專利名稱：：結(jié)合細(xì)胞內(nèi)prl-1多肽或prl-3多肽的抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域、細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域、分子生物學(xué)領(lǐng)域及生物化學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明還涉及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及疾病尤其是癌癥的治療和診斷，以及用于這樣的用途的組合物。癌癥是全世界的一個(gè)嚴(yán)重健康問(wèn)題。在2007年，據(jù)估計(jì)全世界有760萬(wàn)人死于癌癥。例如在英國(guó)，癌癥每年造成126，000人死亡。四分之一的人死于癌癥。已知用于癌癥的治療法包括外科手術(shù)、化學(xué)療法和放射療法。如果發(fā)現(xiàn)地夠早，許多癌癥可以被治愈。100年之前，德國(guó)化學(xué)家保羅奧利克(PaulEhrlich)提出了抗體作為“魔方”的觀念?？贵w能夠以特殊的方式識(shí)別及結(jié)合它們的抗原，因此是用于經(jīng)免疫系統(tǒng)識(shí)別及破壞惡性細(xì)胞的理想制劑。由于這個(gè)原因，抗體構(gòu)成了ー類發(fā)展最為快速的人類癌癥療法。大量潛在的癌癥或腫瘤標(biāo)記物以及癌癥抗原已經(jīng)在文獻(xiàn)中被鑒定，并且已經(jīng)開(kāi)發(fā)出對(duì)抗它們中的ー些的抗體治療物。例如，已知的癌癥治療物赫賽汀(Herceptin)(曲妥珠單抗(Trastuzumab))是ー種能殺死HER2陽(yáng)性癌細(xì)胞的單克隆抗體。赫賽汀可結(jié)合癌細(xì)胞上的HER2(人表皮生長(zhǎng)因子受體2)抗原。同樣，貝伐單抗(Bevacizumab)(阿瓦斯汀(Avastin))是ー種祀向血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的單克隆抗體，VEGF是ー種參與新血管形成的生長(zhǎng)因子。通過(guò)抑制血管發(fā)生，貝伐單抗可阻止腫瘤細(xì)胞接收穩(wěn)定的血液供應(yīng)，從而防止接收腫瘤存活需要的氧和營(yíng)養(yǎng)物。然而，抗體治療對(duì)于不同癌癥的適應(yīng)性不是普遍的。妨礙抗體治療普遍應(yīng)用的一個(gè)限制是抗體分子較大的體積，并因此不能通過(guò)質(zhì)膜或細(xì)胞膜。在不進(jìn)行改良的情況下，抗體(包括單克隆抗體)通常僅適宜于靶向位于宿主細(xì)胞表面或外部的癌癥抗原14_15。在以上的實(shí)例中，J1ER2受體位于細(xì)胞表面，因此是赫賽汀進(jìn)行抗體結(jié)合可及的。同樣，VEGF被分泌到血液中，能夠被貝伐單抗結(jié)合。PRL是ー類細(xì)胞內(nèi)C末端異戊ニ烯化的蛋白質(zhì)。缺乏異戊ニ烯化信號(hào)的PRL突變形式一般位于核內(nèi)16_17。通過(guò)EM免疫金標(biāo)記顯示PRL-I和PRL-3定位于質(zhì)膜和早期內(nèi)體的內(nèi)葉(innerleaflet)18。PRL-3和PRL-I的過(guò)表達(dá)已被表明與多種人癌癥相關(guān)3_12’19。PRL-I和PRL-3已知與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)。已經(jīng)知道，大多數(shù)癌癥患者死于轉(zhuǎn)移，而非死于他們的原發(fā)疾病。迫切需要防止癌癥轉(zhuǎn)移的有效方法。迄今為止抗體還沒(méi)有被用于靶向細(xì)胞內(nèi)抗原或癌癥標(biāo)記物，這是因?yàn)榭贵w無(wú)法通過(guò)細(xì)胞膜，因而無(wú)法接近抗原。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明人現(xiàn)已證明，針對(duì)PRL-I和PRL-3的抗體可意外地結(jié)合至它們的細(xì)胞內(nèi)靶標(biāo)。根據(jù)文獻(xiàn)中的提示，以前從未認(rèn)為可能用抗體靶向細(xì)胞內(nèi)PRL以消除癌細(xì)胞和癌癥轉(zhuǎn)移，這是因?yàn)镻RL的細(xì)胞內(nèi)定位。本發(fā)明人已表明實(shí)際情況不是這樣，并提供抗-PRL-I抗體和抗-PRL-3抗體用作癌癥治療劑，尤其是癌癥轉(zhuǎn)移的治療劑。Li等人(2005)描述了PRL-I和PRL-3特異性單克隆抗體的產(chǎn)生。然而，這些抗體的序列以及這些抗體的可變區(qū)序列還沒(méi)有被公開(kāi)。而且，產(chǎn)生這些抗體的雜交瘤在當(dāng)時(shí)并不為公眾可及，并且迄今為止也不為公眾可及。從而，在Li等人(2005)中描述的抗體迄今為止公眾也無(wú)法獲得。再者，考慮到PRL-I和PRL-3的細(xì)胞內(nèi)定位，沒(méi)有說(shuō)明所述抗體可用于治療癌癥。本發(fā)明人公開(kāi)了兩種針對(duì)PRL-I的小鼠單克隆抗體(269和223)以及ー種針對(duì)PRL-3的小鼠單克隆抗體(318)的可變區(qū)。本發(fā)明人公開(kāi)了抗-PRL-I抗體269和抗-PRL-3抗體318的結(jié)合表位。本發(fā)明人還公開(kāi)了產(chǎn)生這些抗體的方法，以及制備具有與這些抗體相同或相似結(jié)合性質(zhì)的抗體的方法，這些方法的每ー種迄今為止均是不可能的。根據(jù)本發(fā)明的第I方面，本發(fā)明人提供了一種能夠結(jié)合至PRL-I多肽或PRL-3多肽的抗體，其中所述抗體能夠結(jié)合與抗體269、抗體223或抗體318或者它們的變體、同系物、衍生物或片段結(jié)合的表位。所述抗體能夠結(jié)合至與抗體269結(jié)合的PRL-I多肽上的表位。所述抗體可包括能夠結(jié)合至表位TYKNMR和/或TLNKFI的抗-PRLl抗體，或者它的變體、同系物、衍生物或片段。所述抗體能夠結(jié)合至與抗體223或抗體318結(jié)合的PRL-3多肽上的表位。所述抗體可包括能夠結(jié)合至表位KAKFYN和/或HTHKTR的抗-PRL3抗體，或者它的變體、同系物、衍生物或片段。所述抗體可包含單克隆抗體269的可變區(qū)(SEQIDNO:2,SEQIDN0:4)、單克隆抗體223的可變區(qū)(SEQIDNO:6,SEQIDN0:8)或單克隆抗體318的可變區(qū)(SEQIDNO:10、SEQIDNO:12)。根據(jù)本發(fā)明的第2方面，提供了ー種抗體，所述抗體包含單克隆抗體269的可變區(qū)(SEQIDNO:2,SEQIDNO:4)或者它的能結(jié)合PRL-I的變體、同系物、衍生物或片段。