專利名稱：Toll 樣受體調(diào)節(jié)性寡核苷酸及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了含CT重復(fù)序列[(CT) n]或CCT重復(fù)序列[(CCT) n]或TC重復(fù)序列[(TC)n]，或富含CT或CCT或TC的Toll樣受體調(diào)節(jié)性寡核苷酸及其功能性類似物，以及應(yīng)用該寡核苷酸及其功能性類似物 在用于預(yù)防和治療免疫介導(dǎo)的疾病中的用途。免疫介導(dǎo)的疾病包括自身免疫性疾病、移植排斥、超敏反應(yīng)、微生物過強刺激宿主免疫系統(tǒng)引起的疾病和Toll樣受體(TLR)激活相關(guān)性疾病。
背景技術(shù)：
免疫系統(tǒng)可保護機體免受細菌、寄生蟲、真菌、病毒的感染，并可清除腫瘤細胞。在一些情況下，免疫系統(tǒng)發(fā)動的免疫反應(yīng)是有害的，可引起免疫介導(dǎo)的疾病。這些免疫介導(dǎo)的疾病包括但不限于自身免疫性疾病、移植排斥、超敏反應(yīng)、微生物過強刺激宿主免疫系統(tǒng)引起的疾病和TOLL樣受體激活相關(guān)性疾病。自身免疫性疾病由針對內(nèi)源性抗原的獲得性(特異性)免疫反應(yīng)和天然免疫反應(yīng)所引起。來源于細菌、寄生蟲、真菌、病毒的外源物質(zhì)可以模擬自身蛋白，刺激免疫系統(tǒng)發(fā)生針對自身細胞和組織的免疫反應(yīng)，從而引起自身免疫性疾病。移植排斥是移植受體(宿主)對移植器官或組織的免疫反應(yīng)。一個接受同種移植物(如腎、胰腺、心臟、肺、骨髓、角膜和皮膚)的受者，可以產(chǎn)生針對移植物的免疫應(yīng)答。超敏反應(yīng)是對身體有害的過強的免疫應(yīng)答，可導(dǎo)致細胞組織破壞甚至機體的死亡。一些微生物感染機體后,可以刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生過強的免疫反應(yīng),引起微生物過強刺激宿主免疫系統(tǒng)引起的疾病，如在禽流感病毒H5N1或SARS冠狀病毒感染情況下，針對感染病毒的過強免疫反應(yīng)可能成為感染者的致命因素。此免疫反應(yīng)的特點是在被感染的個體產(chǎn)生了大量的細胞因子。這個現(xiàn)象被稱為超量細胞因子血癥(hypercytokinemia)或細胞因子風暴。TOLL樣受體激活相關(guān)性疾病是由于激活Toll樣受體(Toll like receptors)而引起的疾病。Toll樣受體是一個識別微生物來源分子結(jié)構(gòu)(病原體相關(guān)分子模型)的受體家族。表達Toll樣受體的免疫細胞通過結(jié)合這種病原體相關(guān)分子模型而被激活。在人類，Toll樣受體家族共有11個成員。Toll樣受體可以識別很多病原微生物來源的產(chǎn)物。TLR4可以識別細菌脂多糖(LPS) ；TLR2和TLR6的雙體可以識別脂磷壁酸和雙酰脂肽；TLR2和TLRl的雙體可以識別三酰脂肽；TLR9可以識別合成的或來源于細菌和病毒含CpG寡核苷酸；TLR5可以識別細菌鞭毛蛋白；TLR2和TLR6的雙體還可以識別酵母多糖；TLR4可以識別呼吸道合胞病毒F蛋白；TLR3可以識別聚肌苷酸胞嘧啶核苷酸、合成的或來源于病毒的雙鏈RNA ；TLR7和TLR8可以識別單鏈病毒RNA ;TLR4可以識別原蟲產(chǎn)物，如GPI錨定蛋白；TLR4還可以識別炎癥組織的產(chǎn)物，如 HSP60 和纖維原片段(Foo Y. Liew, et al. Negative regulation of tolllike receptor mediated immune responses Nature Reviews Immunology. Vol5, June2005,446-458)。兩種免疫調(diào)節(jié)藥物R-837和R-848是TLR7和TLR8的配體。近年的研究表明，TLRs的激活和敗血癥、擴張性心肌病、糖尿病系統(tǒng)性紅斑狼瘡、實驗性自身免疫性腦脊髓膜炎、動脈粥樣硬化、哮喘、慢性阻礙性肺疾病和器官衰竭的發(fā)生有關(guān)(Foo Y. Liew, etal. Negative regulation of toll like receptor mediated immune responses. NatureReview Immunology, Vol5，2005，446-458)。綜上所述，為了預(yù)防或治療免疫介導(dǎo)的疾病，有必要研制能夠抑制傷害性免疫反應(yīng)的制劑。本發(fā)明發(fā)明提供了含CT重復(fù)序列[(CT)n]或CCT重復(fù)序列[(CCT)n]或TC重復(fù)序列[(TC)n]，或富含CT或CCT或TC的寡核苷酸及其功能性類似物，以及應(yīng)用該寡核苷酸在預(yù)防和治療免疫介導(dǎo)的疾病中的用途。本發(fā)明提供的寡核苷酸可以抑制由TLR9激動劑激活的免疫反應(yīng)。已經(jīng)有研究者證實，TLR9激動劑可以激活天然免疫反應(yīng)和獲得性免疫反應(yīng)(Arthur M. Krieg. Therapeutic potential of Toll-like receptor 9 activation.Nature Reviews Drug Discovery, Vol5. June 2006,471-484)。在人類的免疫系統(tǒng)中，B細胞和漿細胞樣樹突細胞(pDCs)表 達TLR9。含有CpG的寡核苷酸(CpG 0DN)是TLR9的激動劑(D. M. Klinman, Immunotherapeutic uses of CpG oligodeoxynucleotides,428 Nat. Rev.，Immunol. 4 (2004) 249-258)。根據(jù)功能特性，含有CpG的寡核苷酸分為3 個類型(Tomoki Ito, et al. Specialization, kinetics, and repertoire of type Iinterferon responses by human plasmacytoid predendritic cells. Blood, 15 March2006，Voll07, Num 6 :2423-2431)。A型含CpG寡核苷酸可以激活人漿細胞樣樹突狀細胞產(chǎn)生大量的I型干擾素(IFN-a/ ^ )，強烈地激活NK細胞。B型含CpG寡核苷酸主要激活B細胞，刺激B細胞增值和抗體分泌。C型含CpG的寡核苷酸同時具有A型和B型含CpG寡核苷酸的功能。