專利名稱：一種治療視網(wǎng)膜新生血管性疾病的藥物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于眼底疾病的生物防治技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種治療視網(wǎng)膜新生血管性疾病的藥物，即甲磺酸萘莫司他(Nafamostat mesylate, FUT-175)的新的用途，以及以甲磺酸萘莫司他為主要原料制備的，用于治療視網(wǎng)膜新生血管性疾病的藥物。
背景技術(shù)：
視網(wǎng)膜新生血管性疾病是我國乃至世界范圍最嚴(yán)重致盲性眼病之一，主要是指由于新生血管生長伴隨出血、滲出、增生等病理性改變造成的致盲性玻璃體視網(wǎng)膜疾病。包括糖尿病性視網(wǎng)膜病變、視網(wǎng)膜血管阻塞性疾病、視網(wǎng)膜靜脈周圍炎、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變等，對我國人群視力健康的威脅日益凸顯。一直以來，關(guān)于視網(wǎng)膜新生血管發(fā)生的機(jī)制眾說紛紜，例如血管活性因子及內(nèi)源性血管生成抑制劑在視網(wǎng)膜新生血管(retinalneovascularization, RNV)中的作用，它們在眼內(nèi)不是單一、獨(dú)立地起作用，而是多種因子相互協(xié)調(diào)，共同調(diào)控血管生成。此外，免疫學(xué)途徑近年來逐漸引起科學(xué)家重視。其中，炎癥及補(bǔ)體途徑的參與已在部分視網(wǎng)膜新生血管性疾病中得到證實(shí)，但至于具體過程及涉及的補(bǔ)體成分均尚無定論。為此，開展視網(wǎng)膜新生血管性疾病相關(guān)免疫學(xué)機(jī)理的研究，以期尋找可以更早、更有效阻斷RNV進(jìn)程的作用靶點(diǎn)，具有重要的臨床意義。甲橫酸萘莫司他(Nafamostat mesylate, FUT-175)是由日本Torii公司原研，1986年上市的合成蛋白酶抑制劑，此藥物主要用于急性胰腺炎、慢性胰腺炎急性惡化，胰管造影后的急性胰腺炎、外傷性胰腺炎、手術(shù)后急性胰腺炎等癥狀的改善。但申請人在長期的研究中發(fā)現(xiàn)，甲磺酸萘莫司他可以有效的抑制視網(wǎng)膜新生血管的生長，從而促成了本發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種治療視網(wǎng)膜新生血管性疾病的藥物，即可以更早、更有效阻斷RNV生長的作用靶點(diǎn)，為視網(wǎng)膜新生血管性疾病的臨床治療提供新的思路，以彌補(bǔ)現(xiàn)有治療方式的不足。本發(fā)明一個(gè)方面涉及甲磺酸萘莫司他的新用途，即甲磺酸萘莫司他在制備治療視網(wǎng)膜新生血管性疾病的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明另一方面提供一種治療視網(wǎng)膜新生血管性疾病的藥物，包括有甲磺酸萘莫司他和補(bǔ)體系統(tǒng)內(nèi)毒素分子C3a和/或C5a的抗體。上述的藥品中，甲磺酸萘莫司的含量約為I 3%，而抗體的添加量為0.002
