián)液的棕色玻璃容器中，浸泡20 25小時(shí)后先用5mM Na2HPO4洗2飛遍，每次20 30分鐘，再用雙蒸水漂洗2飛次，每次20^30分鐘，然后120(Tl800轉(zhuǎn)/分速度離心8 15分鐘，收集沉淀物經(jīng)冷凍干燥得到基于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的細(xì)胞外基質(zhì)支架材料。其中，經(jīng)凍干得到的細(xì)胞外基質(zhì)支架材料根據(jù)軟骨缺損區(qū)或體外實(shí)驗(yàn)所需修剪成合適的大小和形狀，經(jīng)環(huán)氧乙烷滅菌得到整體分裝包，可保持使用前呈無(wú)菌狀態(tài)以備體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究使用，且無(wú)損它的理化特性及空間結(jié)構(gòu)。所述的步驟(2)所述的冷凍干燥是將所述的沉淀物放入_80°C的深低溫冰箱或液氮罐內(nèi)冷凍成型，冷凍至少24小時(shí)后，即可將得到的細(xì)胞外基質(zhì)固體物置冷凍干燥機(jī)的托盤(pán)；冷凍干燥機(jī)需事先啟動(dòng)I I. 5小時(shí)預(yù)凍達(dá)到_60°C，然后將細(xì)胞外基質(zhì)固體物在-55 _70°C、真空度I IOKPa條件下，經(jīng)冷凍干燥處理24 48小時(shí)得到白色或銀白色或象牙色的三維多孔狀基于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的細(xì)胞外基質(zhì)支架材料。本發(fā)明所述的幼兔雙股骨和脛骨取自兔宰殺場(chǎng)，優(yōu)選在宰殺后I小時(shí)內(nèi)分離得到的雙股骨和脛骨。本發(fā)明基于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的細(xì)胞外基質(zhì)支架材料的物化指標(biāo)本發(fā)明基于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的細(xì)胞外基質(zhì)支架材料為三維多孔狀支架材料，孔隙大小為100-400 u m,孔隙率不低于90%，機(jī)械強(qiáng)度不低于3. OKPa,極高的組織相容性，細(xì)胞接種率 不低于55%，種子細(xì)胞存活率在95%以上，含膠原、蛋白多糖，及TGF-P I等生長(zhǎng)因子。有益效果本發(fā)明細(xì)胞外基質(zhì)支架材料以干細(xì)胞作為細(xì)胞外基質(zhì)支架的材料來(lái)源，它不僅組織來(lái)源廣、增殖能力強(qiáng)、自體即可獲得充足的細(xì)胞量，避免了胚胎干細(xì)胞所牽涉的社會(huì)倫理學(xué)的問(wèn)題，而且克服了現(xiàn)國(guó)內(nèi)外使用異體組織來(lái)源或異種細(xì)胞來(lái)源細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)支架所帶來(lái)的弊端免疫排斥反應(yīng)和疾病傳播的風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)還能提供種子細(xì)胞(軟骨細(xì)胞或干細(xì)胞)黏附、增殖及軟骨化分化所需的微環(huán)境，是一種有臨床發(fā)展遠(yuǎn)期前景的生物支架材料。本發(fā)明所涉及的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞外基質(zhì)支架的制備過(guò)程，無(wú)論是干細(xì)胞單層高密度的體外培養(yǎng)，還是真空冷凍干燥處理，或是環(huán)氧乙烷滅菌，都是比較簡(jiǎn)潔易行的，對(duì)設(shè)備沒(méi)有過(guò)高要求。本發(fā)明細(xì)胞外基質(zhì)支架材料經(jīng)環(huán)氧乙烷滅菌得到整體分裝包，可保持使用前呈無(wú)菌狀態(tài)以備體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究使用，且無(wú)損它的理化特性及空間結(jié)構(gòu)。


圖I骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞外基質(zhì)支架制備的流程示意圖。圖2骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞外基質(zhì)支架的大體觀圖。圖3骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞外基質(zhì)支架的掃描電鏡下微觀圖。
