專利名稱：與萬古霉素形成抗菌增效包合物的組分和制備方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及萬古霉素vancomycin與β -環(huán)糊精衍生物6_[ (L-苯丙氨酰)-胺基]-β -環(huán)糊精 Per-6-[ (phenylalanyl) -amino] -b-cyclodextrin 鹽酸鹽形成包合物的制備方法、化學(xué)構(gòu)象分析、抗菌增效效果及其增效機(jī)理，以及這種萬古霉素包合物抗菌增效的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
萬古霉素是目前臨床上對付耐甲氧西林金黃色葡萄球(methici 11 in-resistantStaphylococcu Saarew1S,簡稱MRSA)的首選藥物,它屬于結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜的糖肽類抗生素。萬古霉素的抗菌作用機(jī)理已被證實(shí)是通過形成氫鍵與細(xì)菌的細(xì)胞壁NAM/NAG肽類上C-終端上的L-Lys-D-Ala-D-Ala五個點(diǎn)位相結(jié)合，從而抑制細(xì)菌的細(xì)胞壁的合成而達(dá)到抗菌作用。但隨著抗生素的濫用，臨床上萬古霉素對MRSA的敏感度開有較快下降的趨勢。這現(xiàn)象在我國尤為嚴(yán)重。如何保持萬古霉素對MRSA的敏感度，延長它在臨床上的使用周期將是抗生素耐藥性問題的一種挑戰(zhàn)。
環(huán)糊精是一類天然環(huán)低聚糖化合物，常見的有α、β及Υ-環(huán)糊精。其中β-環(huán)糊精最為常見，它是由七個a-D-葡萄糖單元經(jīng)I，4-糖苷鍵環(huán)狀連接而成。與其它環(huán)糊精一樣，其分子結(jié)構(gòu)中含有一個親水性外表面和一個疏水性內(nèi)空洞，表現(xiàn)為一個寬圓邊為親水性，和一個窄圓邊則呈現(xiàn)疏水性。這一特性使其與許多化合物能形成內(nèi)含復(fù)合物即包合物。因此，它與客體化合物即形成包合物的能力、包合物的性質(zhì)及機(jī)能取決于寬圓邊的親水性及窄圓邊的取代基的性能。環(huán)糊精與客體化合物并非是由分子中原子間的共價鍵形成包合物，而是分子間的空間作用形成的。因此包合物具有客體化合物原有的一切功能。NMR即核磁共振圖譜是研究溶液中包合物的最直接和最有效的工具和方法，尤其是1H NMR即質(zhì)子核磁共振圖譜，通過環(huán)糊精與客體化合物形成包合物前后其結(jié)構(gòu)中質(zhì)子的化學(xué)位移的微小變化，準(zhǔn)確地解析包合物的形成及其結(jié)構(gòu)包括空間結(jié)構(gòu)，得到客體化合物在包合物中的空間化學(xué)環(huán)境信息包括其化學(xué)結(jié)構(gòu)的構(gòu)象。本發(fā)明的目的是依據(jù)β -環(huán)糊精的結(jié)構(gòu)特征及萬古霉素抗菌活性的生化作用機(jī)理，選用b-環(huán)糊精衍生物6-[ (L-苯丙氨酰)-胺基]-β -環(huán)糊精(I)作為主體化合物，與客體化合物萬古霉素形成包合物的制備方法以及測定包合物的體外抗菌增效效果。利用1HNMR圖譜及包合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)構(gòu)象分析，并結(jié)合萬古霉素抗菌活性的生化作用機(jī)理，對萬古霉素與6-[ (L-苯丙氨酰)-胺基]_β -環(huán)糊精(I)形成的包合物的抗菌增效機(jī)理進(jìn)行闡述。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在提供一種能使萬古霉素抗菌活性增強(qiáng)的包合物的制備方法。這種包合物是由一種β_環(huán)糊精衍生物6_[ (L-苯丙氨酸)-胺基]-β -環(huán)糊精(I)作為主體化合物與客體化合物萬古霉素形成的。該包合物體外抗菌活性實(shí)驗(yàn)顯示，萬古霉素在形成包合物后對多種細(xì)菌菌株尤其是耐甲氧西林金黃色葡萄球即MRSA的抗菌活性有較強(qiáng)的增效效果。利用1H NMR實(shí)驗(yàn)，通過對包合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)構(gòu)象分析，并結(jié)合萬古霉素抗菌活性的原生化作用機(jī)理，闡明萬古霉素與6-[ (L-苯丙氨酰)-胺基]_β -環(huán)糊精(I)形成的包合物的抗菌增效機(jī)理。