0.005%。本發(fā)明的藥劑中還添加0. 5 I. 5%苯乙醇作為防腐劑。本發(fā)明使用甲磺酸萘莫司他，作用于補(bǔ)體途徑，來制備治療視網(wǎng)膜新生血管性疾病的藥物，同時(shí)添加有C3a和C5a多肽的抗體，產(chǎn)生中和作用，更加有效的控制視網(wǎng)膜新生血管的生長，此合成劑將成為視網(wǎng)膜新生血管治療的新型藥物，為臨床多種視網(wǎng)膜新生血管性疾病的治療提供新思路。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的描述。一、甲磺酸萘莫司他治療視網(wǎng)膜新生血管性疾病的新用途甲磺酸萘莫司他藥物購買于Sigma-Aldrich公司，小鼠腹腔注射用量為50mg/kg,利用C57BL/6J小鼠(購于Jackson Laboratory)建立氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變模型0IR，將7日(P7 )齡清潔級小鼠置于體積分?jǐn)?shù)為75%的高氧環(huán)境中飼養(yǎng)5d后回到空氣中繼續(xù)飼養(yǎng)，自12天(P12)開始，每天小鼠腹腔注射甲磺酸萘莫司他藥物，在視網(wǎng)膜新生血管生長最為旺盛的17 天(P17),通過頸靜脈灌 5 ii lFITC-conjugated isolectin_B4 (20mg/ml)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后取材，隨后進(jìn)行視網(wǎng)膜鋪片，觀察視網(wǎng)膜新生血管生長情況。通過熒光顯微鏡觀察表明，甲磺酸萘莫司他能夠明顯抑制RNV的生長，實(shí)驗(yàn)小鼠眼底血管生長趨于正常。然而,利用補(bǔ)體系統(tǒng)內(nèi)毒素分子C3a和C5a的受體C3aR和C5aR敲除鼠(CSaRvIEICSaR+小鼠)進(jìn)行同樣處理，注射甲磺酸萘莫司他后視網(wǎng)膜新生血管的生長變化并不明 顯。此外，通過視網(wǎng)膜鋪片，熒光造影觀察，血管內(nèi)皮核數(shù)的統(tǒng)計(jì)，比較C57BL/6J小鼠及C3aRv^和CSaR+小鼠，具體操作如下(I)視網(wǎng)膜鋪片利用C57BL/6J小鼠及CSaR+和CSaR+小鼠建立氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變模型0IR，具體方法同上所述。根據(jù)熒光顯微鏡觀察結(jié)果，C3a及C5aR的敲除抑制了 RNV的生長。根據(jù)RNV的評分標(biāo)準(zhǔn)，敲除鼠的RNV生長、血管簇的形成、血管迂曲程度較C57BL/6J小鼠明顯降低，而其中央無灌注區(qū)顯著大于正常組小鼠。(2)熒光造影術(shù)熒光素眼底血管制影是20世紀(jì)60年代興起的眼科檢查手藝。利用熒光素鈉做為制影劑疇前臂靜脈快速注入，當(dāng)熒光素鈉隨血流進(jìn)入眼底血管時(shí)，通過拆無一組濾色片的眼底攝影機(jī)，持續(xù)拍攝眼底血管外染料輪回時(shí)接收激發(fā)光線發(fā)射出的熒光形態(tài)，以察看視網(wǎng)膜動態(tài)輪回的過程，從而得以體會眼底血管的微細(xì)結(jié)構(gòu)和微輪回的變化，為良多眼底病的發(fā)病機(jī)理、診斷、醫(yī)亂和預(yù)后評估供給按照。利用此手段，對小鼠腹腔灌注0. Imll0%熒光素鈉，隨后用眼底造影機(jī)進(jìn)行實(shí)時(shí)觀察，并進(jìn)行記錄。結(jié)果說明CSaR+和CSaR+小鼠的中央無灌注區(qū)明顯大于C57BL/6J小鼠。(3)血管內(nèi)皮核數(shù)計(jì)數(shù)建立OIR模型，分別取C57BL/6J小鼠及C3aR和C5aR敲除鼠眼睛，并進(jìn)行病理組織學(xué)分析，方法如下 固定(10%福爾馬林，Bouin氏固定液等)使組織、細(xì)胞的蛋白質(zhì)變性凝固，以防止細(xì)胞死后的自溶或細(xì)菌的分解，從而保持細(xì)胞本來的形態(tài)結(jié)構(gòu)。隨后進(jìn)行 脫水透明一般用由低濃度到高濃度酒精作脫水劑，逐漸脫去組織塊中的水份。再將組織塊置于既溶于酒精，又溶于石蠟的透明劑二甲苯中透明，以二甲苯替換出組織塊的中酒精，才能浸蠟包埋。 浸蠟包埋將已透明的組織塊置于已溶化的石蠟中，放入溶蠟箱保溫。待石蠟完全浸入組織塊后進(jìn)行包埋先制備好容器(如折疊一小紙盒)，倒入已溶化的石蠟，迅速夾取已浸透石蠟的組織塊放入其中。冷卻凝固成塊即成。包埋好的組織塊變硬，才能在切片機(jī)上切成很薄的切片。 切片與貼片將包埋好的蠟塊固定于切片機(jī)上，切成薄片，一般為4微米厚。切下的薄片往往皺折，要放到加熱的水中燙平，再貼到載玻片上，放45°C恒溫箱中烘干。