CpG2216(5，gggggacgatcgtcgggggg3，) (Dominique De Wit, et al. Bloodplasmacytoid dendritic cell responses to CpG oligonucleotides are impaired inhuman newborns. Blood, I Feb,2004, Vol 103，Num 3 :1030-103)，CpG2006(5，-tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt-3> ) (Dominique De Wit, et al. Blood plasmacytoid dendritic cellresponses to CpG oligodeoxynucleotides are impaired in human newborns. Blood,IFeb,2004,Vol 103,Num 3 :1030-103)and CpG C274(5’_tcgtcgaacgttcgagatgat3’)(OmarDuramad, et al. Inhibitors of TLR-9 Act on Multiple Cell Subsets in Mouse andMan In Vitro and Prevent Death In Vivo from Systemic Inflammation. The Journalof Immunology, 2005，174 :5193-5200)分別是典型的A型、B型和C型的含CpG的寡核苷酸。CpG 302(5'-tcg tcg ggt gcg acg tcg cag ggg gg_3')也是一種 C 型的含 CpG 的寡核苷酸(Musheng Bao, et al. Clinical Immunology. 2006. 118 :180-187) TLR9 激動劑如CpG 2216、CpG 2006、CpG C274或CpG 302可以被胞吞到細胞間隙而激活TLR9。在漿細胞樣樹突狀細胞中，TLR9激活可以啟始一個快速的天然免疫反應(yīng)，其特征是分泌大量的促炎因子如IL-6，腫瘤壞死因子-a (TNFa) ,I型干擾素(IFN_a/P )和干擾素誘導(dǎo)的趨化因子。通過干擾素依賴和干擾素非依賴兩條通路，此漿細胞樣樹突細胞可以繼發(fā)激活天然免疫細胞如NK細胞、單核細胞和嗜中性粒細胞。通過TLR9的刺激，B細胞增強了對抗原刺激的敏感性，可以有效地分化成抗體分泌細胞。因此，TLR9的刺激有助于獲得性免疫應(yīng)答，特別是體液免疫應(yīng)答。通過TLR9激活的漿細胞樣樹突狀細胞可分泌IFNa ,MlFNa可使?jié){細胞樣樹突細胞遷移聚集到淋巴結(jié)和其他周圍淋巴組織。在這些部位，此漿細胞樣樹突細胞可以激活未致敏的T細胞和記憶T細胞，向CD8+細胞毒性T細胞交叉提呈可溶性抗原，促進THl型的⑶4和⑶8 T細胞反應(yīng)。以上分析清楚表明，拮抗CpG 2006、CpG C274、CpG2216或CpG 302活性的制劑可以通過抑制天然免疫和獲得性免疫來預(yù)防和治療免疫紊亂性疾病。因為，CpG2006、CpGC274、CpG 2216或CpG 302均為Toll樣受體(TLR)的激活劑，本發(fā)明提供的能拮抗CpG2006或CpG C274或CpG2216或CpG 302激活TLR功能的寡核苷酸被稱為Toll樣受體調(diào)節(jié)性寡核苷酸。

發(fā)明內(nèi)容
I、本發(fā)明提供了含CT重復(fù)序列[(CT)n]或CCT重復(fù)序列[(CCT)n]或TC重復(fù)序列[(TC)n]，或富含CT或CCT或TC的Toll樣受體調(diào)節(jié)性寡核苷酸，該寡核苷酸可以被化學修飾，此修飾包括但不限于磷酸骨架修飾，如部分地或全部地磷硫?；蚨虼姿狨バ揎?。經(jīng)化學修飾的由本發(fā)明提供的寡核苷酸是相對應(yīng)的寡核苷酸的功能性類似物。2、本發(fā)明提供了應(yīng)用該寡核苷酸或其 功能性類似物在預(yù)防或治療免疫介導(dǎo)的疾病中的用途。治療的個體包括但不限于人類。免疫介導(dǎo)的疾病包括自身免疫性疾病、移植排斥、超敏反應(yīng)、微生物過強刺激宿主免疫系統(tǒng)引起的疾病和TOLL樣受體激活相關(guān)性疾病。3、本發(fā)明提供了應(yīng)用該寡核苷酸或其功能性類似物通過抑制免疫反應(yīng)進而預(yù)防或治療免疫介導(dǎo)的疾病的使用方法。4、在應(yīng)用本發(fā)明提供的寡核苷酸或其功能性類似物預(yù)防和治療免疫介導(dǎo)的疾病時，可將該寡核苷酸或其功能性類似物用藥物性載體承載后應(yīng)用。本發(fā)明提供的寡核苷酸或其功能性類似物可經(jīng)腸道、非腸道(如皮下注射、肌肉注射和靜脈注射等)、局部和呼吸道途徑應(yīng)用。5、本發(fā)明提供的寡核苷酸或其功能性類似物作為主要成分可形成各種藥物組合物或劑型。包含有效治療劑量的該類寡核苷酸或其功能性類似物的這些藥物組合物可被用來預(yù)防或治療免疫介導(dǎo)的疾病。6、在預(yù)防和治療免疫介導(dǎo)的疾病時，本發(fā)明提供的有效治療劑量的寡核苷酸或其功能性類似物可以單獨應(yīng)用、或自身組合應(yīng)用、或和其他一種或幾種活性物質(zhì)聯(lián)合應(yīng)用。7、在預(yù)防和治療免疫介導(dǎo)的疾病時，本發(fā)明提供的有效治療劑量的該類寡核苷酸或其功能性類似物可由遞送載體承載應(yīng)用。8、在預(yù)防和治療免疫介導(dǎo)的疾病時，本發(fā)明提供的有效治療劑量的該類寡核苷酸或其功能性類似物可被用于處理自身的免疫細胞，然后將此細胞做自體回輸應(yīng)用。


圖I描述了人外周血單個核細胞在CpG2006和CpG274刺激下增殖時，寡核苷酸SAT05表現(xiàn)的抑制作用。在存在各種劑量SAT05、A151及對照寡核苷酸的條件下，應(yīng)用CpG 2006(1 u g/ml)或CpG C274(l u g/ml)刺激人外周血單個核細胞48小時，之后和[3H]胸腺嘧啶共孵育16小時。細胞增殖的程度用cpm±SD來表示。實驗結(jié)果表明，和對照寡核苷酸相比，SAT05可以抑制由CpG 2006或CpG C274刺激的人外周血單個核細胞增殖。該實驗重復(fù)4次均得到類似的結(jié)果。下面是一些實驗中應(yīng)用的寡核苷酸序列CpG 2006(5，-tcg tcg ttt tgt cgt tttg tcg tt_3，)CpG C274(5， -tcgtcgaacgttcgagatgat 3，)SAT05 (51 -ctctctctctctctctctct-31 )，也被命名為 SEQ ID NO :1
A151(5' -ttagggttagggttagggttaggg-3，)Control ODN(對照寡核苷酸)(5' -gttagagattaggca-3’)圖2描述了人外周血單個核細胞在CpG2006和CpG274刺激下增殖時，寡核苷酸SAT05f表現(xiàn)的抑制作用。在存在各種劑量SAT05f、A151及對照寡核苷酸的條件下，應(yīng)用CpG 2006(1 u g/ml)或CpG C274(lug/ml)刺激人外周血單個 核細胞48小時，之后和[3H]胸腺嘧啶共孵育16小時。細胞增殖的程度用cpm±SD表示。實驗結(jié)果表明，和對照寡核苷酸相比，SAT05f可以抑制由CpG 2006 or CpG C274刺激下的人外周血單個核細胞增殖。該實驗重復(fù)4次均得到類似的結(jié)果。