圖4骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞外基質(zhì)支架病理切片HE染色倒置顯微鏡下一般形態(tài)結(jié)構(gòu)圖。圖5軟骨細(xì)胞接種干細(xì)胞外基質(zhì)支架不同時(shí)間點(diǎn)的大體觀。圖6軟骨細(xì)胞接種干細(xì)胞外基質(zhì)支架不同時(shí)間點(diǎn)的組織化學(xué)染色觀察。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I(一)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞外基質(zhì)支架制備的流程示意圖見(jiàn)圖1，具體方法如下(I)全骨髓培養(yǎng)法原代培養(yǎng)幼兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞取屠宰場(chǎng)剛宰殺的新鮮3周 齡幼兔，分離得到左右雙股骨和脛骨，置于冰袋內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行以下操作對(duì)股骨和脛骨行碘伏浸泡消毒，置裝有無(wú)菌生理鹽水的培養(yǎng)皿中。超凈臺(tái)內(nèi)，開(kāi)放股骨、脛骨兩端骨髓腔，用生理鹽水沖洗骨髓腔，直至骨髓腔發(fā)白為止。收集骨髓沖洗液，1000轉(zhuǎn)/分速度離心10分鐘，棄上清液，細(xì)胞沉淀用DMEM基培混懸，并計(jì)數(shù)。以I X IO8細(xì)胞密度將細(xì)胞接種于直徑為150mm培養(yǎng)皿，每皿加含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液20ml，置二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)于37 °C、5%C02、飽和濕度條件下進(jìn)行單層高密度培養(yǎng)培養(yǎng)。約7天后進(jìn)行第一次換液，之后換液頻率為2天換液一次。整個(gè)培養(yǎng)周期約需培養(yǎng)30天。(2)收集細(xì)胞外基質(zhì)，并冷凍干燥棄皿中培養(yǎng)液，用細(xì)胞刮勺將皿底膜狀或膠凍狀的細(xì)胞外基質(zhì)，收集至裝有含IOmM EDC和IOmM NHS的交聯(lián)液的棕色玻璃容器中，浸泡24小時(shí)后先用5mMNa2HP04洗3遍，每次30分鐘；后再用雙蒸水漂洗3次，每次30分鐘。1500轉(zhuǎn)/分速度離心10分鐘，收集沉淀物置合適盛具內(nèi)，立即放入-80°C的深低溫冰箱冷凍成型得到細(xì)胞外基質(zhì)固體物。冷凍至少24小時(shí)后，即可將細(xì)胞外基質(zhì)固體物置冷凍干燥機(jī)的托盤(pán)上；冷凍干燥機(jī)需事先啟動(dòng)I小時(shí)預(yù)凍達(dá)到-65'60°C，然后將細(xì)胞外基質(zhì)固體物在溫度-65 _75°C、真空度l_5KPa條件下，經(jīng)冷凍干燥處理36小時(shí)，最終得到白色或銀白色或象牙色的三維多孔狀支架材料。(3)環(huán)氧乙烷滅菌處理并得到符合國(guó)家有關(guān)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的整體分裝包該材料可以根據(jù)軟骨缺損區(qū)或體外實(shí)驗(yàn)所需，任意修剪成合適的大小和形狀，可經(jīng)環(huán)氧乙烷滅菌得到整體分裝包，可保持使用前呈無(wú)菌狀態(tài)以備體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究使用，且無(wú)損它的理化特性及空間結(jié)構(gòu)。(二)所制備的干細(xì)胞外基質(zhì)支架材料的外觀圖如圖2所示，其掃描電鏡下微觀圖如圖3所示，顯微鏡不同放大倍數(shù)下(40、100和400倍)HE染色結(jié)果如圖4所示。其物化指標(biāo)三維多孔狀支架材料的空隙大小為100 400 u m,孔隙率為91. 5%±2. 84%，機(jī)械強(qiáng)度為3. 8±0. 6KPa，極高的組織相容性，細(xì)胞接種率約為56%，種子細(xì)胞存活率為95. 4%，含膠原、蛋白多糖，及TGF-Pl等生長(zhǎng)因子。軟骨細(xì)胞接種干細(xì)胞外基質(zhì)支架不同時(shí)間點(diǎn)的大體觀見(jiàn)圖5，軟骨細(xì)胞接種干細(xì)胞外基質(zhì)支架不同時(shí)間點(diǎn)的組織化學(xué)染色觀察見(jiàn)圖6。以下為干細(xì)胞外基質(zhì)支架材料的各物化指標(biāo)的檢測(cè)方法(I)取實(shí)施例I中制備的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞外基質(zhì)支架，按如下方法對(duì)病理切片HE染色I(xiàn))取材與固定支架塊切取至0.6X0. 6X0. 6cm大小為宜，快速投入10%甲醛固定液中，固定24小時(shí)；之后流水沖洗10分鐘，以洗去固定液；