脫蠟染色(HE染色)染色前，須用二甲苯脫去切片中的石蠟，再經(jīng)由高濃度到低濃度酒精，最后入蒸餾水，就可染色。具體過程如下①將已入蒸餾水后的切片放入蘇木精水溶液中染色數(shù)分鐘。②酸水及氨水中分色，各數(shù)秒鐘。③流水沖洗I小時(shí)后入蒸餾水片刻。④入70%和90%酒精中脫水各10分鐘。⑤入酒精伊紅染色液染色2 — 3分鐘。 脫水透明染色后的切片經(jīng)純酒精脫水，再經(jīng)二甲苯使切片透明。 封固將已透明的切片滴上加拿大樹膠，蓋上蓋玻片封固。待樹膠略干后，貼上標(biāo)箋，切片標(biāo)本就可使用。通過連續(xù)切片，染色觀察，統(tǒng)計(jì)血管內(nèi)皮核數(shù)，結(jié)果表明C3aR+和CSaR+小鼠的突破內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮核數(shù)明顯低于C57BL/6J小鼠表明補(bǔ)體系統(tǒng)中的內(nèi)毒素分子C3a和C5a可明顯促進(jìn)視網(wǎng)膜新生血管的生長。建立OIR模型，分別取C57BL/6J小鼠及C3aR和C5aR敲除鼠(PBS對照組及FUT-175處理組)視網(wǎng)膜,提取總蛋白進(jìn)行western blot分析,具體操作步驟如下 總蛋白的提取加入蛋白裂解液及蛋白酶抑制劑，充分剪碎研勻，冰上放置，充分提取，離心，取上清。
SDS-PAGE凝膠電泳清洗玻璃板組裝電泳槽，灌膠與上樣，電泳(一般為恒壓120V電泳，當(dāng)樣品進(jìn)入下層膠后恒壓160V電泳直至溴酚藍(lán)達(dá)到凝膠底部為止)。 轉(zhuǎn)膜切膠，備膜,裝膜,轉(zhuǎn)膜 免疫反應(yīng),具體操作過程如下①封閉將膜用TBST中漂洗3次，每次5min。漂洗后將硝酸纖維素膜放入加有BSA封閉液的平皿中，室溫下?lián)u床2h，或者4°C冰箱過夜。②加一抗將封閉后的硝酸纖維素膜放入含有TBST的洗缸中搖床上漂洗3次，每次5min。洗完后將TBST盡可能浙干(但膜一定要保持濕潤)，放入加有一抗的平皿中側(cè)擺搖床室溫低速孵育2h。③加二抗回收一抗，將硝酸纖維素膜在TBST洗缸中室溫?fù)u床漂洗3次，每次5min,然后將漂洗過的硝酸纖維素膜放入加有二抗的平皿中，避光室溫孵育lh。孵育后將硝酸纖維素膜在TBST洗缸中洗3次每次5min。 化學(xué)發(fā)光,顯影,定影 凝膠圖像分析將膠片進(jìn)行掃描或拍照，用凝膠圖象處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的分子量和凈光密度值。通過分析凝膠圖像，顯示FUT-175可調(diào)節(jié)VEGF-A的蛋白表達(dá)，在敲除鼠中并無檢測到VEGF-A的表達(dá)變化，初步說明FUT-175通過補(bǔ)體系統(tǒng)(C3a和C5a)對VEGF-A表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，進(jìn)而調(diào)節(jié)RNV的生長，并可更早、更有效的治療視網(wǎng)膜新生血管性疾病。因此，甲磺酸萘莫司他可以用來制備治療視網(wǎng)膜新生血管性疾病的藥物。