下面是一些實驗中應(yīng)用的寡核苷酸序列CpG2006(5，-tcg tcg ttt tgt cgt tttg tcg tt_3，)CpG C274(5， -tcgtcgaacgttcgagatgat 3，)SAT05f (51 _cctcctcctcctcctcctcctcct_3，)，被命名為 SEQ ID NO :2A151 (5; -ttagggttagggttagggttaggg-3’)Control ODN(對照寡核苷酸)(5' -gttagagattaggca-3J )圖3描繪了 SAT05可以有效抑制在CpG 2216刺激下人外周血單個核細胞抗病毒物質(zhì)的產(chǎn)生。在存在各種劑量SAT05、A151及對照寡核苷酸的條件下，用CpG2216刺激人外周血單個核細胞獲得培養(yǎng)上清，觀察此上清保護Vero E6抵抗10XTI⑶50 VSV病毒攻擊的作用。圖中的各種符號代表了 OD值土SD。結(jié)果表明，SAT05可以抑制在CpG 2216刺激下人外周血單個核細胞抗病毒物質(zhì)的產(chǎn)生。下面是實驗中應(yīng)用的寡核苷酸序列CpG2216(5， -gggggacgatcgtcgggggg-3，)SAT05 (51 -ctctctctctctctctctct-31 ),被命名為 SEQ ID NO: IA151 (5; -ttagggttagggttagggttaggg-3，)Control ODN(對照寡核苷酸)(5' -gttagagattaggca-3 ‘)圖4描繪了 SAT05f可以有效抑制在CpG 274刺激下人外周血單個核細胞抗病毒物質(zhì)的產(chǎn)生。在存在各種劑量SAT05f、A151及對照寡核苷酸的條件下，用CpG274刺激人外周血單個核細胞獲得培養(yǎng)上清，觀察此上清保護Veix) E6抵抗10\1'1^50￥3￥病毒攻擊的作用。圖中的各種符號代表了 OD值土SD。結(jié)果表明，SAT05f可以強烈抑制在CpG 274刺激下人外周血單個核細胞抗病毒物質(zhì)的產(chǎn)生。下面是一些實驗中應(yīng)用的寡核苷酸序列CpG C274(5， -tcgtcgaacgttcgagatgat-3，)SAT05f (51 _cctcctcctcctcctcctcctcct_3，)，被命名為 SEQ ID NO :2A151 (5' -ttagggttagggttagggttaggg-3，)Control ODN :(5' -gttagagattaggca-3 ‘)圖5描述了人外周血單個核細胞在CpG274刺激下增殖時，富含CT序列或CT重復(fù)序列或CCT重復(fù)序列寡核苷酸對其增殖的抑制作用。
在存在各種寡核苷酸(30 ii g/ml)的條件下,應(yīng)用CpG C274(5 U g/ml)刺激人外周血單個核細胞48小時，之后和[3H]胸腺嘧啶共孵育16小時。細胞增殖的程度用cpm±SD來表示?！凹毎贝砦唇?jīng)CpG274刺激的人外周血單個核細胞組?！癙BS”代表單獨應(yīng)用CpGC274(5ug/ml)刺激人外周血單個核細胞組。該實驗重復(fù)4次，均得到類似的結(jié)果。下面是本實驗中應(yīng)用的寡核苷酸序列
CT151h(5' _ctctctttagggttagggctctct_3，)，SEQ ID NO :3 ;CT151g(5' -ttagggctctctctctctttaggg-3，)，SEQ ID NO :4 ;CT151f (5' -ctctctttagggttagggttaggg-3' ), SEQ ID NO :5 ;CT151e(5' -ttagggttagggttagggctctct-3' ), SEQ ID NO :6 ;CT151d(5' -ctctctctctctttagggttaggg-3' ), SEQ ID NO :7 ;CT151c(5' -ttagggttagggctctctctctct-3，)，SEQ ID NO :8 ;CT151b(5' -ctctctttagggctctctttaggg-3，)，SEQ ID NO :9 ;CT151a(5' _ttagggctctctttagggctctct_3，)，SEQ ID NO :10 ;1612A4(5' -gttagagattaggca-3，)，對照 CpG ;SAT05f(5' _cctcctcctcctcctcctcctcct_3，)，SEQ ID NO :2 ;SAT05e(5' _cttcttcttcttcttcttcttctt_3，)，SEQ ID NO :11 ;SAT05d(5' _ctctctctctctctctctctctctct_3，)，SEQ ID NO :12 ;SAT05c(5' _ctctctctctctctctct_3，)，SEQ ID NO :13 ;SAT05b(5' _ctctctctctct_3’)，SEQ ID NO :14 ;SAT05a(5/ -ctctct-3，)，SEQ ID NO :15 ;SAT05(5' -ctctctctctctctctctct-3，)，SEQ ID NO :1 ;A151(5' -ttagggttagggttagggttaggg-3’)。圖6描述了人外周血單個核細胞在CpG 2006或CpG C274或CpG 684刺激下增殖時，富含TC序列MS08寡核苷酸對其增殖的抑制作用。在存在MS08(5’ -TCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTC-3’，見 SEQ ID NO : 16)及對照寡核苷酸MS19(5’-AAAGAAAGAAAGAAAGAAAGAAAG-3’)的條件下，應(yīng)用 CpG 2006 或CpGC274或CpG684刺激人外周血單個核細胞48小時，之后和[3H]胸腺嘧啶共孵育16小時。細胞增殖的程度用cpm±SD來表示。實驗結(jié)果表明，和對照寡核苷酸相比，MS08可以抑制由CpG 2006或CpG C274或CpG 684刺激的人外周血單個核細胞增殖。圖7描繪了 MS08可以有效抑制在CpG 2216或CpG C274或CpG 302刺激下人外
周血單個核細胞抗病毒物質(zhì)的產(chǎn)生。在存在MS08(5’ -TCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTC-3’，SEQ ID NO :16)及對照寡核苷酸 MS19 (5，-AAAGAAAGAAAGAAAGAAAGAAAG-3’ )的條件下，用 CpG 2216 或 CpG C274 或 CpG302 (5'-tcg tcg ggt gcg acg tcg cag ggg gg_3')刺激人外周血單個核細胞獲得培養(yǎng)上清，觀察此上清保護Veix) E6抵抗10\1'1^5(^5￥病毒攻擊的作用。圖中的各種符號代表了 OD值土 SD。結(jié)果表明，MS08可以抑制在CpG 2216或CpG C274或CpG 302刺激下人外周血單個核細胞抗病毒物質(zhì)的產(chǎn)生。本發(fā)明的詳細說明除非特別強調(diào)，本發(fā)明中的術(shù)語具有可以被本發(fā)明所屬領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員所理解的通常意義。若出現(xiàn)含義上的沖突，應(yīng)遵從本詳細說明的解釋、界定或說明?！肮押塑账帷惫押塑账崾嵌嗪塑账?