根據(jù)本發(fā)明的第3方面，本發(fā)明人提供了ー種抗體，所述抗體包含單克隆抗體223的可變區(qū)(SEQIDN0:6、SEQIDNO:8)或者它的能結(jié)合PRL-I的變體、同系物、衍生物或片段。根據(jù)本發(fā)明的第4方面，本發(fā)明人提供了ー種抗體，所述抗體包含單克隆抗體318的可變區(qū)(SEQIDNO:10,SEQIDNO:12)或者它的能結(jié)合PRL-3的變體、同系物、衍生物或片段。所述抗體能夠結(jié)合至細(xì)胞內(nèi)PRL-I多肽或PRL-3多肽。所述抗體能夠通過(guò)細(xì)胞質(zhì)膜。所述抗體能夠結(jié)合并抑制PRL-I或PRL-3的生物活性，優(yōu)選蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)活性。所述抗體能夠防止癌癥轉(zhuǎn)移，所述癌癥優(yōu)選結(jié)腸直腸癌、卵巣癌、乳腺癌、肝癌、胰腺癌、前列腺癌、胃癌、肺癌、陰莖癌、子宮癌、腦癌、食道癌、膀胱癌、腎細(xì)胞癌、卵巣淋巴瘤和皮膚黑色素瘤。所述癌癥可包括表達(dá)PRL-I或PRL-3的癌癥。所述抗體可包括單克隆抗體或人源化單克隆抗體。作為本發(fā)明的第5方面，提供了ー種包含如前述的抗-PRL-I抗體和抗-PRL-3抗體的結(jié)合物。根據(jù)本發(fā)明的第6方面，本發(fā)明人提供了ー種藥物組合物，所述藥物組合物包含這樣的抗體或結(jié)合物，以及可藥用的賦形劑、稀釋劑或載體。本發(fā)明在第7方面中提供了一種能夠結(jié)合至PRL-I或PRL-3的抗體，用于ー種癌癥或癌癥轉(zhuǎn)移的治療方法或預(yù)防方法中，所述抗體可包括如前述的抗體、如上文列出的結(jié)合物或如上文列出的藥物組合物。所述方法可包括將癌細(xì)胞暴露于所述抗體或結(jié)合物。所述方法可包括將治療有效量的所述抗體、結(jié)合物或組合物給予患有或疑似患有癌癥的個(gè)體。所述癌癥可包括轉(zhuǎn)移癌。所述癌癥可為表達(dá)PRL-I或PRL-3的癌癥。所述癌癥可包括結(jié)腸直腸癌、卵巢癌、乳腺癌、肝癌、胰腺癌、前列腺癌、胃癌、肺癌、陰莖癌、子宮癌、腦癌、食道癌、膀胱癌、腎細(xì)胞癌、卵巣淋巴瘤和皮膚黑色素瘤。治療個(gè)體中的轉(zhuǎn)移瘤數(shù)目與未治療個(gè)體相比可減少至少50%。它可減少至少60%。它可減少低至少70%。它可減少至少80%。治療個(gè)體中的轉(zhuǎn)移瘤數(shù)目與未治療的個(gè)體相比可減少至少90%。根據(jù)本發(fā)明的第8方面，提供了ー種如上文列出的抗體、一種如所述的結(jié)合物或一種如所述的藥物組合物，用于癌癥或癌癥轉(zhuǎn)移的診斷方法中。根據(jù)本發(fā)明的第9方面，本發(fā)明人提供了一種診斷試劑盒，所述診斷試劑盒包含這樣的抗體、這樣的結(jié)合物或這樣的藥物組合物以及在癌癥或癌癥轉(zhuǎn)移的診斷中使用的說(shuō)明書(shū)。根據(jù)本發(fā)明的第10方面，本發(fā)明人提供了一種多肽，所述多肽包含選自以下的序列SEQIDNO:2,SEQIDNO:4,SEQIDNO:6,SEQIDN0:8、SEQIDNO:10或SEQIDNO:12，或者它們能夠結(jié)合PRL的變體、同系物、衍生物或片段。根據(jù)本發(fā)明的第11方面，提供了ー種核酸，所述核酸包含能夠編碼如上文列出的分子的序列，例如選自以下的序列SEQIDN0:USEQIDNO:3,SEQIDNO:5,SEQIDNO:7、SEQIDNO:9和SEQIDNO:11或者它們能夠編碼具有PRL結(jié)合活性的多肽的變體、同系物、衍生物或片段。作為本發(fā)明的第12方面，本發(fā)明人提供了ー種包含或轉(zhuǎn)化有這樣的核酸序列的細(xì)胞，或者這樣的細(xì)胞的后代。根據(jù)本發(fā)明的第13方面，本發(fā)明人提供了一種產(chǎn)生如所述的抗體的方法，所述方法包括提供一種這樣的細(xì)胞并從所述細(xì)胞表達(dá)所述抗體。根據(jù)本發(fā)明的第14方面，本發(fā)明人提供了一種在個(gè)體中診斷癌癥例如轉(zhuǎn)移癌的方法，所述方法包括將來(lái)自所述個(gè)體的生物樣品暴露于如上文列出的抗體，并檢測(cè)所述抗體和PRL-I多肽或PRL-3多肽的結(jié)合情況。根據(jù)本發(fā)明的第15方面，提供了一種在患有或疑似患有癌癥的個(gè)體中治療或者預(yù)防癌癥例如轉(zhuǎn)移癌的方法，所述方法包括給予所述個(gè)體治療有效量的如所述的抗體、如所述的結(jié)合物或如所述的組合物。所述方法可包含如上述任一段中列出的特征。根據(jù)本發(fā)明的第16方面，本發(fā)明人提供了一種在患有或疑似患有癌癥的個(gè)體中治療或預(yù)防癌癥例如轉(zhuǎn)移癌的方法，所述方法包括通過(guò)如所述的方法在所述個(gè)體中診斷癌癥，并通過(guò)如所述的方法治療所述個(gè)體。根據(jù)本發(fā)明的第17方面，本發(fā)明人提供了ー種檢測(cè)轉(zhuǎn)移細(xì)胞的方法，所述方法包括將候選細(xì)胞暴露于如上述的抗體，并檢測(cè)所述細(xì)胞的PRL-I多肽或PRL-3多肽表達(dá)情況。根據(jù)本發(fā)明的第18方面，本發(fā)明人提供了ー種產(chǎn)生轉(zhuǎn)移瘤動(dòng)物模型的方法，所述方法包括(a)將多個(gè)轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞例如表達(dá)PRL-I或PRL-3的癌細(xì)胞給予第一動(dòng)物；(b)使所述細(xì)胞在所述第一動(dòng)物中發(fā)展成轉(zhuǎn)移瘤；(C)從所述第一動(dòng)物提取轉(zhuǎn)移瘤并從所述轉(zhuǎn)移瘤獲得細(xì)胞系；并((0將所述細(xì)胞系的多個(gè)細(xì)胞給予第二動(dòng)物。根據(jù)本發(fā)明的第19方面，本發(fā)明人提供了一個(gè)通過(guò)一種這樣的方法得到的動(dòng)物模型。根據(jù)本發(fā)明的第20方面，本發(fā)明人提供了通過(guò)ー種這樣的方法產(chǎn)生的動(dòng)物模型或者如上文列出的動(dòng)物模型作為轉(zhuǎn)移瘤模型的用途。根據(jù)本發(fā)明的第21方面，本發(fā)明人提供了ー種包括以下步驟的方法提供如所述的抗體，并使所述抗體結(jié)合至PRL-I多肽或PRL-3多肽。可使所述抗體結(jié)合至表達(dá)PRL-I多肽或PRL-3多肽的細(xì)胞。所述PRL-I可包括細(xì)胞內(nèi)PRL-I多肽。所述PRL-3多肽可包括細(xì)胞內(nèi)PRL-3多肽。