專利名稱：包含抗微小rna 反義寡核苷酸的藥物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及包含含LNA的單鏈寡核苷酸的藥物組合物，所述寡核苷酸能夠抑制誘導(dǎo)疾病的微小 RNA，特別是人微小 RNA miR-19b、miR-21、miR-122A、miR-155 和 miR-375。
背景技術(shù)：
微小RNA —某閔表汰的新型調(diào)節(jié)劑微小RNA (mi RNA)是小內(nèi)源RNA的豐富類別，其通過與其靶mRNA堿基配對(duì)來(lái)充
當(dāng)基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)劑。成熟miRNA通過RNA酶III核糖核酸酶Drosha (Lee等人
2003)和Dicer(Hutvagner等人2001, Ketting等人2001)由較長(zhǎng)的發(fā)夾轉(zhuǎn)錄物進(jìn)行順次加工。根據(jù)2005年10月的miRBase微小RNA數(shù)據(jù)庫(kù)版本7. I (Griffith-Jones2004,Griffith-Jones等人2006)，迄今為止超過3400種miRNA已在脊椎動(dòng)物、無(wú)脊椎動(dòng)物和植物中得到注釋，并且對(duì)應(yīng)假定基因的許多miRNA也已得到鑒定。大多數(shù)動(dòng)物miRNA通過不完全的堿基配對(duì)來(lái)識(shí)別位于3’ -UTRs中的其靶位點(diǎn)，導(dǎo)致祀基因的反應(yīng)抑制(Bartel2004)。越來(lái)越多的大量研究顯示動(dòng)物miRNA在下述方面起基本生物作用細(xì)胞生長(zhǎng)和凋亡(Brennecke等人2003)、造血細(xì)胞譜系分化(Chen等人
2004)、壽命調(diào)節(jié)(Boehm和Slack2005)、光感受器分化(Li和Carthew2005)、同源框基因調(diào)節(jié)(Yekta等人2004、Hornstein等人2005)、神經(jīng)元不對(duì)稱(Johnston等人2004)、胰島素分泌(Poy等人2004)、腦形態(tài)發(fā)生(Giraldez等人2005)、肌增埴和分化(CheruMandel等人2005、Kwon等人2005、Sokol和Ambros2005)、心臟發(fā)生(Zhao等人2005)和脊椎動(dòng)物中的晚期胚胎發(fā)育(Wienholds等人2005)。人疾病中的微小RNAmiRNA涉及廣泛多樣的人疾病。ー種是脊髄性肌萎縮(SMA)，由運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元(SMN)基因的存活減少的蛋白質(zhì)水平或功能缺失突變引起的兒科神經(jīng)變性疾病(Paushkin等人2002)。人SLITRK1基因中的miR-189的靶位點(diǎn)中的突變近期已顯示與圖雷特氏綜合征相關(guān)(Abelson等人2005)，而另ー項(xiàng)近期研究報(bào)道丙型肝炎病毒(HCV)RNA基因組與宿主細(xì)胞微小RNA——肝特異性miR-122a相互作用，以促進(jìn)其在宿主中的復(fù)制(Jopling等人2005)。其中已涉及miRNA或其加工機(jī)制的其他疾病包括由脆性X智力低下蛋白質(zhì)(FMRP)的不存在引起的脆性X智力低下(FXMR) (Nelson等人2003，Jin等人2004)和迪格奧爾綜合征(Landthaler 等人 2OO4)此外，紊亂的miRNA表達(dá)模式已在許多人癌癥中得到報(bào)道。例如，人miRNA基因miR15a和miR16_l在大多數(shù)B細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞白血病(CLL)情況下是被刪除或下調(diào)的，其中13種miRNA基因的獨(dú)特標(biāo)記近期顯不與預(yù)后和進(jìn)展相關(guān)(Calin等人2002, Calin等人2005)。miRNA在癌癥中的作用進(jìn)ー步得到下述事實(shí)的支持超過50%的人miRNA基因位于癌癥相關(guān)的基因組區(qū)域中或脆性位點(diǎn)上(Calin等人2004)。近期，人癌癥的多祥性的系統(tǒng)表達(dá)分析掲示與正常組織比較，腫瘤中的miRNA的一般下調(diào)(Lu等人2005)。有趣的是，分化不良腫瘤的基于miRNA的分類是成功的，然而當(dāng)應(yīng)用于相同樣品吋，mRNA譜是高度不準(zhǔn)確的。miRNA也已顯示在乳腺癌(Iorio等人2005)、肺癌(Johnson等人2005)和結(jié)腸癌(Michael等人2004)中是下調(diào)的，然而在人B細(xì)胞淋巴瘤中擴(kuò)增的miR-17_92簇，和在伯基特氏淋巴瘤中上調(diào)的miR-155已報(bào)道為第一種人miRNA癌基因(Eis等人2005，He等人2005)。因此,人miRNA將不僅作為生物標(biāo)記用于未來(lái)的癌癥診斷是高度有用的,而且快速出現(xiàn)為吸引人的靶用于通過寡核苷酸技術(shù)的疾病干預(yù)。使用單鏈寡核苷酸抑制微小RNA幾種寡核苷酸方法已報(bào)道用于抑制miRNA。W003/029459 (Tuschl)要求保護(hù)編碼長(zhǎng)度為18 — 25個(gè)核苷酸的微小RNA及其
互補(bǔ)物，其可以包含核苷酸類似物。LNA提議為可能的核苷酸類似物，盡管未公開包含寡核苷酸的LNA。Tuschl要求保護(hù)可以在治療中使用的miRNA寡核苷酸。US2005/0182005公開了與最長(zhǎng)形式的miR21互補(bǔ)的24聚體2’OMe RNA寡核糖核苷酸，發(fā)現(xiàn)其減少miR21誘導(dǎo)的抑制，然而包含寡核苷酸的等同DNA則不是。術(shù)語(yǔ)2’OMe-RNA指其中在第2’位上存在對(duì)甲基的取代的RNA類似物(2’ O甲基)。US2005/0227934 (Tuschl)涉及具有高達(dá) 50% DNA 殘基的 antimir 分子。還報(bào)道包含2’ OMe RNA的antimir針對(duì)胰腺微小RNA使用，但看起來(lái)未公開實(shí)際的寡核苷酸結(jié)構(gòu)。US20050261218 (ISIS)要求保護(hù)包含第一個(gè)區(qū)域和第二個(gè)區(qū)域的寡聚化合物，其中至少ー個(gè)區(qū)域包含修飾，和寡聚化合物的部分靶向小的非編碼RNA靶核酸，其中小的非編碼RNA靶核酸是miRNA。要求保護(hù)長(zhǎng)度為17 — 25個(gè)核苷酸的寡聚化合物。實(shí)施例涉及完全地2’ OMe PS化合物，21聚體和20聚體，和靶向針對(duì)一系列前miRNA和成熟miRNA靶的2’ OMe gapmer寡核昔酸。Boutla 等人 2003 (Nucleic Acids Research 31 :4973-4980)描述了與果妮中的11種不同miRNA互補(bǔ)的DNA反義寡核苷酸及其通過將DNA寡核苷酸注入蒼蠅胚胎內(nèi)滅活miRNA的用途。在11種DNA反義寡核苷酸中，只有4種構(gòu)建體顯示嚴(yán)重干擾正常發(fā)育，而剩余7種寡核苷酸不顯示任何表型，可能由于其不能抑制所述miRNA。這一方法的替代方法已由Hutvagner等人(2004)和Leaman等人(2005)報(bào)道,其中與成熟miRNA互補(bǔ)的2’-0_甲基反義寡核苷酸可以在體外和體內(nèi)在果蜆屬(Drosophila)和美麗線蟲(C. elegans)用作短干擾RNA (siRNA)和miRNA功能的潛在和不可逆的抑制劑，從而誘導(dǎo)功能缺失表型。這種方法的缺點(diǎn)是在轉(zhuǎn)染和注射實(shí)驗(yàn)中需要高2’-0_甲基寡核苷酸濃度(100微摩爾)，這對(duì)動(dòng)物可能是有毒的。這種方法近期應(yīng)用于小鼠研究，通過使與4種不同miRNA互補(bǔ)的2’ -O-甲基反義寡核苷酸和膽固醇綴合用于在體內(nèi)沉默miRNA (Krutzfedt等人2005)。這些所謂的antagomirs通過靜脈內(nèi)注射施用于小鼠。盡管這些實(shí)驗(yàn)導(dǎo)致內(nèi)源性miRNA在體內(nèi)的有效沉默，這發(fā)現(xiàn)是特異性、有效的和長(zhǎng)效的，主要缺點(diǎn)是需要高劑量(80mg/kg) 2’ -O-Meantagomir用于有效沉默。使用LNA修飾的寡核苷酸抑制miRNA先前已由Chan等人Cancer Research2005,65 (14) 6029-6033, Lecellier 等人 Science2005，308，557-560，Naguibneva 等人 NatureCell Biology20068 (3)，278_84 和 0rum 等人 Gene2006, (Available online 24February2006)進(jìn)行描述。在所有情況下,LNA修飾的抗-mi r寡核苷酸與整個(gè)成熟的微小RNA互補(bǔ)，即長(zhǎng)度為20 — 23個(gè)核苷酸，其阻遏分子的有效體內(nèi)攝取和廣泛的生物分布。Naguibneva (Naguibneva 等人 Nature Cell Biology2006 8 描述了 mixmerDNA-LNA-DNA反義寡核苷酸抗-mir在體外抑制微小RNA miR-181功能的用途，其中8個(gè)LNA核苷酸的區(qū)塊位于側(cè)面分別為在5’末端上的6DNA核苷酸,和在3’末端上的9DNA核苷酸的分子中心。這種反義設(shè)計(jì)的主要缺點(diǎn)是由于側(cè)面DNA末端的低核酸酶抗性的低體內(nèi)穩(wěn)定性。盡管Chan 等人(Chan 等人 Cancer Research 2OO5,65( 14)6029_6033),和 0Γ11Π1等人(0rum等人Gene2006，(2006年2月24日在線可獲得)未公開在其研究中使用的LNA修飾的抗-mir 分子的設(shè)計(jì)，Lecellier 等人(Lecellier 等人 Science2005, 308, 557-560)描述了 gapmer LNA-DNA-LNA反義寡核苷酸抗_mir抑制微小RNA功能的用途，其中4個(gè)LNA寡核苷酸的區(qū)塊分別位于5’末端和3’末端,其中13個(gè)DNA核苷酸的窗ロ在分子的中心。由于抗-mir寡核苷酸中的13核苷酸DNA串，這種反義設(shè)計(jì)的主要缺點(diǎn)是低體內(nèi)攝取以及 低體內(nèi)穩(wěn)定性。因此，本領(lǐng)域需要能夠抑制微小RNA的改進(jìn)的寡核苷酸。發(fā)明概述本發(fā)明基于下述發(fā)現(xiàn)設(shè)計(jì)為以高親和力與miRNA靶結(jié)合的短寡核苷酸的使用在體內(nèi)減輕由微小RNA造成的mRNA阻遏中是高度有效的。盡管不希望受任何特定理論束縛，但本文公開的證據(jù)指出miRNA在體內(nèi)的高度有效靶向通過設(shè)計(jì)寡核苷酸來(lái)達(dá)到，目的是在體內(nèi)與miRNA靶形成高度穩(wěn)定的雙鏈體。這通過在短的例如10 — 17個(gè)或10 — 16個(gè)核苷酸堿基寡核苷酸中使用高親和カ核苷酸類似物例如至少ー個(gè)LNA單元和適當(dāng)?shù)剡M(jìn)ー步的高親和カ核苷酸類似物來(lái)達(dá)到,所述高親和力核苷酸類似物例如LNA、2’ -氟核苷酸類似物的2’ -MOE RNA,。