，是由糖(如脫氧核糖)，磷酸基團和堿基組成的分子，其中糖分子和堿基連接成核苷(nucleoside),核苷由磷酸基團連接形成核苷酸(nucleotide),形成核苷的堿基有喃唳和嘌呤，喃唳有胸腺喃唳(thymine,縮寫為T或t)和胞喃唳(cytosine,縮寫為C或c),嘌呤有腺嘌呤(adenine,縮寫為A或a)和鳥嘌呤(guanine，縮寫為G或g)。 在本發(fā)明中，寡核苷酸指的是寡脫氧核苷酸。本發(fā)明提供的寡核苷酸也被稱為Toll樣受體調(diào)節(jié)性寡核苷酸。寡核苷酸可由人工合成，也可以從細胞、細菌和病毒中獲得。本發(fā)明中的寡核苷酸是由自動核酸合成儀器合成，因此這些寡核苷酸是人工合成的寡核苷酸。這個發(fā)明提供的寡核苷酸是含CT重復(fù)序列[(CT)n]或CCT重復(fù)序列[(CCT) n]或TC重復(fù)序列[(TC)n]，或富含CT或CCT或TC的寡核苷酸寡，其中的C是胞嘧啶或其衍生物，T是胸腺嘧啶或其衍生物，n是2-50的整數(shù)，表示的是重復(fù)單位的個數(shù)，在[(CT)n]寡核苷酸中CT是一個重復(fù)單元，在[(CCT)n]寡核苷酸中CCT是一個重復(fù)單位，在[(TC)n]寡核苷酸中TC是一個重復(fù)單元。本發(fā)明提供的寡核苷酸包括但不限于序列為5 ' -ctctctctctctctctctct-3’的寡核苷酸(SEQ ID N0:1)、序列為 5' -cctcctcctcctcctcctcctcct-3’ 的寡核苷酸(SEQ IDNO 2)和序列為 5，-TCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTC-3’ 的寡核苷酸(SEQ ID NO 16)。5' -ctctctctctctctctctct-3’是含有CT重復(fù)序列[(CT)n]的寡核苷酸,這里CT是一個重復(fù)單位，n = 10。51 -cctcctcctcctcctcctcctcct-3’是含有 CCT 重復(fù)序列[(CCT) n]的寡核苷酸，這里CCT是一個重復(fù)單位，n = 8。5’ -TCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTC-3’，是含有TC重復(fù)序列[(TC)n]的寡核苷酸，這里TC是一個重復(fù)單位，n = 12。本發(fā)明提供的寡核苷酸包含符合(X sub a CT Y sub b) n或(Xsub a TC Y sub b)n公式序列的寡核苷酸。公式中的C是胞喃唳或其衍生物，T是胸腺喃唳或其衍生物，n是2-50的整數(shù)，表示的是重復(fù)單位的個數(shù)。X sub.或Y sub.代表A、T、C、G 4種堿基之一，a或b代表X sub或Y sub的數(shù)目，范圍是從0到I的整數(shù)。例如本發(fā)明的寡核苷酸中，5' -ctctctctctctctctctct-3，(SEQ ID NO :1)符合公式(X sub a CT Y sub b)n 的條件是a = 0，b = 0，n = 10 ;5' -cctcctcctcctcctcctcctcct-3’ (SEQ ID NO :2)符合公式(X sub a CT Y sub b)n 的條件是 a = I, b=0, X sub 是 C, n = 8。51 -cttcttcttcttcttcttcttctt-3 ‘(SEQ ID NO :11)符合公式(X sub a CT Y sub b)n 的條件是 a = 0, b = I, Y sub 是 T，n = 8。5’ -TCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTC-3’ (SEQ ID NO :16)符合公式(X sub a TC Y sub b) n 的條件是a = 0, b = 0, n = 12。本發(fā)明提供的寡核苷酸可包括含有3個以上符合(X sub a CT Y sub b)或(Xsub a TC Ysub b)公式的結(jié)構(gòu)的寡核苷酸，這種寡核苷酸被成為富含 CT 或 TC 的寡核苷酸，如 SEQ ID NO I (5 ' -ctctctctctctctctctct-3 )包含有 10 個 CT ；SEQ ID NO 2 (5 1 -cctcctcctcctcctcctcctcct-3’)包含有 8個 CT ；SEQ ID NO 3 (5 1 -ctctctttagggttagggctctct-3 ‘)包含有 6 個 CT ;SEQ ID NO :4 : (5 1 -ttagggctctctctctctttaggg-3 ‘)包含有 6 個 CT ；SEQ IDNO 5 (5 1 -ctctctttagggttagggttaggg-3 1 )包含有 5 個 CT ；SEQ ID NO 6 (51 -ttagggttagggttagggctctct-31 )包含有3個CT;SEQ ID NO :7:(5' -ctctctctctctttaggtgttaggg-3')包含有6個CT;SEQ ID NO :8 :(5' -ttagggttagggctctctctctct-30包含有 6 個 CT ；SEQ ID NO :9 : (5' -ctctctttagggctctctttaggg-3 ‘)包含有 6 個 CT ；SEQID NO :10 : (5' -ttagggctctctttagggctctct-3 ‘)包含有 6 個 CT。“富含 CT 或 TC 的寡核苷酸”同時也是指“含有(X sub a CT Y sub b)或(Xsub a TC Ysub b)的寡
核苷酸”?！盎瘜W修飾”與自然的DNA相比，本發(fā)明中的寡核苷酸可以有各種化學修飾，修飾的部位可發(fā)生在核苷之間的 磷酸二酯鍵，核糖單位或/和有機堿基(A、T、C、G)。在寡核苷酸的合成期間或合成后都可以進行修飾。在合成期間的化學修飾可以在寡核苷酸的內(nèi)部或5'端進行修飾。合成后的寡核苷酸可以但不限于在活性基團(如5'或3'端的磷酸或羥基)進行化學修飾。專業(yè)人員可以知道這些化學修飾具體方式。本發(fā)明中的寡核苷酸可以有一個或多個化學修飾。和相同序列的自然形態(tài)的寡核苷酸相比，本發(fā)明中的寡核苷酸的化學修飾可以位于局部的磷酸二酯鍵或/和局部的核糖單位或/和局部的核苷堿基。本發(fā)明中的化學修飾包括寡核苷酸的骨架修飾。在這里，寡核苷酸的骨架修飾包括但不限于磷酸骨架修飾。磷酸骨架修飾可以是在核苷酸分子的一個穩(wěn)定的磷酸骨架中，其中至少一個核苷酸間鍵合中的非橋性磷酸氧原子被硫原子取代。在本發(fā)明中的寡核苷酸中，核苷酸間鍵合中的非橋性磷酸氧原子可以部分或全部被硫原子取代。本發(fā)明中的寡核苷酸的骨架也可發(fā)生非離子DNA類似物，如烷基、芳香-碳磷酸鹽化合物(帶電荷的碳磷酸鹽化合物氧原子被烷基、芳香基取代)修飾，再如磷酸二酯和烷基磷酸三酯中的氧原子部分被烷基化修飾。本發(fā)明的寡核苷酸可以是磷硫酰和磷酸二酯的嵌合體。在本發(fā)明的寡核苷酸中，化學修飾還包括堿基替代，如C-5丙炔嘧啶和7-deaza-7替代嘌呤。替代的嘌呤和嘧啶包括但不限于腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、其它的自然的和非自然出現(xiàn)的堿基。在本發(fā)明的寡核苷酸中，化學修飾還包括堿基修飾。