專利名稱：藥物誘導(dǎo)的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于疫苗領(lǐng)域，具體涉及一種藥物誘導(dǎo)的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)疫苗及其制備方法。
背景技術(shù)：
腫瘤生物治療發(fā)展迅速，目前已有一些腫瘤疫苗上市，大量疫苗也進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)階段，腫瘤疫苗包括腫瘤細(xì)胞疫苗，腫瘤相關(guān)抗原疫苗，核酸疫苗及相關(guān)活性免疫細(xì)胞疫苗
坐寸ο
而腫瘤細(xì)胞本身成分復(fù)雜，不同種類的腫瘤又存在一定差異，要想選定某特定的抗原肽作為研究靶點(diǎn)又存在一定困難，且腫瘤殺傷主要是通過MHC I類分子提呈誘導(dǎo)Thl型免疫反應(yīng)起作用，本發(fā)明所涉及的短壽蛋白及缺損的核糖體產(chǎn)物屬于MHC I類抗原，且抗原類別根據(jù)腫瘤類別具有特異性。蛋白酶體抑制劑本身以可抗多發(fā)性骨髓瘤應(yīng)用于臨床，蛋白酶體抑制劑聯(lián)合氯化銨可以抑制溶酶體功能，阻斷腫瘤細(xì)胞SLiPs、DRiPs的降解，促使其進(jìn)入自噬途徑，達(dá)到募集短壽蛋白的目的；在此基礎(chǔ)上摹集自噬小體結(jié)構(gòu)。以自噬小體為抗原制備疫苗，小體疫苗的雙層膜結(jié)構(gòu)易于被DC等抗原遞呈細(xì)胞識別且攜帶的蛋白抗原易于激發(fā)體內(nèi)Thl型免疫反應(yīng)，活化的⑶4+、⑶8+ T淋巴細(xì)胞及分泌的細(xì)胞因子可有效殺傷腫瘤細(xì)胞。淋巴結(jié)給藥在臨床上以B超定位技術(shù)將抗原注射進(jìn)入腫瘤病人兩側(cè)腹股溝淋巴結(jié)，大大減少抗原用量，縮短免疫遞呈途徑，快速有效活化免疫系統(tǒng)，使得機(jī)體用藥后相對迅速產(chǎn)生免疫應(yīng)答,殺傷體內(nèi)腫瘤細(xì)胞。

發(fā)明內(nèi)容
解決的技術(shù)問題本發(fā)明的目的在于提供一種可以用于臨床的攜帶多種抗原的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)疫苗。技術(shù)方案藥物誘導(dǎo)的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)疫苗，在腫瘤原代細(xì)胞分裂過程中以蛋白酶體抑制劑誘導(dǎo)，腫瘤細(xì)胞內(nèi)部產(chǎn)生的一些易降解蛋白進(jìn)入自噬途徑，產(chǎn)生的自噬小體不被溶酶體降解，最終形成直徑為200-900nm的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，即為小體疫苗。藥物作用的主體是存活的原代腫瘤細(xì)胞。其抗原主體為短壽蛋白以及缺損的核糖體產(chǎn)物。其抗原主體為短壽蛋白以及缺損的核糖體產(chǎn)物由雙層膜結(jié)構(gòu)包裹形成粒徑約為200-900nm自噬小體的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)。誘導(dǎo)形成亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的藥物為蛋白酶體抑制劑及氯化銨。給藥途經(jīng)為淋巴結(jié)給藥。既可以單獨(dú)使用也可與藥物載體組成藥物組合物，或與其他藥物活性成分制成藥物組合物，或與其他免疫活性細(xì)胞組合使用。藥物誘導(dǎo)的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)疫苗的制備方法，包括步驟(I)原代腫瘤細(xì)胞經(jīng)酶法及機(jī)械研磨法制備單細(xì)胞體外培養(yǎng)；(2)培養(yǎng)至一定飽和度加入一定濃度蛋白酶體抑制劑及氯化銨孵育24-48小時，誘導(dǎo)自噬小體形成；(3)低速離心去除殘余完整的腫瘤細(xì)胞及其他雜質(zhì)，保留上清；(4)高速離心收集上清中自噬小體結(jié)構(gòu)；(5)由亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)包裹的抗原蛋白易于被抗原遞呈細(xì)胞識別及提呈，最終誘發(fā)機(jī)體強(qiáng)烈的細(xì)胞免疫。該方法適用于各種對蛋白酶體抑制劑具有藥物敏感性的腫瘤細(xì)胞類型制備相應(yīng)的抗腫瘤小體疫苗。