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實(shí)施例I :甲磺酸萘莫司他添加C3a抗體C3a抗體購買于Abcam公司(ab48581)。制備的藥品中中包含有質(zhì)量體積比g/ml為2%的甲磺酸萘莫司，同時(shí)添加質(zhì)量體積比g/ml為0. 002%的C3a抗體，防腐劑苯乙醇的添加量質(zhì)量體積比g/ml為I. 1%，最后用磷酸鹽緩沖液補(bǔ)充至最終體積。對于甲磺酸萘莫司和抗體、防腐劑的用量以符合藥理劑量為準(zhǔn)，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以通過常規(guī)的方法來確定添加量，而不僅僅限于本發(fā)明說明書中記載的范圍。具體制備方法是將甲磺酸萘莫司他固體粉末溶于磷酸鹽緩沖液(氯化鈉9克，磷酸氫二鈉6克，磷酸二氫鈉0.4克添加雙蒸水至1000ml，？117.2至7.4)中，加入濃度為200 u g/ml的抗體,然后加入苯乙醇完成制備。實(shí)施例2 甲磺酸萘莫司他添加C3a和C5a抗體C5a抗體購買于Santa Cruz公司(sc-21941 )。在90ml磷酸鹽緩沖液中加入Ig甲磺酸萘莫司，再加入0. 003g的C3a和C5a抗體的混合物，其中C3a和C5a抗體的添加比例 為I :1，再加入Ig防腐劑苯乙醇作為防腐劑，最后用磷酸鹽緩沖液補(bǔ)齊到100ml。其中C3a和C5a抗體可以等比例添加，也可以選用任一藥理允許的比例。根據(jù)甲磺酸萘莫司他的腹腔給藥劑量50mg/kg，自氧誘導(dǎo)模型的P12天開始，每天注射此實(shí)施例2制備的藥物，在視網(wǎng)膜新生血管生長最為旺盛的P17可以觀察到，注射此實(shí)施例藥劑的小鼠視網(wǎng)膜新生血管的生長較單純注射甲磺酸萘莫司他更加有效得得以控制，血管生長更加正常。
權(quán)利要求
1.甲磺酸萘莫司他的應(yīng)用，其特征在于，所述的應(yīng)用是甲磺酸萘莫司他在制備治療視網(wǎng)膜新生血管性疾病的藥物中的應(yīng)用。
2.一種治療視網(wǎng)膜新生血管性疾病的藥物，其特征在于，所述的藥物為包含有藥理有效劑量的甲磺酸萘莫司他的溶液。
3.如權(quán)利要求2所述的藥物，其特征在于，所述的甲磺酸萘莫司他在溶液中的濃度為I 3%。
4.權(quán)利要求2所述的藥物，其特征在于所述的藥物還包括有補(bǔ)體系統(tǒng)內(nèi)毒素分子C3a和/或C5a的抗體。
5.如權(quán)利要求4所述的藥物，其特征在于所述的抗體的添加量為0.002 0. 01%。
6.如權(quán)利要求2或4所述的藥物，其特征在于所述的藥物還添加防腐劑。
7.如權(quán)利要求6所述的藥物，其特征在于所述的防腐劑為苯乙醇。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種治療視網(wǎng)膜新生血管性疾病的藥物，即用甲磺酸萘莫司他來制備治療視網(wǎng)膜新生血管性疾病的藥物。且在藥物中還選擇性的添加有補(bǔ)體系統(tǒng)內(nèi)毒素分子C3a和/或C5a的抗體。本發(fā)明使用甲磺酸萘莫司他，作用于補(bǔ)體途徑，來制備治療視網(wǎng)膜新生血管性疾病的藥物，同時(shí)添加有C3a、C5a多肽的抗體，產(chǎn)生中和作用，更加有效的控制視網(wǎng)膜新生血管的生長，制備的藥物將成為視網(wǎng)膜新生血管治療的新型藥物，為臨床多種視網(wǎng)膜新生血管性疾病的治療提供新思路。
文檔編號A61P9/10GK102743371SQ201210259990
公開日2012年10月24日 申請日期2012年7月26日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月26日
發(fā)明者朱瑋, 祁霞, 賈玉東 申請人:山東省眼科研究所