修飾的堿基在化學上不同于典型的自然中的堿基(如A、T、C、G。)，但具有它們基本的化學結(jié)構(gòu)。本發(fā)明中的寡核苷酸還可以用胞嘧啶衍生物或胸腺嘧啶核苷衍生物修飾。這里胞嘧啶衍生物是指胞嘧啶樣核苷(除外胞嘧啶)。胸腺嘧啶核苷衍生物是指胸腺嘧樣核苷(不包括胸腺嘧啶)。另外，本發(fā)明中的寡核苷酸的修飾可以是在寡核苷酸的兩個或一個末端連接連接一個二元醇，如四乙二醇或六乙二醇。本發(fā)明中的寡核苷酸經(jīng)化學修飾可以產(chǎn)生出相應(yīng)寡核苷酸的功能性類似物?！懊庖呓閷?dǎo)的疾病”免疫介導(dǎo)的疾病是由有害的免疫反應(yīng)引起的疾病，包括自身免疫性疾病、移植排斥、超敏反應(yīng)、微生物過強刺激宿主免疫系統(tǒng)引起的疾病和TOLL樣受體激活相關(guān)性疾病。本發(fā)明中寡核苷酸可以用來預(yù)防和治療免疫介導(dǎo)的疾病?！懊庖叻磻?yīng)”:免疫應(yīng)答和免疫反應(yīng)有相似的意義。免疫反應(yīng)是免疫細胞如B細胞、T細胞、NK細胞、樹突細胞和巨噬細胞等對抗原或其它刺激作出的反應(yīng)。免疫應(yīng)答包括天然免疫應(yīng)答和獲得性(特異性)免疫應(yīng)答。獲得性免疫應(yīng)答括細胞免疫應(yīng)答和體液免疫應(yīng)答?！邦A(yù)防或治療免疫介導(dǎo)的疾病”:這里的預(yù)防是指防止個體上發(fā)生嚴重的免疫介導(dǎo)的疾病；這里的治療是指對個體采取治療性措施，用來減輕免疫介導(dǎo)的疾病的癥狀、停止免疫介導(dǎo)的疾病的進展或消除免疫介導(dǎo)的疾病的病理條件。"個體"個體是指應(yīng)用本發(fā)明寡核苷酸的人類個體和非人類脊椎動物個體。非人類脊椎動物包括非人類靈長類動物，畜牧動物和寵物動物。本發(fā)明提供的寡核苷酸可在應(yīng)用于個體后預(yù)防或治療免疫介導(dǎo)的疾病。“自身免疫性疾病”自身免疫性疾病是指由于自身免疫耐受被打破而引起的疾病。針對自身抗原的天然免疫應(yīng)答和獲得性免疫應(yīng)答可以引起自身組織和細胞的破壞。自身免疫性疾病的特征決定于其所涉及的器官、細胞、組織和器官。自身免疫性疾病還指“膠原”、“膠原-血管”、“結(jié)締組織”疾病。自身免疫性疾病的發(fā)明機理和超敏反應(yīng)有關(guān)。本發(fā)明的寡核苷酸可以用來預(yù)防或治療自身免疫性疾病。這些自身免疫性疾病包括但不限于系統(tǒng)性紅斑狼瘡、胰島素依賴型糖尿病、炎癥性關(guān)節(jié)炎、類風濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化、自身免疫性肝炎，慢性進展型肝炎、自身免疫性溶血性貧血、自身免疫性血小板減少癥、自身免疫性萎縮性胃炎、自身免疫性惡性貧血、 自身免疫性腦脊髓炎、自身免疫性睪丸炎、獲得性血友病、強直性脊柱炎、慢性炎癥性脫髓鞘性多神經(jīng)病、斑痕性類天皰瘡、抗磷脂綜合癥、心肌病、冷凝集素病，冷凝集素疾病、盤狀狼瘡、交感性眼炎、特發(fā)性混合型冷沉淀球蛋白血癥、IgA腎病、幼年型關(guān)節(jié)炎、全身性硬化癥、結(jié)節(jié)多動脈炎、多軟骨炎、皮肌炎、原發(fā)性無丙種球蛋白血癥、原發(fā)性膽汁性肝硬變、高免疫球蛋白E癥、進展性全身硬化癥、牛皮癬、菜特爾綜合征、結(jié)節(jié)病、僵人綜合征、葡萄膜炎、血管炎、白癜風、橋本(氏)甲狀腺炎、Goopasture病、惡性貧血、艾迪生氏病、斯耶格倫(氏)綜合征、重癥肌無力、Grave病、變應(yīng)性腦脊髓炎、腎小球腎炎等(N Engl J Med, Vol. 345，No. 5，August 2，2001，p340_350)。在包含有 DNA或RNA的微生物釋放出DNA或RNA的刺激下，可以產(chǎn)生出特異性的針對包含有自身DNA或RNA復(fù)合物的自身抗體，導(dǎo)致自身免疫性疾病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡的發(fā)生?！俺舴磻?yīng)”:超敏反應(yīng)是指由于針對內(nèi)外源性抗原的細胞免疫或體液免疫應(yīng)答引起的的疾病，分為四個類型。I型超敏反應(yīng)(也稱過敏反應(yīng)型、特應(yīng)性的IgE介導(dǎo)的超敏反應(yīng)或變態(tài)反應(yīng))通常起因于IgE致敏的嗜堿粒細胞和肥大細胞接觸特異性外源性抗原后釋放藥理活性物質(zhì)，如組胺、過敏反應(yīng)的慢反應(yīng)物質(zhì)(SRS-A)和嗜酸粒細胞趨化因子等。I型超敏反應(yīng)包括但不限于外源性哮喘、季節(jié)性變應(yīng)性鼻炎和全身過敏反應(yīng)。II型超敏反應(yīng)(也稱細胞毒型、細胞溶解型、補體依賴型或細胞刺激性超敏反應(yīng))發(fā)生的條件是抗體識別了自身的細胞或組織的抗原，或識別了和與細胞或組織偶聯(lián)的抗原或半抗原。II型超敏反應(yīng)包括但不限于自身免疫性溶血性貧血、粒細胞減少癥、胎兒成紅細胞增多癥、腎小球性腎炎咯血綜合征。III型超敏反應(yīng)(也稱毒性復(fù)合物、可溶性復(fù)合物、或免疫復(fù)合物型超敏反應(yīng))起因于循環(huán)中的可溶性抗原抗體復(fù)合物沉淀在血管或組織中而激發(fā)的炎癥反應(yīng)。III型超敏反應(yīng)包括但不限于Arthurs反應(yīng)、血清病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡和腎小球腎炎。IV超敏反應(yīng)(又稱為細胞的、細胞介導(dǎo)的、遲發(fā)的、或結(jié)核菌素型超敏反應(yīng))是由致敏的T細胞接觸了特異性抗原而引起的。IV超敏反應(yīng)包括但不限于接觸性皮炎和同種異體移植物排斥等(Richard A. Goldsby, Thomas J. Kindt, Barbara A. Osborne. Janis Kuby. Immunology,Fifth Edition, 2003, ff. H. FREEMAN AND COMPANY).“微生物過強刺激宿主免疫系統(tǒng)引起的疾病”:微生物入侵如果非常嚴重，有時可以在一個個體引起全身性炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致微生物過強刺激宿主免疫系統(tǒng)引起的疾病。如感染流感病毒A(H5N1)或SARS病毒的個體的血液中可出現(xiàn)高水平的下列物質(zhì)TNF_a、IL-U IL-6、IL-12、IFN-a、IFN-^、IFN-y化學因子干擾素誘導(dǎo)蛋白10、單核細胞趨化蛋白I、IL-8、IL-I-^。這種由于微生物感染而引起的血液中細胞因子水平顯著升高，被稱為細胞因子血癥或細胞因子風暴。研究表明，感染禽流感病毒或SARS病毒的病人，除了需要抗病毒的藥物外，還需要抑制免疫反應(yīng)的藥物。