在ー個(gè)方面，目的是產(chǎn)生這樣長(zhǎng)度的寡核苷酸，其不可能形成s iRNA復(fù)合物(即短寡核苷酸)，并且具有高親和カ核苷酸類似物的足夠負(fù)荷，使得寡核苷酸幾乎永久與其miRNA靶粘著，與miRNA靶有效形成穩(wěn)定和無(wú)功能的雙鏈體。已發(fā)現(xiàn)此類設(shè)計(jì)明顯比現(xiàn)有技術(shù)寡核苷酸更有效，特別是gapmer和blockmer設(shè)計(jì)以及具有長(zhǎng)的長(zhǎng)度例如20 — 23聚體的寡核苷酸。術(shù)語(yǔ)2’氟-DNA指其中在2’位置上存在氟取代的DNA類似物(2’F)。本發(fā)明提供了藥物組合物，其包含長(zhǎng)度為8 — 17個(gè)，例如10 - 17個(gè)，例如8 —16個(gè)或10 — 16個(gè)核苷酸堿基單元的寡核苷酸，和藥學(xué)上可接受的稀釋劑、載體或輔劑，其中所述單鏈寡核苷酸的至少ー個(gè)核苷酸堿基単元是高親和力核苷酸類似物，例如鎖定核酸(LNA)核苷酸堿基單元，和其中所述單鏈寡核苷酸與選自人微小RNA miR-19b、miR-21、miR-122A、miR-155和miR-375的人微小RNA序列互補(bǔ)。本發(fā)明提供了藥物組合物，其包含長(zhǎng)度為10 — 26個(gè)核苷酸堿基單元的寡核苷酸，和藥學(xué)上可接受的稀釋劑、載體或輔劑，其中所述寡核苷酸包含從3’末端計(jì)數(shù)第2 — 7位或第3 — 8位的核心DNA序列3’ acgttt 5’ (SEQ ID NO 6,5’ tttgca 3’),其中所述序列中的至少ー個(gè)，例如I個(gè)，優(yōu)選至少2個(gè)，例如2個(gè)或3個(gè)DNA單元已由其相應(yīng)的LNA單元置換，和任選地其中所述寡核苷酸不包含超過7個(gè)連續(xù)DNA単元的區(qū)域。本發(fā)明提供了藥物組合物，其包含長(zhǎng)度為10 — 26個(gè)核苷酸堿基單元的寡核苷酸，和藥學(xué)上可接受的稀釋劑、載體或輔劑，其中所述寡核苷酸包含從3’末端計(jì)數(shù)第2 — 7位或第3 — 8位的核心DNA序列3，ctcaca 5，(SEQ ID NO 7,5，acactc 3’)，其中所述序列中的至少ー個(gè)，例如I個(gè)，優(yōu)選至少2個(gè)，例如2個(gè)或3個(gè)DNA單元已由其相應(yīng)的LNA單元置換，和任選地其中所述寡核苷酸不包含超過7個(gè)連續(xù)DNA単元的區(qū)域。本發(fā)明提供了藥物組合物，其包含長(zhǎng)度為10 — 26個(gè)核苷酸堿基單元的寡核苷酸，和藥學(xué)上可接受的稀釋劑、載體或輔劑，其中所述寡核苷酸包含從3’末端計(jì)數(shù)第2 — 7位或第3 — 8位的核心DNA序列3’ ttacga 5’ (SEQ ID NO 8,5’ agcatt 3’),其中所述序列中的至少ー個(gè)，例如I個(gè)，優(yōu)選至少2個(gè)，例如2個(gè)或3個(gè)DNA單元已由其相應(yīng)的LNA單元置換，和任選地其中所述寡核苷酸不包含超過7個(gè)連續(xù)DNA単元的區(qū)域。本發(fā)明提供了藥物組合物，其包含長(zhǎng)度為10 — 26個(gè)核苷酸堿基單元的單鏈寡核苷酸，和藥學(xué)上可接受的稀釋劑、載體或輔劑，其中所述寡核苷酸包含從3’末端計(jì)數(shù)第2 —7位或第3 — 8位的核心DNA序列3’ acaagc 5’ (SEQ ID NO 9,5’cgaaca 3’)，其中所述序列中的至少ー個(gè)，例如I個(gè)，優(yōu)選至少2個(gè)，例如2個(gè)或3個(gè)DNA單元已由其相應(yīng)的LNA 単元置換，和其中所述寡核苷酸不包含超過7個(gè)連續(xù)DNA単元的區(qū)域。本發(fā)明提供了藥物組合物，其包含長(zhǎng)度為10 — 26個(gè)核苷酸堿基單元的單鏈寡核苷酸，和藥學(xué)上可接受的稀釋劑、載體或輔劑，其中所述寡核苷酸包含從3’末端計(jì)數(shù)第2 —7位或第 3 — 8位的核心 DNA 序列 3’cgaata 5’ (SEQ ID NO 10，5’ataagc 3’)，其中所述序列中的至少ー個(gè)，例如I個(gè)，優(yōu)選至少2個(gè)，例如2個(gè)或3個(gè)DNA單元已由其相應(yīng)的LNA単元置換，和其中所述寡核苷酸不包含超過I個(gè)連續(xù)DNA単元的區(qū)域。高親和カ核苷酸類似物是導(dǎo)致這樣的寡核苷酸的核苷酸類似物，所述寡核苷酸與互補(bǔ)RNA核苷酸具有比等同DNA核苷酸的結(jié)合親和カ更高的熱雙鏈體穩(wěn)定性。這一般通過測(cè)量Tm來(lái)測(cè)定。當(dāng)使用靶向針對(duì)特異性miRNA的這些短的、高親和カ寡核苷酸時(shí)，我們未鑒定到任何顯著的脫靶效應(yīng)。事實(shí)上，本文提供的證據(jù)指出對(duì)mRNA表達(dá)的影響是由于在mRNA內(nèi)的針對(duì)靶miRNA (初級(jí)mRNA靶)的互補(bǔ)序列的存在，或?qū)τ沙跫?jí)mRNA靶調(diào)節(jié)的mRNA (次級(jí)mRNA IE)的次級(jí)影響。未鑒定到毒性效應(yīng)，指出無(wú)顯著有害的脫祀效應(yīng)。本發(fā)明進(jìn)一歩提供了根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸，例如可以形成藥物組合物的組成部分的那些，用于制備用于治療與微小RNA的存在或過量表達(dá)(上調(diào))相關(guān)的疾病或醫(yī)學(xué)病癥的藥物的用途。本發(fā)明進(jìn)一歩提供了用于治療與微小RNA的存在或過量表達(dá)相關(guān)的疾病或醫(yī)學(xué)病癥的方法，其包括給需要治療的人施用根據(jù)本發(fā)明的組合物(例如藥物組合物)。本發(fā)明進(jìn)一歩提供了用于減少細(xì)胞或生物中的miRNA的有效量的方法，其包括給所述細(xì)胞或生物施用根據(jù)本發(fā)明的組合物(例如藥物組合物)或單鏈寡核苷酸。在這種背景中減少有效量指存在于細(xì)胞或生物中的功能miRNA的減少。應(yīng)認(rèn)識(shí)到根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的寡核苷酸并非一直顯著減少細(xì)胞或生物中的miRNA的實(shí)際量，因?yàn)樗鼈円话闩c其miRNA靶形成非常穩(wěn)定的雙鏈體。本發(fā)明進(jìn)ー步提供了用于細(xì)胞或生物中的miRNA的靶mRNA去阻遏的方法，其包括給所述細(xì)胞或生物施用根據(jù)本發(fā)明的組合物(例如藥物組合物)或單鏈寡核苷酸。本發(fā)明進(jìn)一步提供了長(zhǎng)度為8 — 16個(gè)例如8 — 16個(gè)例如10 — 16個(gè)核苷酸堿基的單鏈寡核苷酸，用于制備用于治療與微小RNA的存在或過量表達(dá)相關(guān)的疾病或醫(yī)學(xué)病癥的藥物的用途。本發(fā)明進(jìn)一歩提供了用于治療與微小RNA的存在或過量表達(dá)相關(guān)的疾病或醫(yī)學(xué)病癥的方法，其包括給需要治療的人施用長(zhǎng)度為8 — 16個(gè)例如10 — 16個(gè)核苷酸堿基的單鏈寡核苷酸。本發(fā)明進(jìn)一歩提供了用于減少細(xì)胞或生物中的miRNA靶的有效量(B卩，可用于阻遏靶mRNA的miRNA量)的方法，其包括給所述細(xì)胞或生物施用包含8 — 16個(gè)例如10 — 16個(gè)核苷酸堿基的單鏈寡核苷酸的組合物(例如藥物組合物)。本發(fā)明進(jìn)一歩提供了用于細(xì)胞或生物中的miRNA的靶mRNA去阻遏的方法，其包括給所述細(xì)胞或生物施用包含8 — 16個(gè)例如10 — 16個(gè)核苷酸堿基的單鏈寡核苷酸(或包含所述寡核苷酸的組合物)。本發(fā)明進(jìn)ー步提供了用于合成針對(duì)選自人微小RNA miR-19b, miR-21, miR-122A,miR-155和miR-375的人微小RNA的單鏈寡核苷酸例如本文描述的單鏈寡核苷酸的方法，所述方法包括下述步驟a.任選選擇由3’末端計(jì)數(shù)的第I個(gè)核苷酸堿基，其為核苷酸類似物，例如LNA核
昔酸喊基。b.任選選擇由3’末端計(jì)數(shù)的第2個(gè)核苷酸堿基，其為核苷酸類似物，例如LNA核
昔酸喊基。c.選擇對(duì)應(yīng)miRNA種區(qū)域的單鏈寡核苷酸的區(qū)域，其中所述區(qū)域如本文定義的。d.任選選擇如本文定義的第7個(gè)和第8個(gè)核苷酸堿基。e.任選選擇I 一 10個(gè)進(jìn)一歩的核苷酸堿基，其可以選自核苷酸(X)和核苷酸類似物(X)例如LNA。f.任選選擇如本文定義的單鏈寡核苷酸的5’區(qū)域。g.任選選擇如本文定義的單鏈寡核苷酸的5’末端。其中所述合成通過步驟a — g中定義的區(qū)域的順次合成來(lái)進(jìn)行，其中所述合成可以以3’ 一 5’(a至g)或5’ 一 3’(g至a)方向來(lái)進(jìn)行，和其中所述單鏈寡核苷酸與miRNA靶的序列互補(bǔ)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，寡核苷酸設(shè)計(jì)為不受RISC募集或介導(dǎo)RISC指導(dǎo)的miRNA靶切割。已考慮到通過使用與miRNA靶互補(bǔ)的長(zhǎng)寡核苷酸，例如21或22聚體，特別是RNA寡核苷酸，或RNA ‘類似物’寡核苷酸，寡核苷酸可以就RISC復(fù)合物結(jié)合而言競(jìng)爭(zhēng)靶mRNA，且由此經(jīng)由引入作為底物競(jìng)爭(zhēng)miRNA的寡核苷酸來(lái)減輕miRNA靶mRNA的miRNA阻遏。然而，本發(fā)明尋求通過提供與成熟微小RNA能夠互補(bǔ)，且在某些情況下明顯幾乎不可逆結(jié)合的寡核苷酸來(lái)阻止此類不希望有的靶mRNA切割或翻譯抑制。這看起來(lái)導(dǎo)致針對(duì)降解或切割(例如通過RISC或RNA酶H或其他核酸內(nèi)切酶或核酸外切酶)的保護(hù)形式，這可能不導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的miRNA的基本或甚至顯著減少(例如，如使用LNA探針通過RNA印跡檢測(cè)的)，但確保如通過去阻遏分析測(cè)量的miRNA的有效量顯著減少。因此，在ー個(gè)方面，本發(fā)明提供了這樣的寡核苷酸，其有目的地設(shè)計(jì)為不與RISC復(fù)合物相客，但通過寡核苷酸經(jīng)由滴定來(lái)去除miRNA。盡管不希望受本發(fā)明的寡核苷酸為何如此有效的具體理論的束縛，與基于RNA的寡核苷酸類似(或完全的2’ OMe寡核苷酸)，看起來(lái)根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸通過miRNA功能的非競(jìng)爭(zhēng)性抑制來(lái)起作用，因?yàn)樗鼈冇行コ龔募?xì)胞質(zhì)中可獲得的miRNA，其中作為現(xiàn)有技術(shù)寡核苷酸提供了備選miRNA底物，這可以充當(dāng)競(jìng)爭(zhēng)抑制劑，取決于細(xì)胞質(zhì)中的寡核苷酸濃度、以及靶mRNA和miRNA的濃度，其有效性將相差很遠(yuǎn)。