2)脫水70%酒精0. 5小時(shí)；80%酒精0. 5小時(shí)；90%酒精0. 5小時(shí);100%酒精(I)0. 5小時(shí)；100%酒精(11)0. 5小時(shí)；3)透明二甲苯(1)0. 5小時(shí)；二甲苯(11)0. 5小時(shí)；4)浸蠟將支架塊放入熔化的石蠟中，75 °C溫箱過(guò)夜；5)包埋在BMJ-B型包埋機(jī)上將支架塊用石蠟包埋于包埋盒中(原則上一個(gè)支架塊包埋于一個(gè)包埋盒中);包埋機(jī)的工作條件工作臺(tái)溫度為60°C，儲(chǔ)鑷塊溫度為64°C，蠟嘴溫度為70°C ;包埋完畢的包埋塊立即置于病理組織包埋冷凍臺(tái)上冷卻(-25 -15°C);6)切片包埋塊冷卻后立即在Leica石蠟切片機(jī)上切片，切片厚度為2_3iim ;切取下來(lái)的支架切片置病理組織漂烘儀的48度水中，用鑷子輕輕將其貼于干凈的粘附載玻
片上，之后置恒溫展片臺(tái)上烘干；染色前置65°C 20分鐘以暖片；7)常規(guī)蘇木精-伊紅(HE )染色脫去石蠟二甲苯(I) 5分鐘；二甲苯(II) 5分鐘；二甲苯(III) 5分鐘；水化(使細(xì)胞膨脹):100%酒精(I)3分鐘；100%酒精(II)3分鐘；90%酒精3分鐘；80%酒精3分鐘；70%酒精3分鐘；流水沖洗10分鐘；染細(xì)胞核蘇木精染色5分鐘；流水沖洗15分鐘；分化1%鹽酸酒精3 5秒；返藍(lán)流水沖洗10 15分鐘；染細(xì)胞質(zhì)伊紅5分鐘；脫水70%酒精3分鐘；80%酒精3分鐘；95%酒精3分鐘；100%酒精(I) 3分鐘；100%酒精(II) 3分鐘；透明二甲苯(I) 5分鐘；二甲苯(II) 5分鐘；二甲苯(III) 5分鐘；封片用中性樹(shù)膠封固支架切片。8)顯微鏡不同放大倍數(shù)下(40、100和400倍)觀察記錄支架切片HE染色的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，見(jiàn)圖4。(2)取本實(shí)施例中制備的干細(xì)胞外基質(zhì)支架材料按照如下方法檢測(cè)孔隙率、機(jī)械強(qiáng)度I)孔隙率采用Nettles DL文獻(xiàn)所報(bào)道的壓汞法測(cè)定支架孔隙率。測(cè)定支架體積后抽真空，將汞充至多孔支架周圍，再?gòu)耐獠繉?duì)汞加壓，記錄壓力和加壓過(guò)程中進(jìn)入孔中汞的體積，孔隙率即為進(jìn)入孔中汞的體積/多孔材料的體積。計(jì)算得本實(shí)施例干細(xì)胞外基質(zhì)支架材料的孔隙率的實(shí)驗(yàn)結(jié)果為91. 5%±2. 84% ；2)機(jī)械強(qiáng)度的檢測(cè)方法和結(jié)果支架塊制備成直徑為6mm、高度為6mm大小的圓柱體，用型號(hào)為model5943的Instron電子動(dòng)靜態(tài)萬(wàn)能材料試驗(yàn)機(jī)測(cè)試抗壓性能,壓縮速度為0. lmm/min。干細(xì)胞外基質(zhì)支架材料機(jī)械強(qiáng)度的實(shí)驗(yàn)結(jié)果為3. 8±0. 6Kpa。(3)取本實(shí)施例中制備的干細(xì)胞外基質(zhì)支架材料按如下方法檢測(cè)細(xì)胞接種率I)支架塊制備成直徑為6mm、高度為3mm大小的圓柱體，事先用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液浸泡I小時(shí)以上，浸泡時(shí)注意用鑷子將支架內(nèi)的氣體盡可能地?cái)D出；2)用0. 25%胰蛋白酶消化已傳至P2或P3的軟骨細(xì)胞，計(jì)數(shù)并制備所需要的細(xì)胞懸液量Wl ;接種的細(xì)胞量每毫升不低于5 X IO6個(gè)。
3)采取動(dòng)態(tài)細(xì)胞接種法每個(gè)I. 5ml離心管內(nèi)加入Iml培養(yǎng)液及I個(gè)支架，置臺(tái)式振蕩器上以50次/min的頻率孵育I. 5小時(shí)；4)結(jié)束后取出支架置12孔皿內(nèi)，每孔加入2ml含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，置二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)于37°C、5%C02、飽和濕度條件下培養(yǎng)；同時(shí)計(jì)數(shù)I. 5ml離心管內(nèi)剩余的軟骨細(xì)胞數(shù)為W2，支架細(xì)胞接種率為=(W1-W2)/W1X 100%。干細(xì)胞外基質(zhì)支架材料的細(xì)胞接種率約為56%。5)24小時(shí)后將支架取出，置換到新的6孔皿內(nèi)繼續(xù)同上條件下培養(yǎng)，2天換液一次，到實(shí)驗(yàn)所需時(shí)間后取出行支架上接種的種子細(xì)胞存活率的檢測(cè)。(4)取本實(shí)施例制備的干細(xì)胞基質(zhì)支架材料按如下方法檢測(cè)接種的種子細(xì)胞存活率I)取種子細(xì)胞接種培養(yǎng)3天后的支架，去除培養(yǎng)液，用HBSS液沖洗3次，注意將培 養(yǎng)液沖洗干凈，以免影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。