微生物過強刺激宿主免疫系統(tǒng)引起的疾病可表現(xiàn)為膿毒病綜合征(S印sis)、急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)和多器官衰竭(TheWriting Committee of the World Health Organization(WHO)Consultation on HumanInfluenza A/H5. Avian Influenza A (H5N1)Infection in Humans. N Engl J Med 2005 ；353 :1374-85)。本發(fā)明中的寡核苷酸就可以用來預(yù)防和治療微生物過強刺激宿主免疫系統(tǒng)引起的疾病。弓I起這類疾病的微生物包括病毒、細菌、寄生蟲和真菌和海綿狀腦病致病原。引起微生物過強刺激宿主免疫系統(tǒng)引起的疾病的病毒包括=SARS病毒、流感病毒、禽流感病毒、HTV-1、脊髓灰質(zhì)炎病毒、甲型肝炎病毒、腸道病毒、人柯薩奇病毒、鼻病毒屬、?？刹《尽ⅠR腦炎病毒、風疹病毒、登革熱病毒、腦炎病毒、黃熱病病毒、冠狀病毒、皰疹性口炎病毒、狂犬病病毒、埃博拉病毒、副流感病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒、漢坦病毒、bunga病毒、靜脈病毒、Nairo 病毒、出血熱病毒、呼腸病毒、orbiviurses、輪狀病毒、乙肝病毒、細小病毒組、乳頭瘤病毒、多瘤病毒、腺病毒、I型單純皰疹病毒、II型單純皰疹病毒、水痘-帶狀皰疹病毒、巨細胞病毒、皰疹病毒、類天花病毒、痘苗病毒、痘病毒、非洲豬霍亂病毒、海綿狀腦病致病原、丁型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、口蹄疫病毒。引起微生物過強刺激宿主免疫系統(tǒng)引起的疾病的細菌包括幽門螺旋桿菌、Borelia burgdorferi、嗜肺性軍團病菌、分枝桿菌、金黃色葡萄球菌、淋病雙球菌、腦膜炎雙球菌、單核細胞增多性李司忒(氏)菌、A組鏈球菌屬、B組鏈球菌屬、鏈球菌屬、糞鏈球菌、牛鏈球菌、鏈球菌屬(厭氧的鏈球菌)、肺炎鏈球菌、致病性Campylobacter鏈球菌、腸道球菌、流感(嗜血)桿菌、antracis桿菌、白喉棒狀桿菌、棒狀桿菌屬、豬紅斑丹毒絲菌、產(chǎn)氣莢膜芽孢梭菌、破傷風桿菌、腸道細菌(屬)aerogeytes、肺炎桿菌、Pasturella multocida、類桿菌屬、具核梭桿菌、念珠狀鏈桿菌、密螺旋體屬、細弱密螺旋體、細螺旋體和放線菌屬。弓I起微生物過強刺激宿主免疫系統(tǒng)引起的疾病的真菌包括但不限于隱球菌屬新型細球菌、夾膜組織胞漿菌、粗球孢子菌、皮炎芽生菌、沙眼衣原體、白色念珠菌。引起微生物過強刺激宿主免疫系統(tǒng)引起的疾病的真菌包括但不限于惡性瘧原蟲、鼠弓形體。“移植排斥”由于組織或器官移植引起的免疫介導(dǎo)的疾病。移植是移植物從供體向受體的轉(zhuǎn)移。從供體向受體轉(zhuǎn)移的移植物是活的細胞、組織或器官。自體移植是將自身的組織從一個部位轉(zhuǎn)移到另一個部位。同系基因型移植是在同卵雙生的孿生子間進行的移植。同種移植是在同一物種中具有遺傳學上區(qū)別的不同個體間進行的移植。異種移植是在不同物種的個體間進行移植。當一個個體作為受體接受了同種移植或異種移植后，機體可以對供者的組織細胞產(chǎn)生免疫應(yīng)答。在這種情況下，需要抑制免疫應(yīng)答來避免移植物排斥(Richard A. Goldsby, Thomas J. Kindt, Barbara A. Osborne. Janis Kuby. Immunology,Fifth Edition, 2003, ff. H. FREEMAN AND COMPANY)。本發(fā)明中的寡核苷酸可以用來預(yù)防移植物排斥。移植物可以是心臟、腎臟、肝臟、骨髓、皮膚、角膜、肺、胰腺、小腸、肢體、肌肉、神經(jīng)、十二指腸和胰島細胞等。TOLL樣受體激活相關(guān)性疾病T0LL樣受體激活相關(guān)性疾病是指和TOLL樣受體(TLR)家族成員的激活相關(guān)的免疫介導(dǎo)的疾病。這些疾病包括但不限于與LPS激活TLR4相關(guān)的膿毒血癥，與TLR2，3，4，9激活相關(guān)的擴張型心肌病，與TLR2，3，4，9激活相關(guān)的糖尿病、與TLR3激活相關(guān)的實驗性自身免疫性腦脊髓炎，與TLR9激活相關(guān)的系統(tǒng)性紅斑狼瘡，與TLR4激活相關(guān)的動脈粥樣硬化，與LPS激活TLR4相關(guān)的哮喘，與TLR4激活相關(guān)的慢性阻塞性肺疾患，與TLR4激活相關(guān)的實驗性變應(yīng)性腦炎，與TLR4激活相關(guān)的器官衰竭等(Foo Y et al. Negative regulation of toll like receptor mediated immuneresponses. Nature Review Immunology, Vol 5,2005,446-458) CpG-containing DNA (aTLR9 agonist)。已經(jīng)證實，在系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者的血清中存在來源于含核酸感染因子的含CpG的DNA物質(zhì)，這些物質(zhì)可引起以IFN- a分泌為主的免疫應(yīng)答，促進系統(tǒng)性紅斑狼瘡的進展。本發(fā)明中提供的寡核苷酸可以用來預(yù)防或/和治療TOLL樣受體激活相關(guān)性疾病。“藥物學上可接受的載體”:藥物學上可接受的載體是指一種或多種固體或液體的填充劑、稀釋劑或包封物質(zhì)，此載體適合將本發(fā)明中的寡核苷酸應(yīng)用于個體。該載體可以是有機的、無機的、天然的或合成的。該 載體包括各種溶液、稀釋劑、溶劑、分散劑、脂質(zhì)體、乳劑、糖衣、抗菌劑、抗真菌劑、等滲的和延緩吸收的試劑、和其他的適合本發(fā)明中的寡核苷酸應(yīng)用的載體。藥物學上可接受的載體的選擇決定于本發(fā)明中寡核苷酸應(yīng)用方式?？勺⑸溆玫妮d體包括水、生理鹽水、平衡鹽溶液、葡萄糖溶液、甘油等。對于固體混合物(如粉末、丸、片劑、膠囊形式)而言，常用的非毒性固體載體包括具有藥理學純度的甘露醇、乳糖、淀粉和硬脂酸鎂等。另外，作為生物學上中性的載體，應(yīng)用的藥理學組分中可以含有非毒性的輔助物質(zhì)，包括濕化或乳化劑、防腐劑、PH緩沖試劑，醋酸鈉和單月桂酸酯等?！爸委熡行┝俊睘榱祟A(yù)防或治療免疫介導(dǎo)的疾病，給個體應(yīng)用本發(fā)明中的寡核苷酸的劑量是治療有效劑量。該治療有效劑量是指在預(yù)防或治療免疫介導(dǎo)的疾病中，給予個體后可產(chǎn)生理想的預(yù)防或治療效果的寡核苷酸的劑量。本發(fā)明中的寡核苷酸可以直接或放到藥物學上可接受的載體中應(yīng)用。這個“劑量”的多少決定于本領(lǐng)域技術(shù)熟練人員應(yīng)知的標準技術(shù)，還要參考其他因素，包括并不限于個體的大小和健康情況和疾病的嚴重程度。本發(fā)明中的寡核苷酸可以用作單次治療或多次治療。本發(fā)明中的寡核苷酸每次應(yīng)用到個體的劑量范圍從I U g到lOOmg。