盡管不希望受任何具體理論的束縛，但使用與miRNA靶(即miRNA)幾乎相似長(zhǎng)度的寡核苷酸可能存在的一個(gè)可能性是寡核苷酸可以與miRNA靶形成SiRNA樣雙鏈體，這是將減少寡核苷酸的有效性的情況。還可能寡核苷酸其自身可以用作RISC復(fù)合物內(nèi)的指導(dǎo)鏈，從而產(chǎn)生非特異性靶的RISC指導(dǎo)的降解的可能性，這僅碰巧與寡核苷酸指導(dǎo)具有足夠的互補(bǔ)性。通過選擇用于靶向miRNA序列的短寡核苷酸，避免了此類問題。摻入LNA的短寡核苷酸由試劑區(qū)域已知，例如LNA(參見例如W02005/098029和WO2006/069584)。然而，設(shè)計(jì)用于診斷或試劑用途的分子在設(shè)計(jì)方面與用于藥學(xué)用途的那些·非常不同。例如，試劑寡聚體的末端核苷酸堿基一般不是LNA，而是DNA，并且核苷間鍵一般與用于在本發(fā)明的寡核苷酸中使用的優(yōu)選鍵硫代磷酸酯不同。本發(fā)明因此提供了寡核苷酸自身的新型類別。本發(fā)明進(jìn)一步提供了如在本發(fā)明的藥物組合物的背景中描述的(單鏈)寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含i )至少一個(gè)硫代磷酸酯鍵和/或ii)至少一個(gè)3’末端LNA單元，和/或iii)至少一個(gè)5’末端LNA單元。對(duì)于大多數(shù)治療用途優(yōu)選的是寡核苷酸是完全硫代磷酸酯化的一用于在CNS中使用的治療寡核苷酸例外，例如在其中硫代磷酸酯化可以是毒性的腦或脊柱中，和由于不存在核酶，甚至在連續(xù)DNA單元之間也可以使用磷酸二酯鍵。如本文提及的，根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸的其他優(yōu)選方面是第2個(gè)3’核苷酸堿基，和/或第9個(gè)和第10個(gè)(由3’末端)也可以是LNA。本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)其他方法來(lái)避免RNA切割(例如血清中的核酸外切酶降解，或根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸的RISC相關(guān)切割是可能的，并且像這樣本發(fā)明還提供了包含下述的單鏈寡核苷酸a.在由3’末端計(jì)數(shù)的第I和2位上的LNA單元和/或b.在同樣由3’末端計(jì)數(shù)的第9位和/或第10位上的LNA單元，和/或c. I 個(gè)或 2 個(gè) 5’LNA 單元。盡管這些其他方面的利益可能由更長(zhǎng)的寡核苷酸，例如長(zhǎng)度高達(dá)26個(gè)核苷酸堿基單元的核苷酸可見，但考慮這些特征還可以與本文提及的較短寡核苷酸一起使用，例如本文描述的8 — 17個(gè)、8 — 16個(gè)、10 — 17個(gè)或10 — 16個(gè)核苷酸堿基的寡核苷酸。高度優(yōu)選的是寡核苷酸包含高親和力核苷酸類似物，例如本文提及的那些，最優(yōu)選LNA單元。本發(fā)明人因此已驚奇地發(fā)現(xiàn)包含以特定順序的鎖定核酸(LNA)單元的精心設(shè)計(jì)的單鏈寡核苷酸顯示對(duì)微小RNA的顯著沉默，導(dǎo)致減少的微小RNA水平。發(fā)現(xiàn)所述寡核苷酸與所謂的種子序列的緊密結(jié)合是重要的，所述種子序列是由靶微小RNA的5’末端計(jì)數(shù)的核苷酸2 — 8或2 — 7。靶微小RNA的核苷酸I是非配對(duì)堿基，并且最可能隱藏在Ago2蛋白質(zhì)的結(jié)合袋中。盡管不希望受具體理論束縛，但本發(fā)明人考慮通過選擇種區(qū)域的序列，特別是對(duì)于在與種區(qū)域互補(bǔ)的區(qū)域中包含LNA優(yōu)選LNA單元的寡核苷酸，miRNA和寡核苷酸之間的雙鏈體在靶向miRNA中特別有效，避免脫靶效應(yīng)，并且可能提供阻止RISI指導(dǎo)的miRNA功能的進(jìn)一步特征。本發(fā)明人已驚奇地發(fā)現(xiàn)當(dāng)LNA修飾的單鏈寡核苷酸在3’末端上不包含對(duì)應(yīng)這種非配對(duì)的核苷酸I的核苷酸時(shí)，微小RNA沉默甚至更加增強(qiáng)。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)在根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸的3’末端中的2個(gè)LNA單元使得所述寡核苷酸是高度核酸酶抗性的。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)在對(duì)應(yīng)從靶微小RNA的5’末端計(jì)數(shù)的第10和11位的位置中具有至·少一個(gè)核苷酸類似物例如LNA核苷酸的本發(fā)明的寡核苷酸可以預(yù)防本發(fā)明的寡核苷酸的切割。因此，在本發(fā)明的一個(gè)方面涉及長(zhǎng)度為12 - 26個(gè)核苷酸的寡核苷酸，其中i)由3’末端計(jì)數(shù)的第I個(gè)核苷酸是鎖定核酸(LNA)單元；·ii)由3’末端計(jì)數(shù)的第2個(gè)核苷酸是LNA單元；和iii)由3’末端計(jì)數(shù)的第9個(gè)和/或第10個(gè)核苷酸是LNA單元。本發(fā)明進(jìn)一步提供了用作藥物的如本文定義的寡核苷酸。本發(fā)明進(jìn)一步涉及包含本文定義的寡核苷酸和藥學(xué)上可接受的載體的組合物。如上文提及的，微小RNA涉及眾多疾病。因此，本發(fā)明的第四個(gè)方面涉及如本文定義的寡核苷酸用于制備用于治療與微小RNA表達(dá)相關(guān)的疾病的藥物的用途，所述疾病選自脊髓性肌萎縮、圖雷特氏綜合征、丙型肝炎、脆性X智力低下、迪格奧爾綜合征和癌癥，例如慢性淋巴細(xì)胞白血病、乳腺癌、肺癌和結(jié)腸癌，特別是癌癥。本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步方面是通過使靶微小RNA與如本文定義的寡核苷酸接觸來(lái)減少靶微小RNA的水平的方法，其中所述寡核苷酸I.與靶微小RNA互補(bǔ)2.在3’末端上不包含對(duì)應(yīng)靶微小RNA的第I個(gè)5’末端核苷酸的核苷酸。本發(fā)明進(jìn)一步提供了包含選自SEQ ID NO 20、SEQ ID NO 21、SEQ ID NO 22、SEQID NO 23、SEQ ID NO 24、SEQ ID NO 25、SEQ ID NO 28、SEQ ID NO 26、SEQ ID NO 27、SEQID NO 82、SEQ ID NO 83、SEQ ID NO 84、SEQ ID NO 85、SEQ ID NO 86、SEQ ID NO 87、SEQID NO 88和SEQ ID NO 89的核苷酸堿基序列的寡核苷酸；其中小寫字母標(biāo)示DNA單元的含氮堿基，和大寫字母標(biāo)示LNA單元的含氮堿基；和其中LNA胞嘧啶是任選被甲基化的，或其綴合物。本發(fā)明進(jìn)一步提供了包含選自SEQ ID NO 11、SEQ ID NO 12、SEQ ID NO 13、SEQID NO 14、SEQ ID NO 15、SEQ ID NO 16、SEQ ID N017、SEQ ID NO 18、SEQ ID NO 19、SEQID NO 90、SEQ ID NO 91、SEQ ID NO 92、SEQ ID NO 93、SEQ ID NO 94、SEQ ID NO 95、SEQID NO 96、SEQ ID NO 97、SEQ ID NO 98、SEQ ID NO 99、SEQ ID NO 100 和 SEQ ID NO 101的核苷酸堿基序列的寡核苷酸；其中小寫字母標(biāo)示DNA單元的含氮堿基，和大寫字母標(biāo)示LNA單元的含氮堿基；和其中LNA胞嘧啶是任選被甲基化的，或其綴合物。本發(fā)明進(jìn)一步提供了包含選自SEQ ID NO 29、SEQ ID NO 30、SEQ ID NO 31、SEQID NO 32、SEQ ID NO 33、SEQ ID NO 34、SEQ ID NO 35、SEQ ID NO 36、SEQ ID NO 37、SEQID NO 102,SEQ ID NO 103,SEQ ID NO 104和SEQ ID NO 105的核苷酸堿基序列的寡核苷酸；其中小寫字母標(biāo)示DNA單元的含氮堿基，和大寫字母標(biāo)示LNA單元的含氮堿基；和其中LNA胞嘧啶是任選被甲基化的，或其綴合物。本發(fā)明進(jìn)一步提供了包含選自SEQ ID NO 47、SEQ ID NO 48、SEQ ID NO 49、SEQID NO 50、SEQ ID NO 51、SEQ ID NO 52、SEQ ID N053、SEQ ID NO 54、SEQ ID NO 55、SEQID NO 106,SEQ ID NO 107,SEQ ID NO 108和SEQ ID NO 109的核苷酸堿基序列的寡核苷
酸；其中小寫字母標(biāo)示DNA單元的含氮堿基，和大寫字母標(biāo)示LNA單元的含氮堿基；和其中LNA胞嘧啶是任選被甲基化的，或其綴合物。本發(fā)明進(jìn)一步提供了包含選自SEQ ID NO 65、SEQ ID NO 66、SEQ ID NO 67、SEQID NO 68和 SEQ ID NO 69、SEQ ID NO 38、SEQ ID N039、SEQ ID NO 40、SEQ ID NO 41、SEQID NO 42、SEQ ID NO 43、SEQ ID NO 44、SEQ ID NO 45 和 SEQ ID NO 46 的核苷酸堿基序列的寡核苷酸；其中小寫字母標(biāo)示DNA單元的含氮堿基，和大寫字母標(biāo)示LNA單元的含氮
堿基；和其中LNA胞嘧啶是任選被甲基化的，或其綴合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，寡核苷酸可以具有I 一 17個(gè)核苷酸堿基的核苷酸堿基序列，例如8、9、10、11、12、13、14、15、16或17個(gè)核苷酸堿基，和像這樣此類實(shí)施方案中的寡核苷酸可以是本文公開的寡核苷酸內(nèi)的連續(xù)子序列。本發(fā)明的本發(fā)明人已驚奇地發(fā)現(xiàn)包含特定核心DNA序列和在所述核心序列中的鎖定核酸(LNA)的特定長(zhǎng)度的反義寡核苷酸顯示優(yōu)異的微小RNA抑制性質(zhì)。附圖簡(jiǎn)述圖I.在表達(dá)miR_122a的細(xì)胞系Huh-7中用不同LNA抗-miR寡核苷酸處理對(duì)靶核酸表達(dá)的影響。顯示的是與未處理的細(xì)胞(模擬試驗(yàn))比較，衍生自miR-122a特異性qRT-PCR的miR-122a (任意單位)的量。LNA抗-miR寡核苷酸分別以2個(gè)濃度I和IOOnM使用。還包括的是對(duì)SPC3349 (在本文中也稱為SPC3549)的錯(cuò)配對(duì)照(SPC3350)。圖I.使用miR-122a實(shí)時(shí)RT-PCR，在體內(nèi)在小鼠肝中，與SPC3372比較，SPC3548和SPC3549的LNA抗-miR_122a knock-down劑量應(yīng)答的評(píng)估。圖2b.在用不同LNA-抗miR處理后在小鼠肝中的miR-122水平。LNA-抗miR分子SPC3372和SPC3649通過3次i. p.注射經(jīng)過6天時(shí)期每隔一日以指示劑量施用于正常小鼠內(nèi)，并在最后一次劑量后48小時(shí)處死。