除非另外指出，否則本發(fā)明的實(shí)施將運(yùn)用化學(xué)、分子生物學(xué)、微生物學(xué)、重組DNA和免疫學(xué)的常規(guī)技術(shù)，這些是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的能力所能及的。這些技術(shù)在文獻(xiàn)中有說(shuō)明。例如，參見(jiàn)J.Sambrook,E.F.Fritsch,andT.Maniatis,1989,MolecularCloning:ALaboratoryManual，SecondEdition,Books1—3，ColdSpringHarborLaboratoryPress;Ausubel,F.M.etal.(1995andperiodicsupplements;CurrentProtocolsinMolecularBiology，ch.9，13，and16，JohnWiley&Sons,NewYork,N.Y.);B.Roe,J.Crabtree,andA.Kahn,1996，DNAIsolationandSequencingEssentialTechniques,JohnWiley&Sons;J.M.PolakandJames0，D.McGee，1990，InSituHybridization!PrinciplesandPractice;OxfordUniversityPress;M.J.Gait(Editor)，1984，OligonucleotideSynthesisAPracticalApproach,IrlPress;D.M.J.LilleyandJ.E.Dahlberg,1992,MethodsofEnzymologyDNAStrurePartA!SynthesisandPhysicalAnalysisofDNAMethodsinEnzymology,AcademicPress;UsingAntibodiesALaboratoryManual!PortableProtocolNO.IbyEdwardHarlow,DavidLane,EdHarlow(1999,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ISBN0-87969-544-7);AntibodiesALaboratoryManualbyEdHarlow(Editor),DavidLane(Editor)(1988，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ISBN0-87969-314-2)，1855.HandbookofDrugScreening,editedbyRamakrishnaSeethala，PrabhavatniB.Fernandes(2001，NewYork，NY，MarcelDekker,ISBN0-8247-0562-9);和LabRefAHandbookofRecipes,Reagents,andOtherReferenceToolsforUseattheBench,EditedJaneRoskamsandLindaRodgers,2002，ColdSpringHarborLaboratory,ISBN0-87969-630-3。這些一般性文本的每ー篇都通過(guò)弓I用的方式納入本文。圖I.快速形成侵襲性(aggressive)肺腫瘤轉(zhuǎn)移的七步動(dòng)物模型。I.如以前的描述8，產(chǎn)生50%細(xì)胞表達(dá)EGFP-PRL-3或EGFP-PRL-I的CHO穩(wěn)定混合池。2.經(jīng)尾靜脈將IXlO6的這種細(xì)胞注射至裸鼠的循環(huán)系統(tǒng)中。3.在注射后3周時(shí)分離單個(gè)的EGFP-PRL-3或EGFP-PRL-I肺腫瘤。4.在培養(yǎng)皿中切割并剁碎所述腫瘤以產(chǎn)生同質(zhì)的表達(dá)EGFP-PRL的細(xì)胞系(AT-3或AT-1)。5.將IXIO6個(gè)AT-3細(xì)胞或AT-I細(xì)胞經(jīng)裸鼠的尾靜脈注射至循環(huán)系統(tǒng)中。6.未處理組未處理、PBS或無(wú)關(guān)小鼠抗體。7.將以AT-3細(xì)胞注射的小鼠用腹水或純IgG形式的PRL-3mAb克隆#223或#318處理，而將以AT-I細(xì)胞注射的小鼠以PBS處理或者以PRL-ImAb克隆269腹水處理。圖2.PRL-3和PRL-ImAb特異性地抑制它們各自的轉(zhuǎn)移性肺腫瘤形成。A.將IXIO6個(gè)AT3細(xì)胞(圖I中描述)經(jīng)尾靜脈注射至裸鼠中。小鼠是未處理的(a，n=10)或PBS-處理的(b,n=10),或者被以兩種無(wú)關(guān)抗體處理(c,n=5；d,n=5)。PRL_3mAb223是以純IgG(e)或腹水(g)的形式經(jīng)尾靜脈給予；PRL-3mAb318是以純IgG(f)或腹水(h)的形式經(jīng)尾靜脈給予。在接種AT3細(xì)胞后第3、6和9天注射所述不同的抗體。在注射后第15天切下肺并在熒光顯微鏡下照相以顯示GPF-陽(yáng)性的轉(zhuǎn)移瘤。圖像a、b、e和f為雌性小鼠的肺。圖像c、d、g和h為雄性小鼠的肺。B.A中的腫瘤總數(shù)目被認(rèn)為是每組腫瘤損害的平均數(shù)(Y軸)，X軸顯示經(jīng)不同處理的不同組小鼠。以AT-3細(xì)胞注射的小鼠的結(jié)果顯示于第1-7列。以AT-I細(xì)胞注射的小鼠以PBS或以抗PRL-I的mAb269處理(第8_9列)。n=每組中的小鼠數(shù)目。圖3.PRL-ImAb特異性地抑制PRL-I轉(zhuǎn)移瘤，但不抑制PRL-3轉(zhuǎn)移瘤；而PRL_3mAb特異性地抑制PRL-3轉(zhuǎn)移瘤，但不抑制PRL-I轉(zhuǎn)移瘤。在第I天，本發(fā)明人將表達(dá)EGFP-PRL-I或EGFP-PRL-3的一百萬(wàn)個(gè)癌細(xì)胞(AT-1或AT-3)經(jīng)其尾靜脈注射至每只小鼠中。然后將小鼠分組，在注射癌細(xì)胞后第3、6和9天經(jīng)它們的尾靜脈分別接受PBS、兔PRL抗體、？此-1!1^13或？1^-311^13。在第15天，將來(lái)自攜帶表達(dá)EGFP-PRL-I的AT-I癌細(xì)胞的小鼠的肺(圖a-d)或來(lái)自攜帶表達(dá)EGFP-PRL-3的AT-3癌細(xì)胞的小鼠的肺(e_h)切下并拍照。肺中的PRL-I和PRL-3轉(zhuǎn)移瘤不能被模擬品PBS處理阻斷(a、e)，但都可以被兔抗體(b、f)有效阻斷。PRL-ImAb可抑制PRL-I過(guò)表達(dá)的腫瘤的形成(C)，但當(dāng)PRL-3過(guò)表達(dá)時(shí)不抑制腫瘤的形成(g)。類似地，PRL-3mAb可抑制PRL-3過(guò)表達(dá)的轉(zhuǎn)移瘤的形成(h),但在PRL-I過(guò)表達(dá)時(shí)不抑制轉(zhuǎn)移瘤的形成(d)。因此，這些各個(gè)PRL-mAb分別在對(duì)表達(dá)其靶抗原的細(xì)胞的肺轉(zhuǎn)移瘤形成進(jìn)行阻斷中是特異性的。