一種藥物誘導(dǎo)的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)疫苗，在腫瘤原代細(xì)胞分裂過程中以蛋白酶體抑制劑誘導(dǎo)，腫瘤細(xì)胞內(nèi)部產(chǎn)生的一些易降解蛋白進(jìn)入自噬途徑，產(chǎn)生的自噬小體不被溶酶體降解，最終形成直徑為200-900nm的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，即為小體疫苗。藥物作用的主體是存活的原代腫瘤細(xì)胞。其抗原主體為短壽蛋白(short-lived proteins, SLiPs)以及缺損的核糖體產(chǎn)物(defective ribosomal products, DRiPs)。其抗原主體為短壽蛋白(short-livedproteins, SLiPs)以及缺損的核糖體產(chǎn)物(defective ribosomal products, DRiPs)由雙層膜結(jié)構(gòu)包裹形成粒徑約為200-900nm自卩遼小體(aotophagesome)的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)。誘導(dǎo)形成亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的藥物為蛋白酶體抑制劑及氯化銨。給藥途經(jīng)為淋巴結(jié)給藥，淋巴結(jié)給藥可以大大減少抗原用量，縮短抗原在體內(nèi)傳遞過程，比常規(guī)給藥方式更易活化免疫系統(tǒng)。既可以單獨(dú)使用也可與藥物載體組成藥物組合物，或其他藥物活性成分制成藥物組合物，或與其他免疫活性細(xì)胞組合使用。
藥物誘導(dǎo)的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)疫苗的制備方法，包括步驟(I)原代腫瘤細(xì)胞經(jīng)酶法及機(jī)械研磨法制備單細(xì)胞體外培養(yǎng)，(2)培養(yǎng)至一定飽和度加入一定濃度蛋白酶體抑制劑及氯化銨孵育24-48小時，誘導(dǎo)自噬小體形成。(3)低速離心去除殘余完整的腫瘤細(xì)胞及其他雜質(zhì)，保留上清。(4)高速離心收集上清中自噬小體結(jié)構(gòu)。(5)由亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)包裹的抗原蛋白易于被抗原遞呈細(xì)胞識別及提呈，最終誘發(fā)機(jī)體強(qiáng)烈的細(xì)胞免疫。該方法適用于各種對蛋白酶體抑制劑具有藥物敏感性的腫瘤細(xì)胞類型制備相應(yīng)的抗腫瘤小體疫苗。有益效果提供一種可以用于臨床的攜帶多種抗原的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)疫苗及其制備方法，本發(fā)明的抗腫瘤的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)疫苗是基于以蛋白酶體抑制劑及氯化銨誘導(dǎo)腫瘤原代細(xì)胞內(nèi)短壽蛋白和缺損的核糖體產(chǎn)物作為抗原蛋白通過自噬途徑進(jìn)入雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬小體中，這樣包裹抗原的自噬小體即為本發(fā)明的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)疫苗。該疫苗經(jīng)淋巴結(jié)給藥可以有效誘發(fā)機(jī)體免疫系統(tǒng)的交叉遞呈，激活CD4+、CD8+ T淋巴細(xì)胞及CTL細(xì)胞，殺傷腫瘤細(xì)胞。


圖I是本發(fā)明中方法制備的肝癌細(xì)胞亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)疫苗電鏡效果 圖2是臨床B超定位病人淋巴結(jié)給藥過程 圖3是病人給藥前后外周血IFNy濃度，a.免疫前，b.免疫后一周；
圖4是原發(fā)性肝癌病人肺轉(zhuǎn)移后使用小體疫苗治療前后腫瘤病灶部位CT。a.治療前，
b.治療后3個月。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例I :