從小鼠肝中提取出總RNA，miR-122通過miR-122特異性qPCR進(jìn)行測(cè)量。圖3.與接受鹽水的對(duì)照小鼠比較，在LNA-抗miR_122a處理的小鼠中的血漿膽固醇水平的評(píng)估。圖4a.使用實(shí)時(shí)定量RT-PCR，與鹽水對(duì)照小鼠比較，在LNA抗miR_122a處理的小鼠中的相對(duì)Bckdk mRNA水平的評(píng)估。圖4b.使用實(shí)時(shí)定量RT-PCR，與鹽水對(duì)照小鼠比較，在LNA抗miR_122a處理的小鼠中的相對(duì)醛縮酶A mRNA水平的評(píng)估。圖4c.使用實(shí)時(shí)定量RT-PCR，與鹽水對(duì)照小鼠(動(dòng)物I 一 3 )比較，在LNA抗miR-122a處理的小鼠(動(dòng)物4 一 30)中的GAPDH mRNA水平的評(píng)估。圖5.使用miR_122a實(shí)時(shí)RT-PCR，在體內(nèi)在小鼠肝中，LNA-抗miR _122aknock-down劑量應(yīng)答的評(píng)估。6組動(dòng)物(5只小鼠/組)以下列方式進(jìn)行處理。組I動(dòng)物通過i. V.用O. 2ml鹽水注射連續(xù)3天，組2接受2. 5mg/kg SPC3372，組3接受6. 25mg/kg，組4 接受 12.5mg/kg 和組 5 接受 25mg/kg，而組 6 接受 25mg/kg SPC3373 (錯(cuò)配 LNA-抗 miR 寡核苷酸)，全都以相同方式。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行重復(fù)(因此n=10)且顯示合并的結(jié)果。圖6.比較SPC3649與SPC3372的RNA印跡。對(duì)來(lái)自每個(gè)組中的I只小鼠的總RNA實(shí)施miR-122特異性RNA印跡。指出在LNA-抗miR和miR-122之間形成的成熟miR-122和雙鏈體(阻斷的微小RNA)。圖7.小鼠用25mg/kg/天LNA-抗miR或鹽水處理連續(xù)3天，且在最后一次劑量后1、2或3周處死。還包括的是來(lái)自在最后一次劑量后24小時(shí)處死的動(dòng)物的值(實(shí)施例11 “舊設(shè)計(jì)”)。miR-122水平通過qPCR進(jìn)行評(píng)估，且在每個(gè)單個(gè)時(shí)間點(diǎn)上相對(duì)于鹽水組的平均值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。還包括的是來(lái)自在最后一次劑量后24小時(shí)處死的動(dòng)物的值(顯示平均值和SD，n=7，24小時(shí)n=10)。處死日9、16或23對(duì)應(yīng)在最后一次劑量后1、2或3周處死。圖8.小鼠用25mg/kg/天LNA-抗miR或鹽水處理連續(xù)3天，且在最后一次劑量后1、2或3周處死。還包括的是來(lái)自在最后一次劑量后24小時(shí)處死的動(dòng)物的值(實(shí)施例
11 “舊設(shè)計(jì)”)。測(cè)量血漿膽固醇且在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)上相對(duì)于鹽水組進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化(顯示平均值和 SD, n=7，24 小時(shí) n=10)。圖9.通過miR-122a的SPC3372抑制的劑量依賴性miR_122a靶mRNA誘導(dǎo)。小鼠如上文描述的用不同SPC3372劑量處理連續(xù)3天，且在最后一次劑量后24小時(shí)處死。對(duì)由肝提取的總RNA實(shí)施qPCR。具有預(yù)測(cè)的miR-122靶位點(diǎn)且觀察到由微陣列分析上調(diào)的基因使用qPCR通過增加的SPC3372劑量就劑量依賴性誘導(dǎo)進(jìn)行研究。對(duì)于指示基因?qū)?lái)自最后一次劑量后24小時(shí)處死的2 — 3只小鼠/組的總肝RNA實(shí)施qPCR。圖9中顯示的是相對(duì)于鹽水組的mRNA水平，n=2 - 3(2. 5 - 12. 5mg/kg/天n=2，無(wú)SD)。還顯示的是錯(cuò)配對(duì)照(mm，SPC3373)。

圖10. SPC3372處理后的miR_122a靶mRNA的瞬時(shí)誘導(dǎo)。NMRI雌性小鼠用25mg/kg/天SPC3372連同鹽水對(duì)照處理連續(xù)3天，且分別在最后一次劑量后1、2或3周處死。RNA由肝提取，并且經(jīng)由qPCR研究通過微陣列數(shù)據(jù)選擇的預(yù)測(cè)miR-122a靶mRNA的mRNA水平。分析來(lái)自每個(gè)組的3個(gè)動(dòng)物。圖11.通過SPC3372處理在肝中的Vldlr的誘導(dǎo)。與先前實(shí)施例(圖10)中相同的肝RNA樣品就Vldlr誘導(dǎo)進(jìn)行研究。圖12.小鼠血漿中的miR-122a/SPC3372雙鏈體的穩(wěn)定性。SPC3372和SPC3372/miR-122a雙鏈體的穩(wěn)定性在小鼠血漿中于37°C經(jīng)過96小時(shí)進(jìn)行測(cè)試。圖12中顯示的是SYBR-Gold 染色的 PAGE。圖13.經(jīng)由SPC3372隔離成熟miR_122a導(dǎo)致雙鏈體形成。圖13中顯示的是由miR-122a特異性探針探測(cè)的(上圖)和由Let_7特異性探針重新探測(cè)的(下圖)膜。使用miR-122探針，可以檢測(cè)到2個(gè)條帶，一個(gè)對(duì)應(yīng)成熟miR-122和一個(gè)對(duì)應(yīng)SPC3372和miR-122之間的雙鏈體。圖14.通過肝切片的原位雜交評(píng)估的經(jīng)由SPC3372的miR_122a隔離連同SPC3372分布。來(lái)自處理動(dòng)物的肝冷凍切片圖15.在miR-122LNA-抗miR處理的小鼠中的肝基因表達(dá)。鹽水和LNA-抗miR處理小鼠通過基因組廣泛表達(dá)譜使用Affymetrix Mouse Genome 430 2. O陣列進(jìn)行比較。(a，I)顯示的是在處理后24小時(shí)LNA-抗miR-122處理的和鹽水處理的小鼠肝樣品中顯示差異表達(dá)的探針數(shù)目。(b，2)在差異表達(dá)基因中的miR-122種子序列的存在。曲線圖顯示在其3’ UTR中具有至少一個(gè)miR-122種子識(shí)別序列的轉(zhuǎn)錄物百分比。隨機(jī)產(chǎn)生隨機(jī)序列且搜索miR-122種子識(shí)別序列。在LNA-抗miR處理小鼠中的瞬間肝基因表達(dá)譜。小鼠用25mg/kg/天LNA-抗miR或鹽水處理連續(xù)3天，且在最后一次劑量后1、2或3周處死。還包括的是來(lái)自最后一次劑量后24小時(shí)處死的動(dòng)物的值。(C，3)還對(duì)來(lái)自不同時(shí)間點(diǎn)的RNA樣品實(shí)施表達(dá)分析。在處理后24小時(shí)、I周或3周LNA-抗miR和鹽水處理小鼠之間鑒定為差異表達(dá)的基因的表達(dá)譜的分層聚類分析。(d，4)隨著時(shí)間過去跟蹤在處理后24小時(shí)LNA-抗miR和鹽水處理小鼠之間鑒定為差異表達(dá)的基因的表達(dá)譜。在LNA-抗miR處理小鼠方法I中隨著時(shí)間-過程上調(diào)和下調(diào)的基因的表達(dá)比，指出LNA-抗miR處理的可逆效應(yīng)。圖16.用SPC3372和3595處理對(duì)小鼠肝中的miR-122水平的影響。圖17.用SPC3372和3595處理對(duì)小鼠肝中的醛縮酶A水平的影響。 圖18.用SPC3372和3595處理對(duì)小鼠肝中的Bckdk水平的影響。圖19.用SPC3372和3595處理對(duì)小鼠肝中的⑶320水平的影響。圖20.用SPC3372和3595處理對(duì)小鼠肝中的Ndrg3水平的影響。圖21.在高膽固醇血癥和正常小鼠中用SPC3649長(zhǎng)期處理對(duì)血漿總膽固醇的影響。血漿的每周樣品每周一次得自SPC3649處理和鹽水對(duì)照小鼠，隨后為血漿總膽固醇的評(píng)估。小鼠用5mg/kg SPC3649、SPC3744或鹽水每周處理2次。給出的正常小鼠進(jìn)行平行處理。圖22.在高膽固醇血癥和正常小鼠中用SPC3649長(zhǎng)期處理對(duì)miR-122水平的影響。圖23.在高膽固醇血癥和正常小鼠中用SPC3649長(zhǎng)期處理對(duì)醛縮酶A水平的影響。圖24.在高膽固醇血癥和正常小鼠中用SPC3649長(zhǎng)期處理對(duì)Bckdk水平的影響。圖25.在高膽固醇血癥和正常小鼠中用SPC3649長(zhǎng)期處理對(duì)AST水平的影響。圖26.在高膽固醇血癥和正常小鼠中用SPC3649長(zhǎng)期處理對(duì)ALT水平的影響。圖27.在Huh-7細(xì)胞模型中SPC3649對(duì)HCV復(fù)制的調(diào)節(jié)。在用不同LNA-抗miR(SPC3648、SPC3649 和 SPC3550)和 2’ OMe antago-mir-122 分子轉(zhuǎn)染后在 Huh_7 細(xì)胞中的HCV RNA的RNA印跡分析(上圖)。定量雜交信號(hào)強(qiáng)度且相對(duì)于在每個(gè)泳道中的血影蛋白mRNA進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化(下圖)。圖28.在內(nèi)源性表達(dá)miR_19b的細(xì)胞系HeLa中經(jīng)由miR_19b阻斷寡核苷酸對(duì)具有miR-19b靶的花蟲螢光素酶的功能去阻遏?！癿iR-19b靶”是具有miR_19b靶但不與寡聚體阻斷miR-19b共轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒，且因此表示完全miR-19b阻遏的花蟲螢光素酶表達(dá)。圖29.在內(nèi)源性表達(dá)miR-122的細(xì)胞系Huh_7中經(jīng)由miR-122阻斷寡核苷酸對(duì)具有miR-122靶的花蟲螢光素酶的功能去阻遏。“miR-122靶”是具有miR-122靶但不與寡聚體阻斷miR-122共轉(zhuǎn)染的相應(yīng)質(zhì)粒，且因此表示完全miR-122阻遏的花蟲螢光素酶表達(dá)。圖30.舉例說明根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸和微小RNA靶的比對(duì)的圖。發(fā)明詳述本發(fā)明的寡核苷酸典型地是單鏈的。因此應(yīng)當(dāng)理解在本發(fā)明的背景中，術(shù)語(yǔ)寡核苷酸可以與術(shù)語(yǔ)單鏈寡核苷酸互換使用。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了藥物組合物，其包含與人微小RNA互補(bǔ)的長(zhǎng)度為8 — 17個(gè)核苷酸堿基，例如10 - 17個(gè)核苷酸堿基的短(單鏈)寡核苷酸。短寡核苷酸在體內(nèi)減輕miRNA阻遏方面特別有效。發(fā)現(xiàn)將高親和力核苷酸類似物摻入寡核苷酸內(nèi)導(dǎo)致高度有效的抗微小RNA分子，其表現(xiàn)出經(jīng)由與微小RNA靶形成幾乎不可逆的雙鏈體來(lái)起作用，而不是基于RNA切割的機(jī)制，例如與RNA酶H或RISC相關(guān)的機(jī)制。高度優(yōu)選的是根據(jù)本發(fā)明的單鏈寡核苷酸包含與人微小RNA種區(qū)域100%互補(bǔ)的連續(xù)核苷酸堿基序列的區(qū)域。優(yōu)選的是根據(jù)本發(fā)明的單鏈寡核苷酸與成熟的人微小RNA序列互補(bǔ)。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的寡核苷酸與選自has_miR19b、hsa_miR21、hsa-miR 122、hsa-miR 142a 7b> hsa-miR 155、hsa_miR 375 的 miRNA 序列互補(bǔ)。在一個(gè)實(shí)施方案中,根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸在3’末端上不包含對(duì)應(yīng)祀微小RNA的
