專利名稱：替普瑞酮防治嗎啡所致的肝臟損傷的用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種替普瑞酮的新用途，具體是替普瑞酮在制備預防嗎啡所致的肝臟損傷的藥物中的應用，屬于醫(yī)藥技術領域。
背景技術：
阿片類藥物的濫用已經成為國內外關注的嚴重的社會問題。嗎啡作為一種強有效的鎮(zhèn)痛劑常用于治療急性和慢性疼痛，是阿片類藥物的一種。但長期應用嗎啡會導致多個系統(tǒng)和器官的細胞死亡和凋亡，其臨床應用受到很大的限制(Nestler EJ, AghajanianGK. Molecular and cellular basis of addiction. Science. 1997 ；278 :58-63. Yin D，Mufson RA, Wang R，Shi Y. Fas- Mediated cell death promoted by opioids. Nature. 1999; 397-218. Hu S， ShengWSj Lokensgard JRj Peterson PK. Morphine induces apoptosis of human microgliaand neurons. Neuropharmacology. 2002 ；42 :829—836.)。其中，嗎啡對肝臟的損害是顯著而又嚴重的，這已是為醫(yī)學界所證實的事實。尋找保護嗎啡所致的肝臟損傷的藥物對于降低嗎啡的副作用及更廣泛地應用嗎啡具有重要的意義。替普瑞麗(geranylgeranylacetone，GGA),即6，10，14，18-四甲基-5，9，13，17-十九烷四烯-2-酮的單順式和全反式異構體的混合物，現(xiàn)已被廣泛應用于消化道潰瘍的治療中。近年研究發(fā)現(xiàn)，GGA對光損傷、缺血性腎衰竭、癲癇和腦梗塞等疾病具有防治作用(Tanito M, Kwon Y. W, Kondo N，Bai J, Masutani H，Nakamura H，F(xiàn)ujii J, OhiraA, Yodoi J. Cytoprotective effects of geranylgeranylacetone against retinalphotooxidative damage, J Neurosci 2005; 25， 2396—404; Suzuki S， MaruyamaS, Sato W, Morita Y，Sato F，Miki Y，Kato S，Katsuno M，Sobue G，Yuzawa Y，Matsuo S. geranylgeranylacetone ameliorates ischemic acute renal failure viainduction of Hsp70. Kidney Int 2005;67:2210-20; Fujiki M， Kobayashi H， Inoue R，Tatsuya R， Ishii K. Single oral dose of geranylgeranylacetone for protectionagainst delayed neuronal death induced by transient ischemia. Brain Res2004;1020:210-213; Yasuda H， Shichinohe H， Kuroda S， Ishikawa T， Iwasaki Y.Neuroprotective effect of a heat shock protein inducer, geranylgeranylacetonein permanent focal cerebral ischemia. Brain Res 2005; 1032:176-182)。替普瑞酮是否可以用于防治嗎啡所致的肝臟損傷尚未見報道。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種替普瑞酮的新用途，即替普瑞酮在制備預防嗎啡所致的肝臟損傷藥物中的應用。本發(fā)明所述的應用是以替普瑞酮為活性成分在制備預防和/或治療嗎啡所致的肝臟損傷的的作用。