在本發(fā)明中提供了新型亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)疫苗的制備方法，包括(1)腫瘤病人原代細(xì)胞分離、體外培養(yǎng)，(2)蛋白酶體抑制劑及氯化銨誘導(dǎo)形成攜帶短壽蛋白的自噬小體形成，(3)梯度離心法分離自噬小體，(4)蛋白定量。這種疫苗強(qiáng)化抗原免疫原性原理為蛋白酶體抑制劑及氯化銨為誘導(dǎo)藥物，可以抑制溶酶體中蛋白酶對SLiPs、DRiPs的降解，而SLiPs、DRiPs作為MHC I類抗原可以有效誘導(dǎo)CD8+T淋巴細(xì)胞活化。分泌激活型細(xì)胞因子，如IL-l、IL-2、IFNa ,IFNy ,TNFa、TNF3
坐寸ο本發(fā)明第二方面，提供了一種抗腫瘤的細(xì)胞亞結(jié)構(gòu)疫苗，其含多種有已知及未知抗原及表位，這些已知及未知的抗原主要由蛋白酶體抑制劑及氯化銨誘導(dǎo)制備。本發(fā)明第三方面，提供了制備亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)疫苗，S卩小體疫苗制備方法的適用范圍，如上所述，該疫苗可適用于所有對蛋白酶體抑制劑及氯化銨敏感的可在胞內(nèi)促進(jìn)SLiPs、DRiPs進(jìn)入自噬小體形成的腫瘤細(xì)胞類型。 本發(fā)明第四上面，提供了上述小體疫苗用途，在臨床上，該疫苗可適用于實(shí)體瘤腫瘤患者術(shù)后有效輔助治療。本發(fā)明中，提供了上述小體疫苗的給藥途徑，即B超定位的病人兩側(cè)腹股溝淋巴
結(jié)給藥。本發(fā)明中提供了小體疫苗具體制備方法將實(shí)體瘤腫瘤病人術(shù)后分離的腫瘤組織在30min內(nèi)在無菌環(huán)境進(jìn)行單細(xì)胞分離處理，并以10%胎牛血清1640培養(yǎng)基二氧化碳環(huán)境培養(yǎng)，單細(xì)胞分離時先將實(shí)體瘤用剪刀簡單分離成小塊，按照每2g組織加入2mg/mL膠原酶II 37°C消化30min，取出消化后的單細(xì)胞懸液，經(jīng)200目濾網(wǎng)過濾，取出其它纖維組織及脂肪組織，得到較純凈的腫瘤原代單細(xì)胞，生理鹽水洗滌后以1640完全培養(yǎng)基37°C, CO2培養(yǎng)。培養(yǎng)24小時后，收集細(xì)胞，將原培養(yǎng)液更換為含有Immol蛋白酶體抑制劑及Immol氯化銨的培養(yǎng)液，再放入細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育過夜。電鏡觀察自噬小體形成情況，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞此時會有200-900nm小泡狀結(jié)構(gòu)分泌至胞外，即為自噬小體。此時，收集培養(yǎng)液上清，先經(jīng)1000rpm/5min離心，完整細(xì)胞等將形成沉淀，小體將保留于上清中。再將上清12000rpm/30min離心，此時，粒徑較小的自噬小體將出現(xiàn)在沉淀中。收集沉淀，生理鹽水洗滌3次后以約500ul生理鹽水重懸，此時即得到小體疫苗注射液。為了充分滅活腫瘤原代細(xì)胞，小體疫苗制備完成后將經(jīng)放射科Y射線處理lh。病人術(shù)后一個月即可使用上述小體疫苗，給藥劑量為每側(cè)IOOug/次，給藥間隔時間為一個月。
權(quán)利要求
1.藥物誘導(dǎo)的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)疫苗，其特征在于在腫瘤原代細(xì)胞分裂過程中以蛋白酶體抑制劑誘導(dǎo)，腫瘤細(xì)胞內(nèi)部產(chǎn)生的一些易降解蛋白進(jìn)入自噬途徑，產(chǎn)生的自噬小體不被溶酶體降解，最終形成直徑為200-900nm的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，即為小體疫苗。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的藥物誘導(dǎo)的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)疫苗，其特征在于藥物作用的主體是存活的原代腫瘤細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的藥物誘導(dǎo)的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)疫苗，其特征在于其抗原主體為短壽蛋白以及缺損的核糖體廣物。