第I個(gè)5’末端核苷酸的核苷酸堿基。在一個(gè)實(shí)施方案中，由3’末端計(jì)數(shù),根據(jù)本發(fā)明的單鏈寡核苷酸的第I個(gè)核苷酸堿基是核苷酸類似物例如LNA單元。在一個(gè)實(shí)施方案中，由3’末端計(jì)數(shù),根據(jù)本發(fā)明的單鏈寡核苷酸的第2個(gè)核苷酸堿基是核苷酸類似物例如LNA單元。在一個(gè)實(shí)施方案中，由3’末端計(jì)數(shù)，根據(jù)本發(fā)明的單鏈寡核苷酸的第9個(gè)和/或第10個(gè)核苷酸是核苷酸類似物例如LNA單元。在一個(gè)實(shí)施方案中，由3’末端計(jì)數(shù),根據(jù)本發(fā)明的單鏈寡核苷酸的第9個(gè)核苷酸堿基是核苷酸類似物例如LNA單元。在一個(gè)實(shí)施方案中，由3’末端計(jì)數(shù),根據(jù)本發(fā)明的單鏈寡核苷酸的第10個(gè)核苷酸堿基是核苷酸類似物例如LNA單元。在一個(gè)實(shí)施方案中，由3’末端計(jì)數(shù)，根據(jù)本發(fā)明的單鏈寡核苷酸的第9個(gè)和第10個(gè)核苷酸堿基是核苷酸類似物例如LNA單元。在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的單鏈寡核苷酸不包含超過5個(gè)連續(xù)DNA核苷酸單元的區(qū)域。在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的單鏈寡核苷酸不包含超過6個(gè)連續(xù)DNA核苷酸單元的區(qū)域。在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的單鏈寡核苷酸不包含超過7個(gè)連續(xù)DNA核苷酸單元的區(qū)域。在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的單鏈寡核苷酸不包含超過8個(gè)連續(xù)DNA核苷酸單兀的區(qū)域。在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的單鏈寡核苷酸不包含超過3個(gè)連續(xù)DNA核苷酸單元的區(qū)域。在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的單鏈寡核苷酸不包含超過2個(gè)連續(xù)DNA核苷酸單元的區(qū)域。在一個(gè)實(shí)施方案中，單鏈寡核苷酸包含至少由至少2個(gè)連續(xù)核苷酸類似物單元例如至少2個(gè)連續(xù)LNA單元組成的區(qū)域。在一個(gè)實(shí)施方案中，單鏈寡核苷酸包含至少由至少3個(gè)連續(xù)核苷酸類似物單元例如至少3個(gè)連續(xù)LNA單元組成的區(qū)域。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的單鏈寡核苷酸不包含超過7個(gè)連續(xù)DNA核苷酸類似物單元例如LNA單元的區(qū)域。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的單鏈寡核苷酸不包含超過6個(gè)連續(xù)DNA核苷酸類似物單元例如LNA單元的區(qū)域。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的單鏈寡核苷酸不包含超過5個(gè)連續(xù)DNA核苷酸類似物單元例如LNA單元的區(qū)域。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的單鏈寡核苷酸不包含超過4個(gè)連續(xù)DNA核苷酸類似物單元例如LNA單元的區(qū)域。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的單鏈寡核苷酸不包含超過3個(gè)連續(xù)DNA核苷酸類似物單元例如LNA單元的區(qū)域。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的單鏈寡核苷酸不包含超過2個(gè)連續(xù)DNA核苷酸類似物單元例如LNA單元的區(qū)域。在一個(gè)實(shí)施方案中，單鏈寡核苷酸的第I或2個(gè)3’核苷酸堿基對(duì)應(yīng)微小RNA序列的第2個(gè)5’核苷酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，如由單鏈寡核苷酸的區(qū)域3’末端測(cè)量的單鏈寡核苷酸的核苷酸堿基單元I 一 6 (包括端點(diǎn)在內(nèi))與微小RNA種區(qū)域的序列互補(bǔ)。在一個(gè)實(shí)施方案中，如由單鏈寡核苷酸的區(qū)域3’末端測(cè)量的單鏈寡核苷酸的核苷酸堿基單元I 一 7 (包括端點(diǎn)在內(nèi))與微小RNA種區(qū)域的序列互補(bǔ)。在一個(gè)實(shí)施方案中，如由單鏈寡核苷酸的區(qū)域3’末端測(cè)量的單鏈寡核苷酸的核 苷酸堿基單元2 — 7 (包括端點(diǎn)在內(nèi))與微小RNA種區(qū)域的序列互補(bǔ)。在一個(gè)實(shí)施方案中，單鏈寡核苷酸在與miRNA種區(qū)域互補(bǔ)的區(qū)域內(nèi)的位置中包含至少一個(gè)核苷酸類似物單元，例如至少一個(gè)LNA單元。在一個(gè)實(shí)施方案中，單鏈寡核苷酸在與miRNA種區(qū)域互補(bǔ)的區(qū)域內(nèi)的位置中可以包含I 一 6個(gè)或I 一 7個(gè)核苷酸類似物單元，例如I 一 6個(gè)和I 一 7個(gè)LNA單元。在一個(gè)實(shí)施方案中，與微小RNA種區(qū)域的序列互補(bǔ)的單鏈寡核苷酸的核苷酸堿基序列選自以 3’ 一5’ 方向讀取的(X) Xxxxxx, (X) xXxxxx, (X) xxXxxx, (X) xxxXxx, (X)xxxxXx和(X) xxxxxX，其中“X”指核苷酸類似物，(X)指可選存在的核苷酸類似物例如LNA單元，和“X”指DNA或RNA核苷酸單元。在一個(gè)實(shí)施方案中，單鏈寡核苷酸在與miRNA種區(qū)域互補(bǔ)的位置中包含至少2個(gè)核苷酸類似物單元，例如至少2個(gè)LNA單元。在一個(gè)實(shí)施方案中，與miRNA種區(qū)域的序列互補(bǔ)的單鏈寡核苷酸的核苷酸堿基序列選自(X)XXxxxx>(X)XxXxxx>(X)XxxXxx>(X)XxxxXx>(X)XxxxxX>(X)xXXxxx>(X)xXxXxx>(X) xXxxXx、(X) xXxxxX、(X) xxXXxx、(X) xxXxXx、(X) xxXxxX、(X) xxxXXx、(X) xxxXxX 和(X) xxxxXX，其中“X”指核苷酸類似物例如LNA單元，(X)指可選存在的核苷酸類似物例如LNA單元，和“X”指DNA或RNA核苷酸單元。在一個(gè)實(shí)施方案中，單鏈寡核苷酸在與miRNA種區(qū)域互補(bǔ)的位置中包含至少3個(gè)核苷酸類似物單元，例如至少3個(gè)LNA單元。在一個(gè)實(shí)施方案中，與微小RNA種區(qū)域的序列互補(bǔ)的單鏈寡核苷酸的核苷酸堿基序列選自(X) XXXxxx> (X) xXXXxx、(X) xxXXXx、(X) xxxXXX、(X) XXxXxx, (X) XXxxXx, (X)ΧΧχχχΧ、(X) χΧΧχΧχ、(X) χΧΧχχΧ、(X) χχΧΧχΧ、(X) XxXXxx, (X) XxxXXx, (X) ΧχχχΧΧ、(X)χΧχΧΧχ、(X) χΧχχΧΧ、(X) χχΧχΧΧ、(X) χΧχΧχΧ 和(X) ΧχΧχΧχ，其中 “X” 指核苷酸類似物例如LNA單元，(X)指可選存在的核苷酸類似物例如LNA單元，和“X”指DNA或RNA核苷酸單元。在一個(gè)實(shí)施方案中，單鏈寡核苷酸在與miRNA種區(qū)域互補(bǔ)的位置中包含至少4個(gè)核苷酸類似物單元，例如至少4個(gè)LNA單元。在一個(gè)實(shí)施方案中，與微小RNA種區(qū)域的序列互補(bǔ)的單鏈寡核苷酸的核苷酸堿基序列選自(X) xxXXX、(X) xXxXXX、(X) xXXxXX、(X) xXXXxX、(X) χΧΧΧΧχ、(X) ΧχχΧΧΧΧ、(X)ΧχΧχΧΧ、( X ) ΧχΧΧχΧ、( X ) XxXXx、( X ) ΧΧχχΧΧ、( X ) ΧΧχΧχΧ、( X ) ΧΧχΧΧχ、( X ) ΧΧΧχχΧ、( X ) ΧΧΧχΧχ和(X) XXXXxx，其中“X”指核苷酸類似物例如LNA單元，(X)指可選存在的核苷酸類似物例如LNA單元，和“X”指DNA或RNA核苷酸單元在一個(gè)實(shí)施方案中，單鏈寡核苷酸在與miRNA種區(qū)域互補(bǔ)的位置中包含至少5個(gè)核苷酸類似物單元，例如至少5個(gè)LNA單元。在一個(gè)實(shí)施方案中，與微小RNA種區(qū)域的序列互補(bǔ)的單鏈寡核苷酸的核苷酸堿基序列選自(X) xXXXXX> (X) XxXXXX、(X) XXxXXX、(X) XXXxXX, (X) XXXXxX 和(X) XXXXXx，其中“X”指核苷酸類似物例如LNA單元，(X)指可選存在的核苷酸類似物例如LNA單元，和“χ”指DNA或RNA核苷酸單元。在一個(gè)實(shí)施方案中，單鏈寡核苷酸在與miRNA種區(qū)域互補(bǔ)的位置中包含6個(gè)或7個(gè)核苷酸類似物單元，例如6個(gè)或7個(gè)LNA單元。在一個(gè)實(shí)施方案中，與微小RNA種區(qū)域的序列互補(bǔ)的單鏈寡核苷酸的核苷酸堿基序列選自 XXXXXX、XxXXXXX、XXxXXXX、XXXxXXX、XXXXxXX、XXXXXxX 和 XXXXXXx，其中 “X” 指核苷酸類似物例如LNA單元，例如LNA單元，和“χ”指DNA或RNA核苷酸單元。在一個(gè)實(shí)施方案中，由單鏈寡核苷酸的3’末端計(jì)數(shù)，在第7-8位的兩個(gè)核苷酸堿基基序選自XX、XX、XX和XX，其中“X”指核苷酸類似物例如LNA單元，例如LNA單元，和“χ”指DNA或RNA核苷酸單元。在一個(gè)實(shí)施方案中，由單鏈寡核苷酸的3’末端計(jì)數(shù),在第7 — 8位的兩個(gè)核苷酸堿基基序選自XX、xX和Xx，其中“X”指核苷酸類似物例如LNA單元，例如LNA單元，和“χ”指DNA或RNA核苷酸單元在一個(gè)實(shí)施方案中，單鏈寡核苷酸包含至少12個(gè)核苷酸堿基，和其中由單鏈寡核苷酸的3’末端計(jì)數(shù)，在第11 - 12位的兩個(gè)核苷酸堿基基序選自χχ、ΧΧ、χΧ和Χχ，其中“X”指核苷酸類似物例如LNA單元，例如LNA單元，和“χ”指DNA或RNA核苷酸單元。