本發(fā)明人從事β-環(huán)糊精衍生物制備設(shè)計及其與抗生素形成包合物的研究多年。下面就用于本發(fā)明的萬古霉素與6-[ (L-苯丙氨酰)-胺基]_β -環(huán)糊精鹽酸鹽(I)包合物的制備方法、萬古霉素在形成包合物后的體外抗菌活性增效效果、包合物的1H NMR數(shù)據(jù)以及化學(xué)結(jié)構(gòu)構(gòu)象分析并對包合物的抗菌增效機(jī)理進(jìn)行闡述。
I.萬古霉素與6-[ (L-苯丙氨酰)-胺基]-β-環(huán)糊精(I)形成包合物的制 備方法
I.I.制備方法一
萬古霉素和6_[(L_苯丙氨酰)-胺基]-β -環(huán)糊精(I)按組分摩爾比例O. 5 2. O分別溶于水，二者水溶液混合均勻，混合液用冷凍干燥方法干燥，即得萬古霉素和6-[ (L-苯丙氨酰)-胺基]-β -環(huán)糊精(I)凍干粉包合物。I. 2.制備方法二
萬古霉素和6_[ (L-苯丙氨酰)-胺基]-β -環(huán)糊精(I)分別用冷凍干燥方法制成凍干粉。二者的凍干粉分別用O. 9%生理鹽水或水溶解，二者溶液按組分摩爾比例O. 5 2. O混合均勻，即得萬古霉素和6-[ (L-苯丙氨酰)-胺基]-β -環(huán)糊精(I)的溶液包合物。I. 3.制備方法三
萬古霉素和6_[ (L-苯丙氨酰)-胺基]-β -環(huán)糊精(I)分別用冷凍干燥方法制成凍干粉。二者之一的凍干粉用O. 9%生理鹽水或水溶解，此溶液按組分摩爾比例O. 5 2. O溶解另一凍干粉，混合均勻，即得萬古霉素和6-[ (L-苯丙氨酰)_胺基]_β -環(huán)糊精(I)的溶液包合物。2.萬古霉素與6-[ (L-苯丙氨酰)-胺基]-β-環(huán)糊精(I)包合物的體外抗菌活性增效效果
按體外抗菌活性標(biāo)準(zhǔn)測定方法分別測試單獨(dú)的萬古霉素和6-[(L-苯丙氨酰)-胺基]-β_環(huán)糊精鹽酸鹽(I)及以本發(fā)明制備方法二制備的萬古霉素和6-[(L-苯丙氨酰)-胺基]-β_環(huán)糊精鹽酸鹽(I)的溶液包合物對九種臨床上常見的細(xì)菌菌株的抑菌活性。通過分別比較單獨(dú)的萬古霉素和6-[ (L-苯丙氨酰)-胺基]_β -環(huán)糊精鹽酸鹽(I)及其包合物的體外抗菌活性，表明6-[ (L-苯丙氨酰)-胺基]_β -環(huán)糊精鹽酸鹽(I)本身并無抑菌活性，但其與萬古霉素形成的包合物則使萬古霉素的抗菌活性有很強(qiáng)的增效效果，尤其是對耐藥菌株MRSA的最低抑菌濃度MIC有4 8倍的增效作用。3. 6-[ (L-苯丙氨酰)-胺基]-β -環(huán)糊精鹽酸鹽(I)與萬古霉素包合物的形成、化學(xué)構(gòu)象分析及其抗菌增效機(jī)理
通過比較6_[ (L-苯丙氨酰)-胺基]-β -環(huán)糊精鹽酸鹽(I)和萬古霉素溶液在形成包合物前后其分子中各質(zhì)子在1H NMR譜中的化學(xué)位移變化，確認(rèn)其包合物的形成以及包合物的化學(xué)構(gòu)象。本發(fā)明的1H NMR數(shù)據(jù)表明6-[ (L-苯丙氨酰)-胺基]-β-環(huán)糊精鹽酸鹽(I)和萬古霉素溶液在形成包合物前后其分子中大多數(shù)質(zhì)子有Λ δ O. 2 O. 6 ppm的化學(xué)位移變化，認(rèn)定其包合物的形成。同時，經(jīng)過室溫12小時后，1H NMR顯示包合物在O. 9%NaCl溶液中仍然很穩(wěn)定。經(jīng)對其包合物的化學(xué)構(gòu)象分析，并結(jié)合萬古霉素抗菌活性的原生化作用機(jī)理，6-[ (L-苯丙氨酰)-胺基]-β-環(huán)糊精(I)是通過萬古霉素與細(xì)菌的細(xì)胞壁NAM/NAG肽類上C-終端上的L-Lys-D-Ala-D-Ala五個相結(jié)合點(diǎn)位的背面與萬古霉素形成包合物，這一結(jié)構(gòu)構(gòu)象大大地利于萬古霉素與上述五個點(diǎn)位相結(jié)合，從而更有利于抑制細(xì)菌的細(xì)胞壁的合成而達(dá)到抗菌增效作用。


圖I是化合物I體外對萬古霉素抗菌活性增效作用。圖2 是1H chemical shifts for vancomycin alone and with I。