本發(fā)明所述應用中還可以加入一種或多種藥物上可接受的輔料，所述輔料包括藥學領域常規(guī)的填充劑、稀釋劑、粘合劑、賦形劑、吸收促進劑、填充劑、表面活性劑和穩(wěn)定劑等，必要時還可加入香味劑、色素和甜味劑等。本發(fā)明所述應用除制成膠囊外，還可以制成丸齊IJ、粉劑、片齊IJ、粒劑、口服液和注射液等多種形式。本發(fā)明動物實驗結果顯示(I)預先口服GGA，2小時后注射嗎啡，連續(xù)7天后，檢測小鼠肝臟細胞內pro-caspase-9的表達情況。發(fā)現(xiàn)預先口服一定濃度的GGA,能夠抑制嗎啡導致的caspase-9的激活；(2)預先口服GGA，2小時后注射嗎啡，連續(xù)7天后，檢測小鼠肝臟細胞內caspase-3的表達情況，發(fā)現(xiàn)預先口服一定濃度的GGA，能夠抑制嗎啡導致的caspase-3的激活；(3)預先口服GGA，2小時后注射嗎啡，連續(xù)7天后，檢測小鼠肝臟細胞內丙二醛(MDA)的表達水平，發(fā)現(xiàn)預先口服一定濃度的GGA，能夠抑制嗎啡導致的丙二醛(MDA)的增加；上述實驗結果表明在肝臟中GGA可以抑制嗎啡所致的細胞凋亡和脂質過氧化損傷。因此，替普瑞酮可用于防治嗎啡所致的肝臟損傷。 由于替普瑞酮在制備防治嗎啡所致的肝臟損傷的藥物中的作用是首次發(fā)現(xiàn)，因此，無論是GGA單獨使用為活性成分制成的藥劑，還是利用GGA防治嗎啡所致的肝臟損傷的作用與其他活性成分配合使用制成的藥劑，均在本專利的保護范圍之內。本發(fā)明的藥物具有以下優(yōu)點(1)療效顯著；(2)安全性高；(3)價格低廉，可以減輕病人的經濟負擔。(4)老藥新用，無需進行臨床藥物毒性的實驗。


圖I是替普瑞酮在肝臟中抑制嗎啡所致的caspase-9的激活的實驗分析結果。圖2是替普瑞酮在肝臟中抑制嗎啡所致的caspase-3的激活的實驗分析結果。圖3是替普瑞酮在肝臟中抑制嗎啡所致的丙二醛(MDA)的增加的實驗分析結果。圖中為不添加，“ + ”為添加。
具體實施例方式下面通過附圖和實施例對本發(fā)明作進一步詳細說明，但本發(fā)明保護范圍不局限于所述內容。本發(fā)明實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法，本發(fā)明實施例中使用的細胞、試劑、材料取材、蛋白提取方法、蛋白免疫印跡法檢測肝臟方法如下
I、實驗動物=SPF級C57BL/6小鼠，雄性，6_7周齡，體重22_25g，由重慶醫(yī)科大學實驗動物中心提供；小鼠單籠隔離飼養(yǎng)，飼喂專用飼料，自由飲食和飲水。2、藥品替普瑞酮(日本衛(wèi)材公司生產，分子量330. 55)，鹽酸嗎啡注射液(東北制藥集團公司沈陽第一制藥廠)，丙二醒(MDA) ELISA試劑盒(美國RD公司),抗caspase-9抗體和抗caspase-3抗體(美國Santa Cruz公司)。3、組織取材方法小鼠猝死后，用生理鹽水進行灌流，然后取出小鼠的肝臟組織，液氮冷凍后，-80°C保存。4、蛋白提取將肝臟組織在冰浴下勻漿，并加入700微升的細胞裂解液(150 mMNaCl,0. 5% NP-40,IOmM Tris-HCl, pH 7. 2,0. ImM PMSF，2ug/ml aprotinin,200ug/mlNaN3),然后轉移到離心管中，冰浴下放置裂解30min (中間振蕩2 3次)，4°C下15000 rpm離心15min，轉上清至新離心管中，-80°C保存。5、蛋白免疫印跡法