在一個(gè)實(shí)施方案中，單鏈寡核苷酸包含至少12個(gè)核苷酸堿基，和其中由單鏈寡核苷酸的3’末端計(jì)數(shù)，在第11 - 12位的兩個(gè)核苷酸堿基基序選自ΧΧ、χΧ和Χχ，其中“X”指核苷酸類似物例如LNA單元，例如LNA單元，和“χ”指DNA或RNA核苷酸單元。在一個(gè)實(shí)施方案中，單鏈寡核苷酸包含至少13個(gè)核苷酸堿基,和其中由3’末端計(jì)數(shù)，在第11 - 13位的三個(gè)核苷酸堿基基序選自XXX、Χχχ、χΧχ、χχΧ、ΧΧχ、ΧχΧ、χΧΧ和XXX，其中“X”指核苷酸類似物例如LNA單元，例如LNA單元，和“χ”指DNA或RNA核苷酸單元。在一個(gè)實(shí)施方案中，由單鏈寡核苷酸的3’末端計(jì)數(shù)，在第11 - 13位的三個(gè)核苷酸堿基基序選自Χχχ、χΧχ、χχΧ、XXx, XxX, χΧΧ和XXX，其中“X”指核苷酸類似物例如LNA單元，例如LNA單元,和“χ”指DNA或RNA核苷酸單元。在一個(gè)實(shí)施方案中，單鏈寡核苷酸包含至少14個(gè)核苷酸堿基，和其中由3’末端計(jì)數(shù)，在第11 一 14位的四個(gè)核苷酸堿基基序選自XXXX、Xxxx、xXxx、xxXx、xxxX、XXxx、XxXx、XxxX、xXXx、xXxX、xxXX、XXXx、XxXX、xXXX、XXxX 和 ΧΧΧΧ，其中 “X” 指核苷酸類似物例如 LNA單元，例如LNA單元,和“χ”指DNA或RNA核苷酸單元。在一個(gè)實(shí)施方案中，由3’末端計(jì)數(shù)，在單鏈寡核苷酸的第11 - 14位的四個(gè)核苷酸喊基基序選自 Χχχχ、χΧχχ、χχΧχ、χχχΧ、ΧΧχχ、ΧχΧχ、ΧχχΧ、χΧΧχ、χΧχΧ、χχΧΧ、ΧΧΧχ、ΧχΧΧ、χΧΧΧ、XXxX和ΧΧΧΧ，其中“X”指核苷酸類似物例如LNA單元，例如LNA單元，和“χ”指DNA或RNA核苷酸單元。
在一個(gè)實(shí)施方案中，單鏈寡核苷酸包含15個(gè)核苷酸堿基,和其中由3’末端計(jì)數(shù)，在第11 — 15位的五個(gè)核苷酸喊基基序選自Xxxxx、xXxxx、xxXxx、xxxXx、xxxxX、XXxxx>XxXxx > XxxXx > XxxxX > xXXxx、xXxXx、xXxxX、xxXXx、xxXxX、xxxXX、XXXxx > XXxxX > XxxXX >xXXXx、xxXXX、XXxXX、XxXxX、XXXXx、XXXxX、XXxXX、XxXXXX、xXXXX 和 XXXXX，其中 “X” 指核苷酸類似物例如LNA單元，例如LNA單元，和“χ”指DNA或RNA核苷酸單元。在一個(gè)實(shí)施方案中，單鏈寡核苷酸包含16個(gè)核苷酸堿基,和其中由單鏈寡核苷酸的3’末端計(jì)數(shù),在第11 — 16位的六個(gè)核苷酸堿基基序選自Xxxxxx、xXxxxx、xxXxxx、xxxXxx、xxxxXx、xxxxxX、XXxxxx、XxXxxx、XxxXxx、XxxxXx、XxxxxX、xXXxxx、xXxXxx、xXxxXx、xXxxxX、xxXXxx、xxXxXx、xxXxxX、xxxXXx、xxxXxX、xxxxXX、XXXxxx、XXxXxx、XXxxXx、XXxxxX、ΧχΧΧχχΛ XxXxXxλ XxXxxXλ XxxXXxλ ΧχχΧχΧ、ΧχχχΧΧ、χΧΧΧχχ、χΧΧχΧχ、χΧΧχχΧ、χΧχΧΧχ、χΧχΧχΧ、χΧχχΧΧ、χχΧΧΧχ、χχΧΧχΧ、χχΧχΧΧ、χχχΧΧΧ、ΧΧΧΧχχ、ΧΧΧχχΧ、ΧΧχχΧΧ、XxxXXX、χχΧΧΧΧ、χΧχΧΧΧ、ΧχΧχΧΧ、ΧΧχΧχΧ、ΧΧΧχΧχ、χΧΧχΧΧ、ΧχΧΧχΧ、ΧΧχΧΧχ、χΧΧΧχΧ、ΧχΧΧΧχ、χΧΧΧΧχ、χΧΧΧΧΧ、ΧχΧΧΧΧ、ΧΧχΧΧΧ、ΧΧΧχΧΧ、ΧΧΧΧχΧ、ΧΧΧΧΧχ 和 ΧΧΧΧΧΧ，其中 “X” 指核苷酸類似物例如 LNA 單元，例如LNA單元,和“χ”指DNA或RNA核苷酸單元。 在一個(gè)實(shí)施方案中，由3’末端計(jì)數(shù)，在單鏈寡核苷酸的第11 - 16位的六個(gè)核苷酸堿基基序是χχΧχχΧ，其中“X”指核苷酸類似物例如LNA單元，例如LNA單元，和“χ”指DNA或RNA核苷酸單元。在一個(gè)實(shí)施方案中，3個(gè)最5’末端的核苷酸堿基選自Χχχ、χΧχ、χχΧ、ΧΧχ、ΧχΧ、χΧΧ和XXX，其中“X”指核苷酸類似物例如LNA單元，例如LNA單元，和“χ”指DNA或RNA核苷酸單元。在一個(gè)實(shí)施方案中，“χ”指DNA單元。在一個(gè)實(shí)施方案中，單鏈寡核苷酸在5’末端包含核苷酸類似物單元例如LNA單
J Li ο在一個(gè)實(shí)施方案中，核苷酸類似物單元例如X獨(dú)立地選自2’-O-烷基-RNA單元、2’ -OMe-RNA單元、2’ -氨基-DNA單元、2’ -氟-DNA單元、LNA單元、PNA單元、HNA單元、INA單元。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的單鏈寡核苷酸的所有核苷酸堿基都是核苷酸類似物單元。在一個(gè)實(shí)施方案中，核苷酸類似物單元例如X獨(dú)立地選自2’ -OMe-RNA單元、2’ _氣基_DNA單兀和LNA單兀。在一個(gè)實(shí)施方案中，單鏈寡核苷酸包含所述至少一個(gè)LNA類似物單元和至少一個(gè)除LNA以外的其它核苷酸類似物單元。在一個(gè)實(shí)施方案中，非LNA核苷酸類似物單元獨(dú)立地選自2’ -OMe-RNA單元和2’ -氣-DNA單兀。在一個(gè)實(shí)施方案中，單鏈寡核苷酸由至少一個(gè)序列XYX或YXY組成，其中X是LNA和Y是2’ -OMe-RNA單元或2’ -氟-DNA單元。在一個(gè)實(shí)施方案中，單鏈寡核苷酸的核苷酸堿基序列由交替的X和Y單元組成。在一個(gè)實(shí)施方案中，單鏈寡核苷酸包含交替的LNA和DNA單元(Xx)或(xX)。在一個(gè)實(shí)施方案中，單鏈寡核苷酸包含交替LNA后接2個(gè)DNA單元的基序(Χχχ)、xXx 或 xxXo在一個(gè)實(shí)施方案中，至少一個(gè)DNA或非LNA核苷酸類似物單元在選自上文提及的任何一個(gè)實(shí)施方案中鑒定為L(zhǎng)NA核苷酸單元的位置的位置中由LNA核苷酸堿基替換。在一個(gè)實(shí)施方案中，“X”指LNA單元。在一個(gè)實(shí)施方案中，單鏈寡核苷酸包含至少2個(gè)核苷酸類似物單元，例如至少3個(gè)核苷酸類似物單元，例如至少4個(gè)核苷酸類似物單元，例如至少5個(gè)核苷酸類似物單元，例如至少6個(gè)核苷酸類似物單元，例如至少7個(gè)核苷酸類似物單元，例如至少8個(gè)核苷酸類似物單元，例如至少9個(gè)核苷酸類似物單元,例如至少10個(gè)核苷酸類似物單元。在一個(gè)實(shí)施方案中，單鏈寡核苷酸包含至少2個(gè)LNA單元，例如至少3個(gè)LNA單元，
例如至少4個(gè)LNA單元，例如至少5個(gè)LNA單元，例如至少6個(gè)LNA單元，例如至少7個(gè)LNA單元，例如至少8個(gè)LNA單元，例如至少9個(gè)LNA單元，例如至少10個(gè)LNA單元。在一個(gè)實(shí)施方案中，其中至少一個(gè)核苷酸類似物例如LNA單元是胞嘧啶或鳥嘌呤，例如I 一 10個(gè)核苷酸類似物例如LNA單元是胞嘧啶或鳥嘌呤，例如2、3、4、5、6、7、8或
9個(gè)核苷酸類似物例如LNA單元是胞嘧啶或鳥嘌呤。在一個(gè)實(shí)施方案中，至少2個(gè)核苷酸類似物例如LNA單元是胞嘧啶或鳥嘌呤。在一個(gè)實(shí)施方案中，至少3個(gè)核苷酸類似物例如LNA單元是胞嘧啶或鳥嘌呤。在一個(gè)實(shí)施方案中，至少4個(gè)核苷酸類似物例如LNA單元是胞嘧啶或鳥嘌呤。在一個(gè)實(shí)施方案中，至少5個(gè)核苷酸類似物例如LNA單元是胞嘧啶或鳥嘌呤。在一個(gè)實(shí)施方案中，至少6個(gè)核苷酸類似物例如LNA單元是胞嘧啶或鳥嘌呤。在一個(gè)實(shí)施方案中，至少7個(gè)核苷酸類似物例如LNA單元是胞嘧啶或鳥嘌呤。在一個(gè)實(shí)施方案中，至少8個(gè)核苷酸類似物例如LNA單元是胞嘧啶或鳥嘌呤。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，核苷酸類似物與互補(bǔ)RNA核苷酸的熱雙鏈體穩(wěn)定性高于等同DNA核苷酸與所述互補(bǔ)RNA核苷酸的結(jié)合親和力。在一個(gè)實(shí)施方案中，核苷酸類似物對(duì)單鏈寡核苷酸賦予增強(qiáng)的血清穩(wěn)定性。在一個(gè)實(shí)施方案中，單鏈寡核苷酸與互補(bǔ)單鏈RNA分子形成A-螺旋構(gòu)象。2個(gè)RNA分子之間的雙鏈體一般以A型構(gòu)象存在，而2個(gè)DNA分子的雙鏈體一般以B型構(gòu)象存在。DNA和RNA分子之間的雙鏈體一般以中間體構(gòu)象(A/B型)存在。核苷酸類似物例如β-D-氧LNA的使用可以用于促進(jìn)更A型樣構(gòu)象。標(biāo)準(zhǔn)圓二色(CD)或NMR分析用于測(cè)定本發(fā)明的寡核苷酸和互補(bǔ)RNA分子之間的雙鏈體的形成。因?yàn)榻?jīng)由RISC復(fù)合物的募集被認(rèn)為依賴miRNA/mRNA靶的特定結(jié)構(gòu)構(gòu)象，所以在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸可以與互補(bǔ)RNA分子形成A/B型雙鏈體。然而，我們已測(cè)定促進(jìn)A型結(jié)構(gòu)的核苷酸類似物的使用也是有效的，例如LNA的a -L異構(gòu)體。在一個(gè)實(shí)施方案中，單鏈寡核苷酸與互補(bǔ)單鏈RNA分子形成A/B型構(gòu)象。在一個(gè)實(shí)施方案中，單鏈寡核苷酸與互補(bǔ)單鏈RNA分子形成A型構(gòu)象。在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的單鏈寡核苷酸不介導(dǎo)對(duì)互補(bǔ)單鏈RNA分子的基于RNA酶H的切割。一般地一段至少5個(gè)(一般在RNA酶H募集方面無(wú)效)、更優(yōu)選至少6個(gè)、更優(yōu)選至少7個(gè)或8個(gè)連續(xù)DNA核苷酸堿基(或可以募集RNA酶H的備選核苷酸堿基，例如a L-氨基LNA)是需要的，以使寡核苷酸在RNA酶H的募集中有效。