為了達到理想的治療效果，本領(lǐng)域技術(shù)熟練人員可以對應(yīng)用的劑量作調(diào)整，如主治醫(yī)師在可靠的醫(yī)療判斷的基礎(chǔ)上，做出的劑量調(diào)整，其劑量范圍可以是前述范圍的10倍到1000倍?！敖o藥途徑”:在應(yīng)用時，本發(fā)明中的寡核苷酸可以單獨應(yīng)用或按配方制作成藥物組合物應(yīng)用，經(jīng)由各種合適的途徑來達到理想的治療效果。本發(fā)明中的寡核苷酸的治療途徑可以是腸內(nèi)、腸外、外用或吸入途徑。本發(fā)明中的寡核苷酸的腸內(nèi)治療途徑包括經(jīng)口、胃、結(jié)腸或直腸給藥。本發(fā)明中的寡核苷酸的腸外用藥途徑包括經(jīng)靜脈、腹膜、鞘內(nèi)、肌肉、皮下、局部注射，經(jīng)陰道、外用、鼻粘膜和肺吸入等。本發(fā)明中的寡核苷酸的外用治療途徑包括經(jīng)皮膚、口腔、眼睛、耳和鼻子?！八幬锝M合物”:藥物組合物指的是本發(fā)明中治療有效劑量的寡核苷酸或其與藥物學上可接受的載體組成的混合物。藥物組合物分可以包含一個或多個本發(fā)明中的寡核苷酸。藥物組合物可以但不限于是水溶液、鹽溶液、顆粒、氣溶膠、片劑、粉劑、糖衣片劑、膠囊齊U、栓劑、糖漿劑、乳劑、懸膠液、乳膏、滴劑和其它合適的物質(zhì)。藥物組合物的應(yīng)用方式可以是經(jīng)腸外、經(jīng)口、經(jīng)直腸、經(jīng)陰道、經(jīng)腹膜內(nèi)、經(jīng)局部(粉劑、軟膏劑、凝膠劑、滴劑、透辟貼劑)、含服或口腔和鼻腔噴霧等。在各種情況下，藥物組合物必須是無菌和穩(wěn)定的。本發(fā)明的注射劑藥物組合物包括藥學上可接受的水溶液、非水溶液、分散劑、懸濁劑、乳劑或粉劑，注射前用無菌的注射用水或分散劑溶解。本發(fā)明中的寡核苷酸可以用水相載體溶解，比如用pH 3. 0到pH8. 0的等滲的緩沖液，pH值范圍也可為pH3. 5-pH 7. 4，pH 3. 5-pH 6. 0，pH3. 5-pH 5.0。緩沖液包括檸檬酸鹽緩沖液、磷酸鹽緩沖液、醋酸鹽緩沖液。口服的藥物組合物可以和可食用的載體按配方制成粉劑、片劑、丸劑、糖錠劑、膠囊、液體、凝膠、糖漿、膏劑或懸濁劑等。常規(guī)的非毒性固體載體作為固體組分可以是藥物學級別的甘露醇、乳糖、淀粉和硬脂酸鎂等?？谇缓o藥法的藥學藥物組合物可以是傳統(tǒng)方式的片劑和錠劑。作為吸入法的藥學藥物組合物是噴霧劑，相關(guān)領(lǐng)域技術(shù)熟練人員可以選擇使用壓力囊、噴霧器或干粉。在一些情況下，為了延長本發(fā)明中寡核苷酸的作用效果，藥物組合物可被處理于合適的持續(xù)釋放系統(tǒng)后應(yīng)用。發(fā)明中的寡核苷酸或藥物組合物可以被處理成帶有結(jié)晶的懸膠液或水分較少的非結(jié)晶物質(zhì)，來穩(wěn)定地延緩釋放。注射用的本發(fā)明中寡核苷酸的延緩釋放可以通過用疏水物質(zhì)(如，可接受的 油性載體)來溶解寡核苷酸來實現(xiàn)。用于注射形式的藥物組合物，可以是脂質(zhì)體包裹的寡核苷酸或乳粒，或可生物降解的半透性聚合物，如多乳酸化合物、多正酯類或聚酐。“活性物質(zhì)”:本發(fā)明中的寡核苷酸可以單獨應(yīng)用，或幾種寡核苷酸聯(lián)合應(yīng)用，或應(yīng)用藥物可接受的載體，或和一種或幾種其他的活性物質(zhì)聯(lián)合應(yīng)用。本發(fā)明中的寡核苷酸和其它的活性物質(zhì)聯(lián)合應(yīng)用，在時間上可以是同時的也可以是相繼的。活性物質(zhì)包括非類固醇類的抗炎試劑、類固醇、非特異性免疫抑制劑、生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑、化合物、小分子、核酸分子、TLR拮抗劑等?；钚晕镔|(zhì)還指通過如下方式抑制免疫活性的試劑拮抗趨化因子，誘導(dǎo)產(chǎn)生調(diào)節(jié)T細胞(CD4+CD25+T細胞)，抑制補體系統(tǒng)，抑制基質(zhì)金屬蛋白酶，抑制NO合成酶，阻斷協(xié)同刺激分子，抑制免疫細胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。非類固醇類的抗炎試劑的包括但不限于雙氯芬酸、雙氟尼酸、乙哚乙酸、氟吡洛芬、布洛芬、吲哚美辛、酮基布洛芬、痛力克、萘普酮、甲氧萘丙酸、吡羅昔康、舒林酸、tohnetin、塞來考昔、羅非考昔。類固醇包括但不限于腎上腺皮質(zhì)素、地塞米松、氫化可的松、甲基氫化潑尼松、去氫氫化可的松、潑尼松和氫羥強的松龍。非特異性免疫抑制劑是指用來抑制免疫介導(dǎo)的疾病的試劑，包括但不限于環(huán)磷酰胺、環(huán)孢霉素A、氨甲喋呤、類固醇、FK506、他克莫司、霉酚酸和西羅莫司。生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑包括重組IL-I受體拮抗劑(Kineret or anakima)、可溶性p75、TNF_a受體gGl融合蛋白(etanercept or Enbrel)、抗 TNF_a 單克隆抗體(infliximab or RemicadeX),還包括干擾素@-la、白細胞介素-10和TGF 3?！斑f送載體”:本發(fā)明中的寡核苷酸可以用遞送載體遞送應(yīng)用。遞送載體包括但不限于類固醇(如膽固醇)、絡(luò)和物、乳化物、免疫刺激復(fù)合物(ISCOMs)、脂質(zhì)(如陽離子脂質(zhì)和陰離子脂質(zhì))、脂質(zhì)體、活的細菌載體(如沙門氏菌、大腸桿菌、分枝桿菌志賀(氏)桿菌、乳酸桿菌)和活的病毒載體(如牛痘苗、腺病毒、單純皰疹病毒)、病毒小體、病毒樣顆粒、微球、核酸疫苗、高分子材料(如羧甲基纖維素、脫乙酰殼多糖)、環(huán)狀多聚物。遞送載體也可以通過特異性受體識別靶細胞的靶向性配體分子。“體外處理免疫細胞”:可以應(yīng)用本發(fā)明中的寡核苷酸在體外處理該個體的免疫細胞，然后將處理過的細胞輸回該個體，達到預(yù)防或治療免疫介導(dǎo)的疾病的目的。被處理的細胞可以是樹突細胞、巨噬細胞、T細胞、B細胞和天然殺傷細胞等免疫細胞由一種或數(shù)種免疫細胞所組成的細胞群。經(jīng)處理的免疫細胞可以單獨回輸、和本發(fā)明中的寡核苷酸一起回輸、和/或其他活性物質(zhì)一起回輸。免疫細胞的回輸途徑可以是全身性的也可以是局部性的。