圖4.PRL-3mAb可有效地阻斷A2780PRL-3-陽(yáng)性癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移瘤形成；但對(duì)于CT26PRL-3陰性癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移瘤形成沒(méi)有效應(yīng)。A.A2780細(xì)胞而非CT26細(xì)胞表達(dá)內(nèi)源的PRL-3。通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法分析從CT26小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞系和A2780人卵巢癌細(xì)胞系制備的細(xì)胞裂解物，以檢測(cè)PRL-3。將GAPDH用作上樣對(duì)照。B.PRL-3抗體處理不影響接種癌細(xì)胞后2周時(shí)CT26PRL-3陰性細(xì)胞的肺腫瘤形成。對(duì)所有主要組織檢查腫瘤形成情況。對(duì)處理小鼠(圖a)和未處理小鼠(圖b)的動(dòng)物總體形態(tài)以及切下的肺拍照。在所有肺中觀測(cè)到了廣泛的腫瘤形成，由黒色箭頭標(biāo)出。C.PRL-3抗體處理可抑制接種癌細(xì)胞后I個(gè)月時(shí)實(shí)驗(yàn)性轉(zhuǎn)移測(cè)定中的病理表觀及A2780PRL-3陽(yáng)性細(xì)胞的腫瘤形成。對(duì)所有主要組織檢查腫瘤形成情況。對(duì)動(dòng)物總體形態(tài)以及從未處理動(dòng)物切下的腫瘤(由黒色箭頭標(biāo)出)拍照。在處理小鼠中沒(méi)有觀測(cè)到腫瘤。圖5.通過(guò)間接免疫熒光法顯示AT-3癌細(xì)胞和親本CHO細(xì)胞中的抗體攝取。A.EGFP-PRL-3在所有非透化AT-3細(xì)胞中表達(dá)，這是通過(guò)EGFP檢測(cè)的(a、d)。一些細(xì)胞被PRL-3mAb完全標(biāo)記19(圖b、e中白色箭頭標(biāo)出)；40%的非透化細(xì)胞被PRL_3mAb部分地標(biāo)記為紅色；所述被內(nèi)化的抗體似乎以極化的方式分布于細(xì)胞端部(f中單頭箭頭標(biāo)出)并且ー些分布在膜突出物中(f中雙頭箭頭標(biāo)出)；而剩下的細(xì)胞保持未標(biāo)記(c和f，僅綠色的細(xì)胞)。B.To-pro-3碘化物被用于將每個(gè)親本CHO細(xì)胞的DNA染色為藍(lán)色。能夠攝取小鼠抗-GS28抗體的活細(xì)胞(10-20%)呈現(xiàn)綠色(a、b和C)。血清過(guò)夜饑餓的大多數(shù)活細(xì)胞(60-70%)能夠攝取小鼠抗-GS28抗體，呈現(xiàn)為綠色(d、e和f)。白色箭頭標(biāo)出不能攝取抗體的一些細(xì)胞(或許處于細(xì)胞周期的某些階段)。尺度條，20ym。圖6.正常細(xì)胞和癌細(xì)胞中一般的抗體攝取現(xiàn)象通過(guò)雙染色的間接免疫熒光法顯示A.將小鼠抗-GS28抗體(紅色)和兔抗-PTEN抗體(綠色)添加至非透化MCF-10A正常細(xì)胞。B.將小鼠抗-GS28抗體(紅色)和兔抗-p53抗體(綠色)添加至非透化MCF-7癌細(xì)胞。C.將小鼠抗-GS28抗體(紅色)和兔抗_p53抗體(綠色)添加至16小時(shí)血清饑餓的非透化MCF-7細(xì)胞。將To-pro-3碘化物用于染色DNA(藍(lán)色)。尺度條，20ym。圖7.PRL-3和PRL-I在多種人癌癥中過(guò)表達(dá)。A.將PRL_3mAb(克隆223或318)用于檢查PRL-3在多個(gè)人癌癥樣品中的表達(dá)情況。PRL-3過(guò)表達(dá)的實(shí)例出現(xiàn)于人結(jié)腸(26/158例，a)、乳腺(19/96例，b)、食道(2/13例，C)、肺(d，虛線右手邊上方的吸煙沉淀物被染色為黒色)、陰莖(e)和宮頸癌(f)。所述PRL-3陽(yáng)性信號(hào)通過(guò)用3，3'-ニ氨基聯(lián)苯胺色原(DAB)的免疫組織化學(xué)法被顯示為褐色。所有圖像的放大倍數(shù)都是X400。B.將PRL-ImAb(克隆269)用于檢查PRL-I在多個(gè)人癌癥樣品中的表達(dá)情況。顯示了PRL-I在人結(jié)腸(8/128例，a,X200放大倍數(shù))、腦(5/20例，b，X200)和食道(1/13例，c，X400)中過(guò)表達(dá)的實(shí)例。圖8.PRL-3和PRL-I嵌合mAb僅特異性地與它們各自的抗原作用。A.所示的模型顯示了構(gòu)建嵌合mAb的主要步驟梗概。B.通過(guò)IF，在過(guò)表達(dá)EGFP-PRL-3的DLD-I細(xì)胞上測(cè)試了PRL-3嵌合mAb(#318)(a)，并表明所述PRL-3嵌合mAb能識(shí)別這些細(xì)胞中的EGFP-PRL-3(b)。合并的圖像顯示于c中。類似地，還在過(guò)表達(dá)EGFP-PRL-I的DLD-I人結(jié)腸直腸癌細(xì)胞上測(cè)試了PRL-I嵌合mAb(#269)(d)，并表明所述PRL-ImAb能識(shí)別這些細(xì)胞中的EGFP-PRL-1(e)。合并的圖像顯示于f中。尺度條，20iim。C.通過(guò)蛋白質(zhì)印跡分析,在源自過(guò)表達(dá)EGFP-PRL-3的DLD-I細(xì)胞(第I道)、過(guò)表達(dá)myc-PRL_3(第2道)、myc-PRL-l(第3道)或myc-PRL-2(第4道)的CHO細(xì)胞的4份細(xì)胞裂解物上評(píng)估了所述PRL-3嵌合mAb。PRL-3嵌合mAb僅與EGFP-PRL-3和myc-PRL-3作用，而不與myc-PRL-l和myc-PRL-2作用。D.在3種GST-PRL蛋白質(zhì)上評(píng)估了所述PRL-I嵌合mAb=GST-PRL-I(第I道)、GST-PRL-2(第2道)和GST-PRL-3(第3道)。PRL-I嵌合mAb僅與GST-PRL-1作用，但不與GST-PRL-2和GST-PRL-3作用。圖9.PRL-3嵌合mAb顯著地抑制表達(dá)內(nèi)源性PRL-3的A2780細(xì)胞和HCTl16細(xì)胞的轉(zhuǎn)移瘤形成，但不抑制不表達(dá)內(nèi)源性PRL-3的DLD-I細(xì)胞的轉(zhuǎn)移瘤形成。A.從過(guò)表達(dá)EGFP-PRL-3的HCT116、A2780、DLD-I癌細(xì)胞和DLD-I細(xì)胞提取總細(xì)胞裂解物。所述內(nèi)源性PRL-3蛋白在HCT116和A2780被檢測(cè)到，但未在在DLD-I細(xì)胞中被檢測(cè)到。所述外源性EGFP-PRL-3僅在第4道被檢測(cè)到。對(duì)于B、C和D:在第I天經(jīng)尾靜脈以IXIO6個(gè)癌細(xì)胞注射裸鼠。