EP1222309提供了用于測(cè)定RNA酶H活性的體外方法，其可以用于測(cè)定募集RNA酶H的能力。如果當(dāng)與互補(bǔ)RNA靶一起提供時(shí)，使用由EP1222309的實(shí)施例91 一 95提供的方法，它具有如以pmol/1/分鐘測(cè)量的，至少I %、例如至少5 %、例如至少10%或小于20%的等同僅DNA寡核苷酸(不含2’取代，在寡核苷酸的所有核苷酸之間具有磷酸二酯連接基團(tuán))的起始速率，則認(rèn)為化合物能夠募集RNA酶H。如果當(dāng)與互補(bǔ)RNA靶和RNA酶H—起提供時(shí)，使用由EP1222309的實(shí)施例91 一 95提供的方法，如以pmol/1/分鐘測(cè)量的RNA酶H起始速率小于I %、例如小于5%、例如小于10%或小于20%的使用等同僅DNA寡核苷酸測(cè)定的起始速率，所述寡核苷酸不含2’取代，在寡核苷酸的所有核苷酸之間具有磷酸二酯連接基團(tuán)，則認(rèn)為化合物基本上不能募集RNA酶H，。在一個(gè)高度優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的單鏈寡核苷酸能夠與具有磷酸二酯核苷間鍵的互補(bǔ)單鏈RNA核酸分子(一般為所述單鏈寡核苷酸的約相同長(zhǎng)度)形成雙鏈體，其中雙鏈體具有至少約60°C的Tm，事實(shí)上優(yōu)選單鏈寡核苷酸能夠與具有磷酸二酯核苷間鍵的互 補(bǔ)單鏈RNA核酸分子形成雙鏈體，其中雙鏈體具有約70°C —約95°C的Tm，例如約70°C —約900C 的 Tm,例如約 70。。一約 850C 的 Tm0在一個(gè)實(shí)施方案中，單鏈寡核苷酸能夠與具有磷酸二酯核苷間鍵的互補(bǔ)單鏈DNA核酸分子形成雙鏈體，其中雙鏈體具有約50°C—約95°C的Tm，例如約50°C—約90°C，例如至少約55°C，例如至少約60°C，或不超過約95°C。在一個(gè)實(shí)施方案中，單鏈寡核苷酸可以具有14 — 16個(gè)核苷酸堿基,包括15個(gè)核苷酸堿基的長(zhǎng)度。在一個(gè)實(shí)施方案中，LNA單元獨(dú)立地選自以D-β和L-α構(gòu)型或其組合的氧-LNA、硫代-LNA和氨基-LNA。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，LNA單元可以是ENA分子。在一個(gè)實(shí)施方案中，LNA單元是β D氧-LNA。在一個(gè)實(shí)施方案中，LNA單元是a -L氨基LNA。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，單鏈寡核苷酸包含3 — 17個(gè)LNA單元。在一個(gè)實(shí)施方案中，單鏈寡核苷酸包含至少一個(gè)不同于磷酸酯的核苷間連接基團(tuán)。在一個(gè)實(shí)施方案中，單鏈寡核苷酸包含至少一個(gè)硫代磷酸酯核苷間鍵。在一個(gè)實(shí)施方案中，單鏈寡核苷酸包含磷酸二酯鍵和硫代磷酸酯鍵。在一個(gè)實(shí)施方案中，所有核苷間鍵都是硫代磷酸酯鍵。在一個(gè)實(shí)施方案中，單鏈寡核苷酸包含至少一個(gè)磷酸二酯核苷間鍵。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的單鏈寡核苷酸的所有核苷間鍵都是磷酸二酯鍵。在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物包含載體例如鹽水或緩沖鹽水。在一個(gè)實(shí)施方案中，用于合成靶向針對(duì)人微小RNA的單鏈寡核苷酸的方法以3’ 一5’方向a — f來(lái)進(jìn)行。用于合成根據(jù)本發(fā)明的單鏈寡核苷酸的方法可以使用標(biāo)準(zhǔn)固相寡核苷酸合成來(lái)進(jìn)行?？梢耘c上述實(shí)施方案組合的本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方案如權(quán)利要求中顯示且在標(biāo)題‘進(jìn)一步的實(shí)施方案’下。定義術(shù)語(yǔ)‘核苷酸堿基’指核苷酸，例如DNA和RNA，和核苷酸類似物。在本發(fā)明的背景中，術(shù)語(yǔ)“寡核苷酸”(或簡(jiǎn)單地“寡聚體”)指由2個(gè)或更多核苷酸堿基的共價(jià)鍵形成的分子。當(dāng)在本發(fā)明的寡核苷酸(也稱為單鏈寡核苷酸)的背景中使用時(shí)，在一個(gè)實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)“寡核苷酸”可以具有例如8 — 26個(gè)核苷酸堿基,例如10 — 26個(gè)核苷酸堿基，例如12 — 26個(gè)核苷酸堿基。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，如本文詳述的，本發(fā)明的寡核苷酸具有8 — 17個(gè)核苷酸堿基，例如20 - 27個(gè)核苷酸堿基例如8 — 16個(gè)核苷酸堿基，例如12 - 15個(gè)核苷酸堿基的長(zhǎng)度。在一個(gè)此類實(shí)施方案中，本發(fā)明的寡核苷酸可以具有8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25 或 26 個(gè)核苷酸堿基的長(zhǎng)度。 應(yīng)認(rèn)識(shí)到對(duì)于較短的寡核苷酸，可能必須增加(高親和力)核苷酸類似物例如LNA的部分。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，至少約30%的核苷酸堿基是核苷酸類似物，例如至少約33%、例如至少約40%、或至少約50%或至少約60%、例如至少約66%、例如至少約70%、例如至少約80%、或至少約90%。還將顯而易見的是寡核苷酸可以包含僅由核苷酸類似物序列組成的核苷酸堿基序列。在本文中，術(shù)語(yǔ)“含氮堿基”意欲涵蓋嘌呤和嘧啶，例如DNA核苷酸堿基A、C、T和G，RNA核苷酸堿基A、C、U和G，以及非DNA/RNA核苷酸堿基，例如5-甲基胞嘧啶(MeC)、異胞嘧啶、假異胞嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-丙炔尿嘧啶、5-丙炔-6-氟尿嘧啶、5-甲基噻唑尿嘧啶、6-氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、肌苷、2，6- 二氨基嘌呤、7-丙炔-7-去氮腺嘌呤、7-丙炔-7-去氮鳥嘌呤和2-氯-6-氨基嘌呤，特別是MeC。應(yīng)當(dāng)理解非DNA/RNA核苷酸堿基的實(shí)際選擇將依賴寡核苷酸意欲靶向的微小RNA鏈中存在的相應(yīng)(或匹配)核苷酸。例如，在相應(yīng)的核苷酸是G的情況下，通常必須選擇能夠與G建立氫鍵的非DNA/RNA核苷酸堿基。在這種具體情況下，當(dāng)相應(yīng)的核苷酸是G時(shí)，優(yōu)選的非DNA/RNA核苷酸堿基的一般例子是MeC。術(shù)語(yǔ)“核苷間連接基團(tuán)”意指能夠使2種核苷酸堿基共價(jià)偶聯(lián)在一起的基團(tuán)，例如在DNA單元之間，在DNA單元和核苷酸類似物之間，在2個(gè)非LNA單元之間，在非LNA單元和LNA單元之間，和在2個(gè)LNA單元之間等。優(yōu)選例子包括磷酸酯、磷酸二酯基團(tuán)和硫代磷酸酷基團(tuán)。核苷間鍵可以選自-0-P(O)2-O-, -O-P (0，S)-0_、-O-P (S) 2_0_、_S_P (O)2-0-、-S-P (0，S)-o-、-S-P (S)2-O-^-O-P (O) 2-S-、-0-P (0, S)-S-,-S-P (0)2-S-,-0-P0(Rh)-O-,O-PO (OCH3)-O-'-O-PO (NRh)-O-,-O-PO (OCH2CH2S-R)-O-'-0-P0 (BH3)-O-^-O-PO(NHRh) -0-,-O-P (O) 2-NRh-、-NRh-P (O) 2_0_、-NRh-CO-O-、-NRh-CO-NRh-，和 / 或核苷間鍵可以選自-O-CO-O-、-O-CO-NRh-、-NRh-CO-CH2-、-O-CH2-CO-NRh-, -O-CH2-CH2-NRh-,-CO-NRh-CH2-, -CH2-NRh-CO-, -O-CH2-CH2-S-, -S-CH2-CH2-O-, -S-CH2-CH2-S-, -CH2-SO2-CH2-, -CH2-CO-NRH-、-0-CH2-CH2-NRh-C0-、-CH2-NCH3-O-CH2-，其中 Rh 選自氫和 C^4-烷基。適當(dāng)?shù)?，在某些?shí)施方案中，如上文提供的含硫(S )核苷間鍵可以是優(yōu)選的。如在寡核苷酸的上下文中使用的，術(shù)語(yǔ)“對(duì)應(yīng)/相應(yīng)”指本發(fā)明的化合物的核苷酸堿基序列及其反向互補(bǔ)物之間的比較，或在一個(gè)實(shí)施方案中，在核苷酸堿基序列和等同(相同)核苷酸堿基序列之間，所述等同核苷酸堿基序列可以例如包含其他核苷酸堿基但包含相同的堿基序列或其互補(bǔ)物。核苷酸類似物與其等同或相應(yīng)的天然核苷酸直接比較。形成序列的反向互補(bǔ)物的序列稱為序列的互補(bǔ)序列。當(dāng)提及如本文提及的核苷酸分子的長(zhǎng)度時(shí)，該長(zhǎng)度對(duì)應(yīng)單體單元即核苷酸堿基的數(shù)目，與那些單體單元是核苷酸還是核苷酸類似物無(wú)關(guān)。就核苷酸堿基而言，術(shù)語(yǔ)單體和單元在本文中可互換使用。應(yīng)當(dāng)理解當(dāng)術(shù)語(yǔ)“約”在具體值或值范圍的背景中使用時(shí)，公開內(nèi)容應(yīng)包括提及的具體值或范圍。優(yōu)選的DNA類似物包括其中2’ -H基團(tuán)由除-OH (RNA)外的取代進(jìn)行取代的DNA類似物，例如通過用-0-CH3、-0-CH2-CH2-0-CH3、-O-CH2-CH2-CH2-NHy-O-CH2-CH2-CH2-OH 或-F取代。優(yōu)選的RNA類似物包括已在其2’ -OH基團(tuán)中進(jìn)行修飾的RNA類似物，例如通過用除-OH (RNA)外的基團(tuán)取代，例如-0-CH3、-0-CH2-CH2-0-CH3、-O-CH2-CH2-CH2-NH2、-O-CH2-CH2-CH2-0H 或-F。在一個(gè)實(shí)施方案中，核苷酸類似物是“ΕΝΑ”。當(dāng)在本文背景中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“LNA單元”、“LNA單體”、“LNA殘基”、“鎖定核酸單元”、“鎖定核酸單體”或“鎖定核酸殘基”指二環(huán)核苷類似物。LNA單元特別在WO 99/14226、WO 00/56746、W000/56748、WO 01/25248、WO 02/28875、WO 03/006475 和 WO 03/095467 中得到描述。LNA單元還可以就其化學(xué)式而言進(jìn)行定義。因此，如本文所使用的，“LNA單元”具有下文方案I中所示的化學(xué)結(jié)構(gòu)方案I
權(quán)利要求
1.ー種寡核苷酸，其長(zhǎng)度為8 — 17個(gè)核苷酸堿基單元，其中所述寡核苷酸包含從3’末端計(jì)數(shù)第2 — 7位或第3 — 8位的核心DNA序列3’ ctcaca 5’ (SEQ ID NO 7), 其中所述序列中的至少I個(gè)DNA單元已由其相應(yīng)的LNA單元置換； 所述寡核苷酸的核酸堿基序列與人miR122微小RNA序列互補(bǔ)，并且所述寡核苷酸不包含超過5個(gè)連續(xù)DNA核苷酸單元的區(qū)域，以及所述寡核苷酸包含至少ー個(gè)硫代磷酸酯核苷酸間鍵。
2.根據(jù)權(quán)利要求I的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸具有10— 16個(gè)核苷酸堿基的長(zhǎng)度。
3.根據(jù)權(quán)利要求I的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸具有12— 16個(gè)核苷酸堿基的長(zhǎng)度。
4.根據(jù)權(quán)利要求I一 3中任ー項(xiàng)的寡核苷酸，其中由3’末端計(jì)數(shù)，所述寡核苷酸的第I — 6位、第2 — 7位或第3 — 8位的至少2個(gè)DNA單元已由其相應(yīng)的LNA單元置換,并且其中所述LNA単元由至少ー個(gè)DNA単元分隔開。