2)取事先配備好的 SYTO 10 green fluorescent nucleic acid stain 和 DEADRed nucleic acid stain,每個(gè)支架標(biāo)本加入500 ii I染液,室溫、避光條件下孵育15分鐘。3)吸去染色液，用HBSS液沖洗3次。后用4%戊二醛固定30 60分鐘，HBSS液沖洗3次。4)在熒光顯微鏡下觀察視野下的紅染細(xì)胞(R)和藍(lán)染細(xì)胞數(shù)(B)，紅染細(xì)胞即為死亡細(xì)胞，藍(lán)染細(xì)胞即為存活細(xì)胞。每個(gè)視野的種子細(xì)胞存活率=B/ (R+B)X100%，隨意取5個(gè)不同視野，計(jì)算種子細(xì)胞存活率的均數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果干細(xì)胞外基質(zhì)支架材料接種的種子細(xì)胞的存活率為95. 4%。(5)取本實(shí)施例制備的干細(xì)胞外基質(zhì)支架材料按如下方法測(cè)定膠原含量I)稱取20mg支架，用剪刀細(xì)細(xì)剪碎后置1.5ml Eppendorf管，再加入I I. 5ml木瓜蛋白酶溶液，在65°C水浴中24小時(shí)，12000g離心，取上清液待檢。2)羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)品及支架標(biāo)本經(jīng)步驟I消化后的上清液分別與4NNaOH和去離子水按照表I和表2相混合，終體積為50 yl。表I
權(quán)利要求
1.一種基于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的細(xì)胞外基質(zhì)支架材料，其特征在于該細(xì)胞外基質(zhì)支架是通過(guò)如下方法獲得的 (1)全骨髓培養(yǎng)法原代培養(yǎng)幼兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞取2-3周齡幼兔股骨和/或脛骨，消毒后置裝有無(wú)菌生理鹽水的培養(yǎng)皿中，在無(wú)菌條件下開(kāi)放股骨和/或脛骨兩端骨髓腔，用生理鹽水沖洗骨髓腔，收集骨髓沖 洗液，800 1200轉(zhuǎn)/分速度離心8 10分鐘，棄上清液，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞沉淀用DMEM基培混懸，并計(jì)數(shù)，以I X IO8細(xì)胞密度將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞接種于直徑為150mm培養(yǎng)皿，每皿加含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液20ml，置二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行單層高密度培養(yǎng)，6 8天后進(jìn)行第一次換液，之后每3天換液一次，整個(gè)培養(yǎng)周期為30 40天； (2)收集細(xì)胞外基質(zhì)，并冷凍干燥棄步驟(I)培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液，將皿底膜狀或膠凍狀的細(xì)胞外基質(zhì)收集至裝有含IOmM EDC和IOmM NHS的交聯(lián)液的棕色玻璃容器中，浸泡20^25小時(shí)后先用5mMNa2HP04洗2飛遍，每次20 30分鐘，再用雙蒸水漂洗2飛次，每次20^30分鐘，然后120(Tl800轉(zhuǎn)/分速度離心8 15分鐘，收集沉淀物經(jīng)冷凍干燥得到基于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的細(xì)胞外基質(zhì)支架材料。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的細(xì)胞外基質(zhì)支架材料，其特征在于經(jīng)凍干得到的細(xì)胞外基質(zhì)支架材料根據(jù)軟骨缺損區(qū)或體外實(shí)驗(yàn)所需修剪成合適的大小和形狀，經(jīng)環(huán)氧乙烷滅菌得到整體分裝包。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的細(xì)胞外基質(zhì)支架材料，其特征在于步驟(2)所述的冷凍干燥是將所述的沉淀物放入-80°C的深低溫冰箱或液氮罐內(nèi)冷凍成型，將得到的細(xì)胞外基質(zhì)固體物置冷凍干燥機(jī)的托盤(pán)上；冷凍干燥機(jī)需事先啟動(dòng)I I. 5小時(shí)預(yù)凍達(dá)到-65飛(TC，然后將細(xì)胞外基質(zhì)固體物在溫度-55 _75°C、真空度I IOKPa條件下，經(jīng)冷凍干燥處理24 48小時(shí)得到白色或銀白色或象牙色的三維多孔狀基于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的細(xì)胞外基質(zhì)支架材料。