所述小鼠被給予PRL-3嵌合mAb(處理的)或PBS(未處理的)。當(dāng)未處理小鼠嚴(yán)重患病吋，每個(gè)實(shí)驗(yàn)的時(shí)長(zhǎng)被確定并結(jié)束。在每次實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)拍照片。B.HCT116細(xì)胞的處理，左為處理的小鼠，右為未處理的小鼠。C.A2780細(xì)胞的處理，左為處理的小鼠，右為未處理的小鼠。D.a.DLD-I細(xì)胞的處理，左為處理的小鼠，右為未處理的小鼠；b.表達(dá)EGFP-PRL-3的DLD-I細(xì)胞的處理，左為未處理的小鼠，右為處理的小鼠。圖10.PRL-3可增強(qiáng)肺轉(zhuǎn)移瘤形成和血液循環(huán)中的癌細(xì)胞存活。A.顯示了來(lái)自處理小鼠和未處理小鼠的肺切片。在熒光顯微鏡下，多個(gè)微腫瘤(以Micro-T標(biāo)出)出現(xiàn)在來(lái)自未處理小鼠的肺切片中，但很少出現(xiàn)在來(lái)自處理小鼠的肺切片中。B.將從處理小鼠和未處理小鼠的尾靜脈得到的血液樣品涂于載玻片上，并在熒光顯微鏡下檢查EGFP-PRL-3癌細(xì)胞。箭頭標(biāo)示出了EGFP-PRL-3陽(yáng)性的癌細(xì)胞。圖11.PRL-3嵌合抗體可有效地抑制表達(dá)內(nèi)源性PRL-3的B16R)細(xì)胞的轉(zhuǎn)移瘤形成，但不抑制不表達(dá)內(nèi)源性PRL-3的B16F10細(xì)胞的轉(zhuǎn)移瘤形成。A.從B16R)和B16F10癌細(xì)胞制備總細(xì)胞裂解物。所述內(nèi)源性PRL-3蛋白僅在B16R)細(xì)胞被檢測(cè)到，但未在B16F10細(xì)胞中被檢測(cè)到。B.在嵌合mAb處理后第I天以IXIO6個(gè)B16R)細(xì)胞注射裸鼠。左側(cè)顯示處理的小鼠，右側(cè)顯示未處理的小鼠。腫瘤出現(xiàn)于未處理的小鼠的腎上腺、肝、骨和腹部中。PRL-3mAb可消除處理小鼠大多數(shù)組織中的腫瘤形成。C.在第I天以IXIO6個(gè)B16F10細(xì)胞注射裸鼠。上圖顯示處理的小鼠，下圖顯示未處理的小鼠。數(shù)十個(gè)肺轉(zhuǎn)移瘤出現(xiàn)于處理小鼠中和未處理小鼠中。圖12.抗-PRL3抗體318可結(jié)合細(xì)胞內(nèi)的和外部化的/分泌的PRL-3多肽。A.細(xì)胞內(nèi)PRL3，B.GAPDH對(duì)照，C.外部化的/分泌的PRL-3多肽。圖13.抗-PRLl抗體269和抗-PRL3抗體318的表位作圖。A.通過(guò)蛋白質(zhì)印跡顯示的抗-PRLl抗體269結(jié)合的肽。B.通過(guò)蛋白質(zhì)印跡顯示的抗-PRL3抗體318結(jié)合的肽。具體實(shí)施例方式抗-PRL抗體本文實(shí)施例描述了抗PRL蛋白的抗體(即抗-PRL抗體)的形成和生產(chǎn)。這些抗-PRL抗體能夠結(jié)合PRL-I或PRL-3，優(yōu)選細(xì)胞內(nèi)PRL-I或PRL-3。單克隆抗體和人源化單克隆抗體兩者以及它們的性質(zhì)都詳述于本文和實(shí)施例。所述抗體包括能夠結(jié)合至PRL-I的單克隆抗體269。所述抗體還包括能夠結(jié)合至PRL-3的單克隆抗體223和單克隆抗體318。這些抗體中每ー種的人源化形式也被公開(kāi)。為了避免歧義，除非在上下文中另外指出，否則在本文中如果提及ー個(gè)特別的抗體命名，那么將認(rèn)為這包括提及了小鼠單克隆抗體(由一種雜交瘤分泌)以及它的人源化形式。因此，例如，如果抗體269被提及，則這包括單克隆抗體269(即小鼠雜交瘤分泌的被命名為269的抗體)以及人源化單克隆抗體269。本領(lǐng)域技術(shù)人員通過(guò)本文中公開(kāi)的信息并應(yīng)用本發(fā)明人亦詳述的分子生物學(xué)技術(shù)，可產(chǎn)生本文中描述的特定抗體?；诖四康?，本發(fā)明人公開(kāi)了單克隆抗體269、單克隆抗體223和單克隆抗體318的可變區(qū)序列。本發(fā)明人還公開(kāi)了這些可變區(qū)的變體、同系物、片段和衍生物。本領(lǐng)域技術(shù)人員使用這些序列信息可產(chǎn)生包含這些可變區(qū)或它們的變體、同系物、片段和衍生物的抗體。本發(fā)明人還公開(kāi)了用于表達(dá)這些單克隆抗體的核酸構(gòu)建體的序列。這些構(gòu)建體的序列能夠產(chǎn)生具有與269、223或318相同的序列的單克隆抗體。本發(fā)明人還公開(kāi)了269、223和318的變體、同系物、片段和衍生物。最后，本發(fā)明人公開(kāi)了能夠表達(dá)所述人源化單克隆抗體269、223或318的構(gòu)建體的序列。本發(fā)明人描述了從以所述構(gòu)建體以及這些人源化構(gòu)建體的變體、同系物、片段和衍生物轉(zhuǎn)染的細(xì)胞表達(dá)所需抗體的方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員使用這些序列和表達(dá)方法可容易地轉(zhuǎn)染相關(guān)的宿主細(xì)胞，并使它們表達(dá)整個(gè)單克隆的或者人源化的抗-PRL-I抗體和抗-PRL3抗體，或者它們的變體、同系物、片段和衍生物。本發(fā)明人還提供了一般具有PRL結(jié)合活性的多肽。這些多肽包括抗-PRL抗體，例如抗-PRL-I抗體和抗-PRL3抗體。所述PRL結(jié)合多肽可具有與所述單克隆抗體269、223和318相同或相似的ー種或多種性質(zhì)。為了方便之目的，所述多肽將被統(tǒng)稱為“抗-PRL抗體”。讀者有能力構(gòu)建這樣的結(jié)合分子，即這些分子可以不是(或者可以不被記述為)抗體或免疫球蛋白，但具有如本文所述的抗-PRL結(jié)合活性。因此，只要前后文允許，術(shù)語(yǔ)“抗-PRL抗體”應(yīng)被認(rèn)為包括任何分子，只要這種分子能夠結(jié)合PRL。這些分子不僅可包括抗體和免疫球蛋白，還可包括多肽、小分子，并且可通過(guò)本領(lǐng)域中已知的多種方法進(jìn)行鑒定，例如通過(guò)就PRL結(jié)合活性篩選合適的文庫(kù)進(jìn)行鑒定。所述抗-PRL抗體(包括PRL結(jié)合分子)可具有與所述單克隆抗體269、223和318相似或相同的性質(zhì)。這些相似或相同的性質(zhì)可具體包括結(jié)合性質(zhì)。所述抗-PRL抗體一般能夠結(jié)合至PRL多肽，例如PRL-I和PRL-3。因此，術(shù)語(yǔ)“抗-PRL抗體”將被認(rèn)為包括單克隆抗體269、223和318(以及它們的人源化對(duì)應(yīng)物)。還包括包含抗體269、223或318的可變區(qū)或者其變體、同系物、片段和衍生物的多肽。