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的藥物誘導(dǎo)的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)疫苗，其特征在于其抗原主體為短壽蛋白以及缺損的核糖體產(chǎn)物由雙層膜結(jié)構(gòu)包裹形成粒徑約為200-900nm自曬小體的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的藥物誘導(dǎo)的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)疫苗，其特征在于誘導(dǎo)形成亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的藥物為蛋白酶體抑制劑及氯化銨。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的藥物誘導(dǎo)的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)疫苗，其特征在于給藥途經(jīng)為淋巴結(jié)給藥。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的藥物誘導(dǎo)的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)疫苗，其特征在于既可以單獨(dú)使用也可與藥物載體組成藥物組合物，或與其他藥物活性成分制成藥物組合物，或與其他免疫活性細(xì)胞組合使用。
8.權(quán)利要求I所述的藥物誘導(dǎo)的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)疫苗的制備方法，其特征在于包括步驟(O原代腫瘤細(xì)胞經(jīng)酶法及機(jī)械研磨法制備單細(xì)胞體外培養(yǎng)；(2)培養(yǎng)至一定飽和度加入一定濃度蛋白酶體抑制劑及氯化銨孵育24-48小時，誘導(dǎo)自噬小體形成；(3)低速離心去除殘余完整的腫瘤細(xì)胞及其他雜質(zhì)，保留上清；(4)高速離心收集上清中自噬小體結(jié)構(gòu)；(5)由亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)包裹的抗原蛋白易于被抗原遞呈細(xì)胞識別及提呈，最終誘發(fā)機(jī)體強(qiáng)烈的細(xì)胞免疫。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的藥物誘導(dǎo)的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)疫苗的制備方法，其特征在于該方法適用于各種對蛋白酶體抑制劑具有藥物敏感性的腫瘤細(xì)胞類型制備相應(yīng)的抗腫瘤小體疫苗。
全文摘要
藥物誘導(dǎo)的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)疫苗及其制備方法，在腫瘤原代細(xì)胞分裂過程中以蛋白酶體抑制劑誘導(dǎo)，腫瘤細(xì)胞內(nèi)部產(chǎn)生的一些易降解蛋白進(jìn)入自噬途徑，產(chǎn)生的自噬小體不被溶酶體降解，最終形成直徑為200-900nm的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，即為小體疫苗。本發(fā)明的抗腫瘤的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)疫苗是基于以蛋白酶體抑制劑及氯化銨誘導(dǎo)腫瘤原代細(xì)胞內(nèi)短壽蛋白和缺損的核糖體產(chǎn)物作為抗原蛋白通過自噬途徑進(jìn)入雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬小體中，這樣包裹抗原的自噬小體即為本發(fā)明的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)疫苗。該疫苗經(jīng)淋巴結(jié)給藥可以有效誘發(fā)機(jī)體免疫系統(tǒng)的交叉遞呈，激活CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞及CTL細(xì)胞，殺傷腫瘤細(xì)胞。
文檔編號A61K39/00GK102813915SQ20121025700
公開日2012年12月12日 申請日期2012年7月24日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月24日
發(fā)明者周鎮(zhèn)先, 邢蕓, 魏強(qiáng), 曾勇, 蘇舒, 方媛 申請人:東南大學(xué)