4.權(quán)利要求I所述的基于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的細(xì)胞外基質(zhì)支架材料的制備方法，其特征在于包含如下步驟 (1)全骨髓培養(yǎng)法原代培養(yǎng)幼兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞取2-3周齡幼兔股骨和/或脛骨，消毒后置裝有無(wú)菌生理鹽水的培養(yǎng)皿中，在無(wú)菌條件下開(kāi)放股骨和/或脛骨兩端骨髓腔，用生理鹽水沖洗骨髓腔，收集骨髓沖洗液，800 1200轉(zhuǎn)/分速度離心8 10分鐘，棄上清液，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞沉淀用DMEM基培混懸，并計(jì)數(shù)，以I X IO8細(xì)胞密度將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞接種于直徑為150mm培養(yǎng)皿，每皿加含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液20ml，置二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行單層高密度培養(yǎng)，6 8天后進(jìn)行第一次換液，之后每3天換液一次，整個(gè)培養(yǎng)周期為30 40天； (2)收集細(xì)胞外基質(zhì)，并冷凍干燥棄步驟(I)培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液，將皿底膜狀或膠凍狀的細(xì)胞外基質(zhì)收集至裝有含IOmM EDC和IOmM NHS的交聯(lián)液的棕色玻璃容器中，浸泡20 25小時(shí)后先用5mM Na2HPO4洗2飛遍，每次20 30分鐘，再用雙蒸水漂洗2飛次，每次20^30分鐘，然后120(Tl800轉(zhuǎn)/分速度離心8 15分鐘，收集沉淀物經(jīng)冷凍干燥得到基于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的細(xì)胞外基質(zhì)支架材料。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于經(jīng)凍干得到的細(xì)胞外基質(zhì)支架材料根據(jù)軟骨缺損區(qū)或體外實(shí)驗(yàn)所需修剪成合適的大小和形狀，經(jīng)環(huán)氧乙烷滅菌得到整體分裝包。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于步驟(2)所述的冷凍干燥是將所述的沉淀物放入_80°C的深低溫冰箱或液氮罐內(nèi)冷凍成型，將得到的細(xì)胞外基質(zhì)固體物置冷凍干燥機(jī)的托盤(pán)上；冷凍干燥機(jī)需事先啟動(dòng)I I. 5小時(shí)預(yù)凍達(dá)到_60°C，然后將細(xì)胞外基質(zhì)固體物在-55 _70°C、真空度I IOKPa條件下，經(jīng)冷凍干燥處理24 48小時(shí)，得到白色或銀白色或象牙色的三維多孔狀基于骨髓間充質(zhì)干細(xì) 胞來(lái)源 的細(xì)胞外基質(zhì)支架材料。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物材料領(lǐng)域，公開(kāi)了一種細(xì)胞外基質(zhì)支架材料及其制備方法。本發(fā)明細(xì)胞外基質(zhì)支架材料是通過(guò)體外單層高密度培養(yǎng)幼兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，收集其分泌的細(xì)胞外基質(zhì),應(yīng)用凍干技術(shù)及合適的交聯(lián)劑將其制備成具有一定孔徑和孔隙率的三維多孔狀支架材料。該材料可以根據(jù)軟骨缺損區(qū)或體外實(shí)驗(yàn)所需，任意修剪成合適的大小和形狀，經(jīng)環(huán)氧乙烷滅菌得到整體分裝包。本發(fā)明細(xì)胞外基質(zhì)支架材料以干細(xì)胞作為細(xì)胞外基質(zhì)支架的材料來(lái)源，組織來(lái)源廣、增殖能力強(qiáng)、自體即可獲得充足的細(xì)胞量，避免了胚胎干細(xì)胞所牽涉的社會(huì)倫理學(xué)的問(wèn)題。
文檔編號(hào)A61L27/36GK102743790SQ201210240648
公開(kāi)日2012年10月24日 申請(qǐng)日期2012年7月11日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月11日
發(fā)明者唐成, 徐燕, 王黎明, 金成哲 申請(qǐng)人:唐成, 徐燕, 王黎明, 金成哲