總蛋白加樣量為20 ii g，與2XSDS凝膠加樣緩沖液混合后，95°C熱變性5 min，用15 %的SDS-PAGE膠電泳分離后，將蛋白條帶電轉移到PVDF膜上，用10 %脫脂牛奶4°C封閉過夜；取出PVDF膜，用含0. I % Tween-20的TPBS沖洗后，加入500倍稀釋的一抗室溫孵育60 min ;用含0. 1% Tween-20的TPBS沖洗，加入10000倍稀釋的二抗室溫孵育60 min ;用含0. 1% Tween-20的TPBS沖洗，將PVDF膜浸入發(fā)光底物溶液中反應3 min后，用X射線膠片曝光。實施例I :替普瑞酮在肝臟中抑制嗎啡所致的caspase-9的激活
小鼠分成4組(每組6只)對照組(saline)、嗎啡組(Mor)、GGA和嗎啡組(GGA+Mor)、 GGA組。從第I天到7天，Saline組和Mor組預先灌胃給予生理鹽水，GGA+Mor組和GGA組預先灌胃給予GGA (800 mg/kg)，2 h后，Saline組和GGA組腹腔注射生理鹽水，Mor組和GGA+Mor組腹腔注射嗎啡(每天注射的劑量為10、20、40、60、80、100 and 100 mg/kg)。在最后一次嗎啡注射2 h后，分離小鼠的肝臟組織，提取蛋白，用蛋白免疫印跡法檢測肝臟細胞內pro-caspase-9的表達變化情況。圖I結果顯示，預先灌注GGA可以抑制嗎啡所致的pro-caspase-9的減少,這說明替普瑞酮在肝臟中可抑制嗎啡所致的caspase-9的激活,抵抗嗎啡對線粒體的損傷。實施例2 :替普瑞酮在肝臟中抑制嗎啡所致的caspase-3的激活
小鼠分成4組(每組6只)對照組(saline)、嗎啡組(Mor)、GGA和嗎啡組(GGA+Mor)、GGA組。從第I天到7天，Saline組和Mor組預先灌胃給予生理鹽水，GGA+Mor組和GGA組預先灌胃給予GGA (800 mg/kg)，2 h后，Saline組和GGA組腹腔注射生理鹽水，Mor組和GGA+Mor組腹腔注射嗎啡(每天注射的劑量為10、20、40、60、80、100 and 100 mg/kg)。在最后一次嗎啡注射2 h后，分離小鼠的肝臟組織，提取蛋白，用蛋白免疫印跡法檢測肝臟細胞內caspase-3的表達變化情況。圖2結果顯示,預先灌注GGA可以抑制嗎啡所致的activecaspase-3的增加,這說明替普瑞酮在肝臟中可抑制嗎啡所致的caspase-3的激活,抵抗嗎啡所致的細胞凋亡。
實施例3 :替普瑞酮在肝臟中抑制嗎啡所致的丙二醛(MDA)的增加小鼠分成4組(每組6只)對照組(saline)、嗎啡組(Mor)、GGA和嗎啡組(GGA+Mor)、GGA組。從第I天到7天，Saline組和Mor組預先灌胃給予生理鹽水，GGA+Mor組和GGA組預先灌胃給予GGA (800 mg/kg)，2 h后，Saline組和GGA組腹腔注射生理鹽水，Mor組和GGA+Mor組腹腔注射嗎啡(每天注射的劑量為10、20、40、60、80、100 and 100 mg/kg)。在最后一次嗎啡注射2 h后，分離小鼠的肝臟組織，在冰浴中用磷酸鹽緩沖液制備成10 %的勻漿，高速冷凍離心機離心10 min (4 0C >4000 rpm條件下)，取上清液，使用丙二醛(MDA)ELISA試劑盒檢測丙二醛(MDA)的含量。圖3結果顯示，預先灌注GGA可以抑制嗎啡所致的丙二醛(MDA)的增加(與saline組小鼠對比，*/ < 0. 05 ;與Mor組小鼠對比，#p < 0.05)。這說明替普瑞酮在肝臟中可抑制嗎啡所致的脂質過氧化，抵抗嗎啡所致的氧化損傷。
權利要求
1.替普瑞酮在制備防治嗎啡所致的肝臟損傷的藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及替普瑞酮在制備防治嗎啡所致的肝臟損傷的藥物中的新用途，本發(fā)明公開了替普瑞酮可以保護肝臟細胞免受嗎啡的毒害，可以抑制嗎啡引起的細胞凋亡，減弱嗎啡所致的脂質過氧化損傷，替普瑞酮可用于嗎啡所致的肝臟損傷的預防與治療。
文檔編號A61K31/121GK102764248SQ20121024075
公開日2012年11月7日 申請日期2012年7月12日 優(yōu)先權日2012年7月12日
發(fā)明者梁敏, 白潔, 羅富成, 趙璐 申請人:昆明理工大學