圖 3 是1H Chemical shifts for I alone and with vancomycin。
圖4是萬古霉素與化合物I的包合物模型。
圖5是萬古霉素增效機(jī)理模型。
具體實(shí)施例方式 下面結(jié)合實(shí)施例描述本發(fā)明的實(shí)現(xiàn)方案。
實(shí)施例I:萬古霉素、6_[ (L-苯丙氨酰)-胺基]_β -環(huán)糊精鹽酸鹽(I)及其包合物的體外抗菌活性測試
按體外抗菌活性標(biāo)準(zhǔn)測試方法分別測試6-[ (L-苯丙氨酰)-胺基]_β -環(huán)糊精鹽酸鹽(I)、陽性對照藥Linezolid、萬古霉素、I :1摩爾溶度的萬古霉素6-[(L_苯丙氨酰)-胺基]-β -環(huán)糊精鹽酸鹽(I)對九種臨床上常見的細(xì)菌菌株的抑菌活性，其結(jié)果見圖
Io
實(shí)施例2 6-[(L-苯丙氨酰)_胺基]-β-環(huán)糊精鹽酸鹽(I)、萬古霉素以及包合物的1H NMR圖譜、化學(xué)構(gòu)象分析及其抗菌增效機(jī)理
6-[ (L-苯丙氨酰)-胺基]-β -環(huán)糊精鹽酸鹽(I)和萬古霉素分別用O. 9%的生理鹽重水直接配制，濃度均為O. 016摩爾，分別供1H NMR測定；化合物I與萬古霉素以I :1的摩爾比例用O. 9%的生理鹽重水配制，濃度均為O. 016摩爾，混合后一小時進(jìn)行1H NMR測定。測定結(jié)果見圖2和3。6-[ (L-苯丙氨酰)-胺基]-β-環(huán)糊精鹽酸鹽(I)和萬古霉素形成的包合物、包合物的化學(xué)構(gòu)象分析及其抗菌增效機(jī)理分別見圖4、圖5。
權(quán)利要求
1.萬古霉素抗菌增效包合物的制備方法一 萬古霉素和6-[ (L-苯丙氨酰)-胺基]-0 -環(huán)糊精按組分摩爾比例0. 5 2. 0分別溶于水，二者水溶液混合均勻，混合液用冷凍干燥方法干燥，即得萬古霉素和6-[ (L-苯丙氨酰)-胺基]-環(huán)糊精凍干粉包合物。
2.萬古霉素抗菌增效包合物的制備方法二 萬古霉素和6_[(L_苯丙氨酰)-胺基]-0 -環(huán)糊精分別用0. 9%生理鹽水或水溶解，二者溶液按組分摩爾比例0. 5 2.0混合均勻，即得萬古霉素和6-[ (L-苯丙氨酰)-胺基]-P -環(huán)糊精的溶液包合物。
3.萬古霉素抗菌增效包合物的制備方法三 萬古霉素和6-[ (L-苯丙氨酰)-胺基]-環(huán)糊精分別用冷凍干燥方法制成凍干粉。
4.二者之一的凍干粉用0. 9%生理鹽水或水溶解，此溶液按組分摩爾比例0. 5 2. 0溶解另一凍干粉，混合均勻，即得萬古霉素和6-[ (L-苯丙氨酰)-胺基]-環(huán)糊精鹽酸鹽的溶液包合物。
5.由上述第I至第3項(xiàng)制成的制劑包括供注射、口服、外用等抗菌增效的應(yīng)用。
6.其它形式的萬古霉素和6-[(L-苯丙氨酰)-胺基]-￠-環(huán)糊精合用用于抗菌活性增效的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明旨在提供一種能使萬古霉素vancomycin抗菌活性增強(qiáng)的包合物的組分和制備方法。這種包合物是由一種β-環(huán)糊精衍生物6-[(L-苯丙氨酰)-胺基]-β-環(huán)糊精作為主體化合物與客體化合物萬古霉素形成的。該包合物體外抗菌活性實(shí)驗(yàn)顯示，萬古霉素在形成包合物后對多種細(xì)菌菌株尤其是耐甲氧西林金黃色葡萄球即MRSA的抗菌活性有4～8倍的最低抑菌溶度的增效效果。利用1HNMR實(shí)驗(yàn)，通過對包合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)構(gòu)象分析，并結(jié)合萬古霉素抗菌活性的原生化作用機(jī)理，闡明萬古霉素與6-[(L-苯丙氨酰)-胺基]-β-環(huán)糊精形成的包合物的抗菌增效機(jī)理。
本發(fā)明這種使萬古霉素抗菌活性增強(qiáng)的包合物可應(yīng)用于對萬古霉素不敏感或抑菌活性不強(qiáng)的病菌的抗菌治療。也可開發(fā)成萬古霉素新型增效劑，與萬古霉素組成新藥。
文檔編號A61K9/19GK102755629SQ20121027290
公開日2012年10月31日 申請日期2012年8月2日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月2日
發(fā)明者鄧京振 申請人:上海瑞創(chuàng)醫(yī)藥科技有限公司