如果上下文允許，該術(shù)語(yǔ)還應(yīng)被認(rèn)為包括是指抗-PRL抗體的變體、同系物、片段和衍生物。PRLl和PRL3表位所述抗-PRL抗體可具有與269、223或318相同或相似的結(jié)合特異性、結(jié)合親和性和/或結(jié)合親和性。所述抗-PRL抗體可特異性地結(jié)合至抗體269結(jié)合的表位、抗體223結(jié)合的表位或抗體318結(jié)合的表位。確定具體抗體結(jié)合的表位的方法在本領(lǐng)域中是已知的。這種表位作圖方法記載于例如Hansonetal.,(2006).RespiratoryResearch,7:126中。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠形成抗體并就具體的性質(zhì)對(duì)其進(jìn)行篩選。一種這樣的方法的詳細(xì)描述顯示于實(shí)施例27中。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員將能容易鑒定可結(jié)合于與269、223和318所結(jié)合表位相同的表位的抗-PRL抗體。實(shí)施例27顯示，抗-PRLl抗體269可結(jié)合于表位TYKNMR和TLNKFI。因此，本發(fā)明人提供了諸如能結(jié)合序列TYKNMR的抗-PRLl抗體的抗-PRL抗體。本發(fā)明人還提供了諸如能夠結(jié)合TLNKFI的抗-PRLl抗體的抗-PRL抗體。所述抗-PRL抗體可以有能力同時(shí)結(jié)合這兩個(gè)序列。再者，實(shí)施例27顯示，抗-PRL3抗體可結(jié)合表位KAKFYN和HTHKTR。因此，本發(fā)明人提供了諸如能結(jié)合序列KAKFYN的抗-PRL3抗體的抗-PRL抗體。本發(fā)明人還提供了諸如能夠結(jié)合HTHKTR的抗-PRL3抗體的抗-PRL抗體。所述抗-PRL抗體可以有能力同時(shí)結(jié)合這兩個(gè)序列。所述抗-PRL抗體可包含抗體269的可變區(qū)、抗體223的可變區(qū)或抗體318的可變區(qū)，它們中的每個(gè)均在下文中詳述。它們可以在單個(gè)抗體分子中包含相同的或不同的可變區(qū)。它們可包含一個(gè)可變區(qū)，或者多于ー個(gè)可變區(qū)。因此，本發(fā)明人使得本領(lǐng)域技術(shù)人員有能力產(chǎn)生具有與抗體269、223或318有相同或相似結(jié)合反應(yīng)性的任何數(shù)目的抗體。這種抗體可包括序列完整或基本完整的抗體(即重鏈和輕鏈)，或者它們可以包括完整抗體的片段(例如Fv、F(ab')和F(ab')2片段，或者單鏈抗體(scFv))。所述抗體還可包括包含所述抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)的融合蛋白或合成蛋白，如下文中的詳述。還顯而易見(jiàn)的是，可以就所需的性質(zhì)例如降低的宿主反應(yīng)性、減少的排斥反應(yīng)等設(shè)計(jì)這些抗體。所述設(shè)計(jì)可包括“人源化”，本發(fā)明人使用該術(shù)語(yǔ)指在抗體序列例如小鼠抗體序列中納入(或替換)有ー個(gè)或多個(gè)人殘基或序列?！叭嗽椿痹诒疚纳舷挛闹邪ā扒逗稀笨贵w，其中所述抗體包含不連續(xù)部分的小鼠和人序列，例如所述可變區(qū)中的ー個(gè)或兩個(gè)都包含小鼠序列，而所述抗體分子的剰余部分(例如恒定區(qū))包含人序列。在這些嵌合抗體中，例如小鼠抗體或大鼠抗體的完整可變區(qū)可以同人恒定區(qū)一起表達(dá)。這提供了這樣ー種具有人效應(yīng)物功能的嵌合抗體，并且還降低了由鼠Fe區(qū)引起的免疫原性(HAMA)。一般而言，“嵌合抗體”可以指這樣的ー種抗體，即該抗體具有由源自鼠免疫球蛋白基因的核苷酸序列編碼的重鏈或輕鏈，以及由源自人免疫球蛋白基因的核苷酸序列編碼的重鏈或輕鏈。“人源化”還包括⑶R移植的或重構(gòu)的抗體。因此，它包括更不連續(xù)水平的設(shè)計(jì)，例如其中小鼠可變區(qū)已被突變來(lái)包括人殘基從而降低免疫原性的抗體。在這樣的抗體中，僅來(lái)自嚙齒動(dòng)物抗體V區(qū)的互補(bǔ)決定區(qū)可以與來(lái)自人V區(qū)的框架區(qū)結(jié)合。這樣的抗體與嵌合抗體相比應(yīng)該更加人源化，并且免疫原性更低。通常，所述抗-PRL抗體在許多狀態(tài)下都能夠結(jié)合至PRL多肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述結(jié)合環(huán)境包括細(xì)胞內(nèi)狀態(tài)。也就是說(shuō)，所述抗-PRL抗體能夠結(jié)合至完整細(xì)胞或非透化細(xì)胞中的PRL多肽。這樣的非透化細(xì)胞可包括這樣的細(xì)胞，即所述細(xì)胞未暴露于或者基本未暴露于透化劑例如洗滌劑(如TritonX-100)或毛地黃皂苷(digitonin)中。如本文描述的抗-PRL-3抗體能夠結(jié)合至以下情況下的PRL-3，即所述PRL-3在細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞膜內(nèi)或者被包裹在細(xì)胞中。類似地，如本文大體描述的，PRL-I多肽在細(xì)胞內(nèi)部組成的環(huán)境中可被抗-PRL-I抗體結(jié)合。所述抗-PRL-I抗體和抗-PRL3抗體具體地能夠結(jié)合至細(xì)胞內(nèi)PRL-I多肽或PRL-3多肽。所述細(xì)胞內(nèi)PRL多肽可以與一種或多種細(xì)胞結(jié)構(gòu)相關(guān)聯(lián)，所述細(xì)胞結(jié)構(gòu)例如細(xì)胞膜的內(nèi)葉、細(xì)胞器、細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)、核膜等。所述PRL多肽可位于核內(nèi)。在這其中的每種情況中，所述抗-PRL抗體能夠結(jié)合至細(xì)胞內(nèi)環(huán)境中的PRL多肽。所述抗-PRL抗體能夠以多種方式結(jié)合至細(xì)胞內(nèi)環(huán)境中的PRL多肽。所述抗-PRL抗體能夠通過(guò)質(zhì)膜。它能夠以別的方式接近所述PRL多肽的結(jié)合區(qū)，例如通過(guò)細(xì)胞攝取。它可以通過(guò)任何方式被內(nèi)化或被易位或者另外被送遞至細(xì)胞中。在另ー個(gè)實(shí)施方案中,所述結(jié)合條件包括細(xì)胞外條件。所述抗-PRL抗體因此能夠在細(xì)胞外環(huán)境中結(jié)合至它的同系PRL多肽。所述抗-PRL抗體因此能夠在細(xì)胞外結(jié)合至PRL多肽。換句話說(shuō)，本文描述的抗-PRL-I抗體能夠在PRL-I在細(xì)胞外時(shí)與之結(jié)合。