5.根據(jù)權(quán)利要求I一 3中任ー項(xiàng)的寡核苷酸，其中由3’末端計(jì)數(shù)，所述寡核苷酸的第I — 6位、第2 — 7位或第3 — 8位的至少3個(gè)DNA單元已由其相應(yīng)的LNA單元置換,并且其中所述LNA単元由至少ー個(gè)DNA単元分隔開。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5的寡核苷酸，其中由3’末端計(jì)數(shù)，所述寡核苷酸的第I一 6位、第2 — 7位或第3 — 8位中的連續(xù)DNA單元數(shù)目為至多2個(gè)。
7.根據(jù)權(quán)利要求I一 6中任ー項(xiàng)的寡核苷酸，其中由3’末端計(jì)數(shù)，所述寡核苷酸的第I 一 6位、第2 — 7位或第3 — 8位中的LNA單元總數(shù)目是2 — 6個(gè)LNA單元。
8.根據(jù)權(quán)利要求I一 7中任ー項(xiàng)的寡核苷酸，其中由3’末端計(jì)數(shù)，所述寡核苷酸的第I個(gè)核苷酸堿基是核苷酸類似物，例如LNA単元。
9.根據(jù)權(quán)利要求I一 8中任ー項(xiàng)的寡核苷酸，其中由3’末端計(jì)數(shù)，所述寡核苷酸的第2個(gè)核苷酸堿基是核苷酸類似物，例如LNA単元。
10.根據(jù)權(quán)利要求I一 9中任ー項(xiàng)的寡核苷酸，其中，若存在的話，由3’末端計(jì)數(shù)，所述寡核苷酸的第9個(gè)和/或第10個(gè)核苷酸是核苷酸類似物例如LNA単元。
11.根據(jù)權(quán)利要求I一 10中任ー項(xiàng)的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含至少ー個(gè)由至少2個(gè)連續(xù)LNA單元組成的區(qū)域。
12.根據(jù)權(quán)利要求I一 11中任ー項(xiàng)的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸不包含超過7個(gè)連續(xù)LNA單元的區(qū)域。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸不包含超過3個(gè)連續(xù)LNA単元的區(qū)域。
14.根據(jù)權(quán)利要求I一 13中任ー項(xiàng)的寡核苷酸,其中所述寡核苷酸在與所述miRNA種區(qū)域互補(bǔ)的位置中包含至少2個(gè)LNA單元。
15.根據(jù)權(quán)利要求I一 14中任ー項(xiàng)的寡核苷酸,其中所述寡核苷酸在與所述miRNA種區(qū)域互補(bǔ)的位置中包含至少3個(gè)LNA單元。
16.根據(jù)權(quán)利要求I一 15中任ー項(xiàng)的寡核苷酸,其中所述單鏈寡核苷酸在與所述miRNA種區(qū)域互補(bǔ)的位置中包含至少4個(gè)LNA單元。
17.根據(jù)權(quán)利要求I一 16中任ー項(xiàng)的寡核苷酸,其中所述寡核苷酸的3個(gè)最5’末端的核苷酸堿基的核苷酸堿基基序選自Χχχ、χΧχ> xxX、XXx> XxX> χΧΧ和XXX，其中“X”指LNA單元，和“X”指DNA核苷酸單元。
18.根據(jù)權(quán)利要求I一 17中任ー項(xiàng)的寡核苷酸,其中所述寡核苷酸在5’末端包含核苷酸類似物單元例如LNA單元。
19.根據(jù)權(quán)利要求I一 18中任ー項(xiàng)的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含所述至少ー個(gè)LNA類似物單元和至少ー個(gè)非LNA的其它核苷酸類似物單元。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的寡核苷酸，其中非LNA的核苷酸類似物單元獨(dú)立地選自2’ -OMe-RNA單元和2’ -氟-DNA單元。
21.根據(jù)權(quán)利要求I一 20中任ー項(xiàng)的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸不介導(dǎo)對(duì)互補(bǔ)單鏈RNA分子的基于RNA酶H的切割。
22.根據(jù)權(quán)利要求I一 21中任ー項(xiàng)的寡核苷酸,其中所述寡核苷酸能夠與具有磷酸ニ酯核苷酸間鍵的互補(bǔ)單鏈RNA核酸分子形成雙鏈體，并且該雙鏈體具有至少約60°C的Tm值。
23.根據(jù)權(quán)利要求22的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸能夠與具有磷酸ニ酯核苷酸間鍵的互補(bǔ)單鏈RNA核酸分子形成雙鏈體，并且該雙鏈體具有約70 — 950C的Tm值。
24.根據(jù)權(quán)利要求22的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸能夠與具有磷酸ニ酯核苷酸間鍵的互補(bǔ)單鏈RNA核酸分子形成雙鏈體，并且該雙鏈體具有約70 — 850C的Tm值。
25.根據(jù)權(quán)利要求I一 24中任ー項(xiàng)的寡核苷酸,其中所述寡核苷酸具有15或16個(gè)核苷酸堿基的長(zhǎng)度。
26.根據(jù)權(quán)利要求I一 25中任ー項(xiàng)的寡核苷酸，其中所述LNA單元獨(dú)立地選自處于D- β和L- α構(gòu)型中任一種或其組合的氧_LNA、硫代-LNA和気基-LNA。
27.根據(jù)權(quán)利要求I一 25中任ー項(xiàng)的寡核苷酸，其中所述LNA單元是β -D-氧基-LNA。
28.根據(jù)權(quán)利要求I一 27中任ー項(xiàng)的寡核苷酸，其中所有核苷酸間鍵都是硫代磷酸酯鍵。
29.如權(quán)利要求I一 27中任ー項(xiàng)的寡核苷酸,其中所述單鏈寡核苷酸包含至少ー個(gè)硫代磷酸酯鍵，并且其中至少第I個(gè)5’和/或最后I個(gè)3’核苷酸堿基是LNA核苷酸堿基。
30.如權(quán)利要求I一 29中任ー項(xiàng)的寡核苷酸,其中所述寡核苷酸具有選自下述的序列SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18 和 SEQ IDNO: 19，其中小寫字母代表DNA単元的氮堿基，大寫字母代表LNA単元的氮堿基，并且其中所述LNA胞嘧啶核苷任選地是甲基化的。
31.根據(jù)權(quán)利要求I的寡核苷酸，其具有下式5’ -CcAttGTcaCaCtCC-3’ (SEQ ID NO 99), 其中小寫字母代表DNA単元的氮堿基，大寫字母代表LNA単元的氮堿基，并且其中所述LNA胞嘧啶任選地是甲基化的。
32.根據(jù)權(quán)利要求31的寡核苷酸，其中所有核苷酸間鍵都是硫代磷酸酯鍵。
33.根據(jù)權(quán)利要求31或32的寡核苷酸，其中所述LNA胞嘧啶是5—甲基胞嘧啶。
34.根據(jù)權(quán)利要求31— 33中任ー項(xiàng)的寡核苷酸，其中所述LNA單元是β-D-氧基LNA單元。
35.根據(jù)權(quán)利要求31的寡核苷酸，其具有下式 _mp Op A 0十十 Γ 0T 0P n mC 0Q mC 0十 mP 0V0-i^ 1 °し S uSrtS LSLSUS 1S し SclS し S ciS しS し S しS 0 其中小寫字母代表DNA単元，大寫字母代表LNA単元，mC表示5 —甲基胞嘧啶LNA，下標(biāo)s表示硫代磷酸酯核苷酸間鍵，并且其中所述LNA單元是β -D-氧基LNA単元，在LNA殘基之后以上標(biāo)O表不。
36.包含權(quán)利要求I一 35中任一項(xiàng)的寡核苷酸和與其連接的至少ー個(gè)非核苷酸堿基實(shí)體的綴合物。
37.權(quán)利要求36的綴合物，其中所述非核苷酸堿基的實(shí)體包含固醇如膽固醇，或者由其組成。
38.藥物組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求I一 35中任一項(xiàng)的寡核苷酸或者權(quán)利要求36或37的綴合物，和藥學(xué)上可接受的稀釋劑、載體或輔劑。
39.具有8— 17個(gè)核苷酸堿基的寡核苷酸在制備用于治療與所述微小RNA的存在或過量表達(dá)相關(guān)的疾病或醫(yī)學(xué)病癥的藥物中的用途，其中所述寡核苷酸與人miR-122序列(SEQID NO I)互補(bǔ)，所述疾病例如選自下述中提高的血漿膽固醇水平、動(dòng)脈粥樣硬化、高膽固醇血癥、高脂血癥以及丙型肝炎，其中所述寡核苷酸是權(quán)利要求I 一 35中任ー項(xiàng)所定義的，或者是權(quán)利要求36或37的綴合物。
40.權(quán)利要求39的用途，其中所述疾病是丙型肝炎。
41.權(quán)利要求39的用途，其中所述寡核苷酸是如權(quán)利要求35所定義的。
42.用于合成根據(jù)權(quán)利要求I一 35中任一項(xiàng)的單鏈寡核苷酸的方法,所述方法包括下述步驟 a.選擇由3’末端計(jì)數(shù)的第I個(gè)核苷酸堿基，其為L(zhǎng)NA核苷酸堿基， b.選擇與所述miR122種區(qū)域互補(bǔ)的所述單鏈寡核苷酸區(qū)域，其中所述寡核苷酸中對(duì)應(yīng)于所述miR-122種區(qū)域的區(qū)域內(nèi)的至少ー個(gè)DNA單元已被相應(yīng)的LNA單元所取代， c.選擇根據(jù)權(quán)利要求16的所述單鏈寡核苷酸的5’區(qū)域， 其中所述合成通過步驟a — c中定義的區(qū)域的順次合成來(lái)進(jìn)行，其中所述合成可以以3’ 一 5’(a至c)或5’ 一 3’(c至a)方向來(lái)進(jìn)行，和其中所述寡核苷酸的核苷酸堿基序列與人miR122微小RNA序列互補(bǔ)，并且其中所述寡核苷酸不包含多于5個(gè)連續(xù)DNA核苷酸單元的區(qū)域，并且其中所述寡核苷酸包含至少ー個(gè)硫代磷酸酯核苷酸間鍵。
43.用于體外降低細(xì)胞內(nèi)miR-122靶的有效量的方法，其中包括對(duì)所述細(xì)胞施用具有8 — 17個(gè)核苷酸堿基的寡核苷酸,并且其中所述寡核苷酸是權(quán)利要求I 一 35中任ー項(xiàng)所定義的，或者是權(quán)利要求36或37的綴合物。
44.權(quán)利要求43的方法，其中所述寡核苷酸是如權(quán)利要求35所定義的寡核苷酸。
全文摘要
本發(fā)明提供了包含長(zhǎng)度為8－26個(gè)核苷酸堿基的短單鏈寡核苷酸的單鏈寡核苷酸或其綴合物，所述短單鏈寡核苷酸與選自miR19b、miR21、miR122a、miR155和miR375的人微小RNA互補(bǔ)。所述短寡核苷酸在體內(nèi)在減輕miRNA阻遏中特別有效。發(fā)現(xiàn)將高親和力核苷酸類似物摻入寡核苷酸內(nèi)導(dǎo)致產(chǎn)生高度有效的抗微小RNA分子，其表現(xiàn)出經(jīng)由與微小RNA靶形成幾乎不可逆的雙鏈體來(lái)起作用，而不是基于RNA切割的機(jī)制，例如與RNA酶H或RISC相關(guān)的機(jī)制。
文檔編號(hào)A61K47/48GK102851291SQ20121024759
公開日2013年1月2日 申請(qǐng)日期2007年3月30日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月3日
發(fā)明者J·埃爾門, P·卡尼, S·考皮寧 申請(qǐng)人:桑塔里斯制藥公司