類似地，如本文大體描述的，PRL-3多肽在細(xì)胞內(nèi)部之外的環(huán)境中可被抗-PRL-3抗體結(jié)合。所述抗-PRL抗體能夠結(jié)合至分泌的PRL-I多肽或PRL-3多肽(視情況而定)。所述PRL-I多肽或PRL-3多肽可包括循環(huán)的PRL-I多肽或PRL-3多肽。所述抗-PRL抗體能夠結(jié)合至外部的或外化的PRL多肽。它們可結(jié)合至血液循環(huán)中的分泌的PRL多肽。所述抗-PRL抗體及其靶標(biāo)之間的結(jié)合可以是更強(qiáng)的或更弱的、短暫的、半永久的或永久性的。所述抗-PRL抗體與所述PRL多肽的結(jié)合可發(fā)生在細(xì)胞內(nèi)。這樣的結(jié)合可使所述PRL多肽的活性失活、被抑制或降低。所述結(jié)合可中和PRL的活性。所述活性可包括由所述PRL多肽引起的或與之相關(guān)的任何生物活性。所述活性可包括與另ー種蛋白例如下游蛋白或因子的結(jié)合?？?PRL抗體與PRL多肽的結(jié)合可使下游蛋白或因子的活性失活、被抑制或降低。所述活性可包括與其他細(xì)胞的通訊，所述細(xì)胞例如循環(huán)系統(tǒng)中的轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞。因此，所述抗-PRL抗體可中和血液循環(huán)中的PRL多肽，以阻止PRL-磷酸酶與下游因子結(jié)合，或者阻止它們與循環(huán)系統(tǒng)中的其他細(xì)胞通訊。所述活性可包括生物化學(xué)活性或病原性活性。所述生物化學(xué)活性可包括催化活性。所述催化活性可包括磷酸酶活性。所述活性可包括生長(zhǎng)調(diào)節(jié)活性、癌活性、致癌活性或轉(zhuǎn)移活性。所述單克隆抗體269、223和318可用于治療人或其他動(dòng)物中的疾病。本發(fā)明人在實(shí)施例中表明這些抗-PRL抗體具有抗癌活性。具體地，實(shí)施例表明，所述抗-PRL抗體能夠阻止癌腫瘤的轉(zhuǎn)移擴(kuò)散。實(shí)施例9記載了PRL過(guò)表達(dá)腫瘤在小鼠中的生成，并提供了一個(gè)用于轉(zhuǎn)移和癌癥治療的動(dòng)物模型。實(shí)施例10-12表明，與未用抗-PRL抗體處理的動(dòng)物相比，以抗-PRL抗體處理的動(dòng)物顯示了顯著更低的轉(zhuǎn)移性肺腫瘤。具體地，所述處理動(dòng)物顯示出比未處理動(dòng)物少約90%的腫瘤。所述抗-PRL抗體能夠結(jié)合PRL多肽并阻斷其活性，盡管該P(yáng)RL多肽定位在細(xì)胞內(nèi)。本發(fā)明人的研究代表了通過(guò)使用抗各自的磷酸酶(盡管它們定位于細(xì)胞內(nèi))的單克隆抗體可有效地(約90%)阻斷轉(zhuǎn)移的首批例證。本發(fā)明人還表明，抗-PRL-3單克隆抗體可有效地阻斷表達(dá)內(nèi)源性PRL-3蛋白的人卵巣癌細(xì)胞系A(chǔ)2780的轉(zhuǎn)移瘤形成。因此，本發(fā)明人提供了抗-PRL抗體在疾病例如癌癥治療或預(yù)防中的用途。所述癌癥可包括轉(zhuǎn)移癌。所述抗-PRL抗體可被用作藥物或治療劑以治療癌癥例如已形成腫瘤的轉(zhuǎn)移。它們可被用于預(yù)防癌癥或癌癥轉(zhuǎn)移?？芍斡蚩深A(yù)防的癌癥可包括這樣的癌癥，即該癌癥與PRL蛋白的表達(dá)或過(guò)表達(dá)有夫。所述PRL蛋白可以是其家族的一個(gè)相關(guān)成員。本發(fā)明人以此表示，通過(guò)抗-PRL-I抗體例如269或具有相似或相同性質(zhì)的抗體，與PRL-I蛋白的表達(dá)或過(guò)表達(dá)相關(guān)的癌癥是可以治愈的或可以預(yù)防的。類似地，通過(guò)抗-PRL-3抗體例如223或318或者具有相似或相同性質(zhì)的抗體，與PRL-3的表達(dá)或過(guò)表達(dá)相關(guān)的癌癥是可以治愈的或可以預(yù)防的。所述癌癥可包括多種癌癥的任ー種，例如結(jié)腸直腸癌、卵巣癌、乳腺癌、肝癌、胰腺癌、前列腺癌、胃癌、肺癌、陰莖癌、子宮癌、腦癌、食道癌、膀胱癌、腎細(xì)胞癌、卵巣淋巴瘤和皮膚黑色素瘤。所述治療通?？砂▽┘?xì)胞或疑似為癌細(xì)胞的細(xì)胞與抗-PRL抗體相接觸?？蓪⑺黾?xì)胞暴露于抗-PRL-I抗體。可將它暴露于或另外暴露于抗-PRL-3抗體?？蓪⑺瑫r(shí)暴露于抗-PRL-I抗體和抗-PRL-3抗體。在這種情況下，可將所述細(xì)胞同時(shí)暴露于兩種抗體，或者依次暴露于各抗體?？蓪⒃摫┞吨貜?fù)數(shù)次?？梢允褂萌魏蔚牧炕蛳鄬?duì)量及任何的暴露時(shí)間的任何組合的抗-PRL-I抗體和抗-PRL-3抗體。因此，本發(fā)明人提供了如上述的抗-PRL-I抗體和抗-PRL-3抗體的結(jié)合物在治療疾病例如癌癥中的用途。所述細(xì)胞可是單個(gè)細(xì)胞，或者它可以在細(xì)胞塊例如癌細(xì)胞塊或腫瘤細(xì)胞塊中。所述細(xì)胞可位于生物體的體內(nèi)。所述生物體可以是已知患有癌癥的生物體，或者可能是疑似患有癌癥的生物體。所述治療可包括將所述ー種或多種抗體給予所述生物體。如上文，可給予單獨(dú)ー種抗體，或者可給予抗-PRL-I抗體和抗-PRL-3抗體的結(jié)合物。如上述，所述給予可以是同時(shí)的或序貫的。因此，所述治療可包括將抗-PRL-I抗體與抗-PRL-3抗體同時(shí)地或序貫地給予所述個(gè)體。如下文中更詳述的，所述抗-PRL抗體通常包括能夠結(jié)合至PRL分子的任何免疫球蛋白。PRL-I下文從OMM條目601585修改而來(lái)。PRL-I也被稱為蛋白酪氨酸磷酸酶，4a型，I；PTP4A1,肝再生磷酸酶1，PTP(CAAX1)。PRL-I的染色體定位在基因圖譜座位6ql2。涉及生長(zhǎng)、分化和代謝的細(xì)胞過(guò)程經(jīng)常部分地被蛋白質(zhì)磷酸化和脫磷酸化調(diào)節(jié)。蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)水解酪氨酸殘基的磷酸單酷，全都共有ー個(gè)活性位點(diǎn)基序，并被分成3類。這3類包括受體樣PTP、細(xì)胞內(nèi)PTP和雙特異性PTP，所述雙特異性PTP不但可以脫去酪氨酸的磷酸，而且可以脫去絲氨酸殘基和蘇氨酸殘基的磷酸。Diamondetal.1994，Cell.Biol.14:3752-3762描述了ー種來(lái)自再生的大鼠肝的PTP，這種PTP是第四類的一成員。該基因被命名為Prll，是許多立即早期基因中的ー種，主要在核內(nèi)表達(dá)。Prll在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)導(dǎo)致了表型的轉(zhuǎn)變，這表明它可能在腫瘤發(fā)生中起到某些作用。通過(guò)使用體外異戍ニ烯化篩查，Catesetal.,1996,CancerLett.110:49-55分離了2種編碼PRLl同系物的cDNA(被命名為PTP(CAAXl)和PTP(CAAX2)(PRL2；601584)),所述PRLl同系物被哺乳動(dòng)物的法尼基蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移酶體外法尼基化。這些PTP在上皮細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)引起培養(yǎng)細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)變和裸鼠中的腫瘤生長(zhǎng)。這些作者得出結(jié)論，PTP(CAAXl)和PTP(CAAX2)代表異戊ニ烯化的致瘤PTP的ー個(gè)新類。Pengetal.1998，J.Biol.Chem.273:17286-17295報(bào)道，人PTP(CAAXl)基因(即PRLl)包含6個(gè)外顯子并含有2個(gè)啟動(dòng)子。預(yù)測(cè)的小鼠、大鼠和人PRLl蛋白是相同的。Zengetal.1998,Biochem.Biophys.Res.Commun.244:42ト427確定，人PRLl和PRL2蛋白具有87%的氨基酸序列同一性。Pengetal.(1998)通過(guò)FISH將PRLl基因定位至6ql2。如果使用術(shù)語(yǔ)“PRL-1”，那么它將被認(rèn)為是指任何的PRL-I序列，包括PRL-I蛋白或PRL-I核酸，以及它們的任何片段、變體同系物、衍生物或變體。PRL-I的性質(zhì)和活性被記載于本文中，例如在參考文獻(xiàn)中。[從OMM修改的內(nèi)容結(jié)束]小鼠和人PRL-1蛋白被記載于Zengetal(1998),見(jiàn)上文。PRL-I序列本文描述的方法和組合物利用了PRL-I多肽，所述PRL-I多肽在下文中詳述。如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“PRL-1”意欲指如下表Dl中列出的序列。Unigene描述—NM003463,3人蛋白酪氨酸磚酸酶IVA型，成員I(PTP4A1)mRNACR602427.1人(Homosapiens)HeLa細(xì)胞Cot25-正態(tài)化的全長(zhǎng)cDNA克隆CS0DK012YJ03CR599216.1人神經(jīng)母細(xì)胞瘤的全長(zhǎng)cDNA克隆CL0BB007ZF05CE596545.1人HeLa細(xì)胞Cot25-正態(tài)化的全長(zhǎng)eDNA克隆CSODKOIiYMWCR749458.1人mRNA;eDNADKFZp779M0721(來(lái)自克隆DKFZp779M0721)BC045571.1人蛋白酪氨酸嶙酸酶IVA型，成員I,mRNA(cDNA克隆MGC:S732iIMAGE:4826233)，全長(zhǎng)cdsAJ420505.1人mRNA全長(zhǎng)插入eDNA克隆EUROIMAGE2096405AK312526.1JAcDNA,FLJ9289權(quán)利要求1.抗PRL-I的抗體或抗PRL-3的抗體在制備用于治療或預(yù)防癌癥或癌癥轉(zhuǎn)移的藥物中的用途，所述治療或預(yù)防包括以所述抗體靶向細(xì)胞內(nèi)PRL-I或細(xì)胞內(nèi)PRL-3以消除癌癥細(xì)胞和癌癥轉(zhuǎn)移。2.權(quán)利要求I的用途，其中所述抗體選自(a)可結(jié)合PRL-I的抗體，其包含含有SEQIDNO:2的重鏈可變區(qū)序列及含有SEQIDNO:4的輕鏈可變區(qū)序列；(b)可結(jié)合PRL-3的抗體，其包含含有SEQIDNO:6的重鏈可變區(qū)序列及含有SEQIDNO:8的輕鏈可變區(qū)序列；(c)可結(jié)合PRL-3的抗體，其包含含有SEQIDNO:10的重鏈可變區(qū)序列及含有SEQIDNO:12的輕鏈可變區(qū)序列；(d)能夠結(jié)合至細(xì)胞內(nèi)PRL-I多肽或PRL-3多肽的(a)、(b)或(c)的抗原結(jié)合片段；以及Ce)包含這樣的序列的抗體，所述序列與(a)、(b)或(c)至少90%相同，并且能夠結(jié)合至細(xì)胞內(nèi)PRL-I多肽或PRL-3多肽。3.權(quán)利要求I或2的用途，其中所述抗體結(jié)合并抑制細(xì)胞內(nèi)PRL-I或PRL-3的蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)活性。4.前述權(quán)利要求任ー項(xiàng)的用途，其中所述抗體包括單克隆抗體或人源化的單克隆抗體。5.抗PRL-I的抗體或抗PRL-3的抗體在制備藥物中的用途，所述藥物用于治療或預(yù)防癌癥或癌癥轉(zhuǎn)移的方法中。6.編碼抗PRL-I的抗體或抗PRL-3的抗體的核酸在制備用于治療或預(yù)防癌癥或癌癥轉(zhuǎn)移的藥物中的用途，所述治療或預(yù)防包括以所述核酸編碼的抗體靶向細(xì)胞內(nèi)PRL-I或細(xì)胞內(nèi)PRL-3以消除癌癥細(xì)胞和癌癥轉(zhuǎn)移。7.權(quán)利要求6的用途，其中所述核酸選自Ca)編碼權(quán)利要求2的抗體(a)的核酸，并且所述核酸包括序列SEQIDNO:I和序列SEQIDNO:3；(b)編碼權(quán)利要求2的抗體(b)的核酸，并且所述核酸包括序列SEQIDNO:5和序列SEQIDNO:7;以及(c)編碼權(quán)利要求2的抗體(c)的核酸，并且所述核酸包括序列SEQIDNO:9和序列SEQIDNO:11。8.前述權(quán)利要求任ー項(xiàng)的用途，其中所述治療或預(yù)防包括將治療有效量的所述抗體給予患有或疑似患有癌癥的個(gè)體。9.前述權(quán)利要求任ー項(xiàng)的用途，其中所述癌癥包括表達(dá)PRL-I或PRL-3的癌癥、轉(zhuǎn)移癌、結(jié)腸直腸癌、卵巣癌、乳腺癌、肝癌、胰腺癌、前列腺癌、胃癌、肺癌、陰莖癌、子宮癌、腦癌、食道癌、膀胱癌、腎細(xì)胞癌、卵巢淋巴瘤和皮膚黑色素瘤。全文摘要本發(fā)明人提供了一種能夠結(jié)合至細(xì)胞內(nèi)PRL-1多肽或PRL-3多肽的抗體，其中所述抗體能夠結(jié)合至與抗體269、抗體223或抗體318結(jié)合的表位。這樣的抗-PRL抗體能夠結(jié)合至細(xì)胞內(nèi)PRL-1或PRL-3。它們可以適合被用作抗癌癥或癌癥轉(zhuǎn)移的治療劑，或者在臨床診斷中來(lái)鑒定PRL-3或PRL-1陽(yáng)性的患者。文檔編號(hào)A61K39/395GK102847148SQ201210272198公開(kāi)日2013年1月2日申請(qǐng)日期2008年5月3日優(yōu)先權(quán)日2007年5月3日發(fā)明者曾琦申請(qǐng)人:新加坡科技研究局