具體實施例方式技術(shù)熟練人員可以了解到本發(fā)明提供的寡核苷酸可以用于預(yù)防和治療免疫介導(dǎo)的疾病。下面的非限定性的實施例將對本發(fā)明作出例證說明。在這些實施例中，4個寡核苷酸(CpG2216、CpG2006、CpG C274、CpG302)被用作刺激劑。CpG2216是典型的A型CpGODN，可以激活人漿細胞樣樹突狀細胞，產(chǎn)生大量的I型干擾素(IFN-a/P)，強烈地激活NK細胞。激活的漿細胞樣樹突狀細胞可分泌IFNa，后者可使?jié){細胞樣樹突狀細胞遷移聚集到淋巴結(jié)和其他周圍淋巴組織，在那里此漿細胞樣樹突狀細胞可以激活未致敏的T細胞和記憶T細胞，幫助可溶性抗原交叉遞呈給CD8+細胞毒性T細胞，促進THl型的⑶4和⑶8T細胞反應(yīng)。拮抗CpG2216活性的試劑可以抑制以分泌IFN和激活NK細胞為特征的天然免疫應(yīng)答而間接地 抑制獲得性免疫應(yīng)答，因此可以用來預(yù)防和治療與天然免疫和獲得性免疫相關(guān)的免疫介導(dǎo)的疾病。B型含CpG寡核苷酸主要激活B細胞，刺激B細胞增值和抗體分泌。CpG2006是典型的B型CpG 0DN，能夠激活B細胞，引起B(yǎng)細胞增殖和抗體分泌。對CpG2006有抑制作用的試劑可以抑制獲得性免疫應(yīng)答特別是體液免疫應(yīng)答，因此可以用來預(yù)防和治療和體液免疫應(yīng)答相關(guān)的免疫介導(dǎo)的疾病。C型含CpG的寡核苷酸同時具有A型和B型含CpG寡核苷酸的功能。CpG C274和CpG 302是C型0DN，具有A型和B型的性質(zhì)。抑制CpG274活性的試劑可以用來預(yù)防和治療與天然免疫和獲得性免疫相關(guān)的免疫介導(dǎo)的疾病。此外，作為TLR激動劑，CpG2006、CpG274、CpG2216、CpG302可以引發(fā)天然免疫應(yīng)答，所以，拮抗CpG2006、CpG274、CpG2216、CpG 302活性的試劑能夠用來治療與TLR激活相關(guān)的免疫介導(dǎo)的疾病。在實施例中，以人外周血分離人外周血單個核細胞作為免疫細胞的來源，其中的免疫細胞有T細胞，B細胞，天然殺傷細胞，樹突狀細胞，粒細胞和單核細胞等。實施例中的寡核苷酸是由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。實施例中所用的寡核苷酸都經(jīng)無熱源處理。寡核苷酸中的內(nèi)毒素應(yīng)用鱟變形細胞溶解法檢測(Associates ofCape Cod，Inc)。以下顯示的是在實施例中應(yīng)用的寡核苷酸的序列和名稱CpG2216(5，-gggggacgatcgtcgggggg-3J )CpG2006(5， _tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt_3，)CpG C274(5， -tcgtcgaacgttcgagatgat 3，)CpG 302 (5 -tcg tcg ggt gcg acg tcg cag ggg gg-3 )Al51 (5 ' -ttagggttagggttagggttaggg-3，) (Hidekazu Shirota, etal.Suppressive Oligodeoxynucleotides Protect Mice from Lethal Endotoxic Shock.The Journal of Immunology, 2005,174 :4579-4583)SAT05(5' -ctctctctctctctctctct-3，)，SEQ ID NO :1SAT05f(5' -cctcctcctcctcctcctcctcct-3，)，SEQ ID NO :2CT 151h(5' -ctctctttagggttagggctctct-3，)，SEQ ID NO :3CT151g(5' -ttagggctctctctctctttaggg-3，)，SEQ ID NO :4CT151f(5' -ctctttagggttagggttaggg-3' ), SEQ ID NO :5CT151e(5' -ttagggttagggttagggctctct-3' ), SEQ ID NO :6CT151d(5' -ctctctctctctttagggttaggg-3' ), SEQ ID NO :7CT151c(5' -ttagggttagggctctctctctct-3，)，SEQ ID NO :8
CT151b(5' -ctctctttagggctctctttaggg-3，)，SEQ ID NO :9CT151a(5' -ttagggctctctttagggctctct-3，)，SEQ ID NO :101612A4 (5' -gttagagattaggca-3J ), Control CpG (對照寡核昔酸)SAT05e(5' -cttcttcttcttcttcttcttctt-3，)，SEQ ID NO :11SAT05d(5' _ctctctctctctctctctctctct_3，)，SEQ ID NO :12SAT05c (5' -ctctctctctctctctct -3，)，SEQ ID NO :13SAT05b(5' -ctctctctctct-3’)，SEQ ID NO :14SAT05a(5/ -ctctct-3’)，SEQ ID NO : 15MS08(5，-TCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTC-3，)，SEQ ID NO :16MS19 (5’ -AAAGAAAGAAAGAAAGAAAGAAAG-3’ )，Control CpG (對照寡核苷酸)實施例I、SAT05對CpG ODN誘導(dǎo)人外周血單個核細胞(PBMCs)增殖的影響用Ficoll-Hypaque密度梯度離心法從人外周血分離人外周血單個核細胞(Ficoll試劑購自Pharmacia公司，血液樣品由吉林省血液中心提供)。用臺酹蘭染色法確定人外周血單個核細胞的成活率為95% -99%。用[3H]胸腺嘧啶摻入法檢測人外周血單個核細胞的增殖情況。簡略地說，人外周血單個核細胞以5X IO5/孔的密度接種到U型底96孔板，在存在SAT05或A151或?qū)φ展押塑账?ODN)的情況下，與CpG 2006 (I u g/ml)或CpGC274 (I V- g/ml)共孵育 48 小時,之后加入[3H]胸腺卩密唳(New England Nuclear, Boston,MA)培養(yǎng)16小時。在玻璃纖維濾器上收獲細胞，用閃爍計數(shù)器檢測結(jié)果。用平均cpm±SD表示細胞增殖情況。每個樣品設(shè)3復(fù)孔。如圖I的結(jié)果所示，由CT重復(fù)序列[(CT)n]構(gòu)成的SAT05可以抑制由CpG 2006或CpGC274刺激下的人外周血單個核細胞增殖。這個抑制效果明顯強于A151誘導(dǎo)的抑制效果。對照的寡核苷酸未顯現(xiàn)抑制作用。實施例2SAT05f對CpG ODN誘導(dǎo)人外周血單個核細胞(PBMCs)增殖的影響用Ficoll-Hypaque密度梯度離心法從人外周血分離人外周血單個核細胞(Ficoll試劑購自Pharmacia公司，血液樣品由吉林省血液中心提供)。用臺酹蘭染色法確定人外周血單個核細胞的成活率為95%-99%。用[3H]胸腺嘧啶摻入法檢測人外周血單個核細胞的增殖情況。簡略地說，人外周血單個核細胞以5X IO5/孔的密度接種到U型底96孔板，在存在SAT05f或A151或?qū)φ展押塑账?ODN)的情況下，與CpG2006 (I u g/ml)或CpG274 (I V- g/ml)共孵育 48 小時,之后加入[3H]胸腺卩密唳(New England Nuclear, Boston,MA)培養(yǎng)16小時。在玻璃纖維濾器上收獲細胞，用閃爍計數(shù)器檢測結(jié)果。用平均cpm±SD表示細胞增殖情況。每個樣品設(shè)3復(fù)孔。如圖2的結(jié)果所示，由CCT重復(fù)序列[(CCT)n]構(gòu)成的SAT05f可以抑制由CpG 2006或CpG C274刺激下的人外周血單個核細胞增殖。這個抑制效果明顯高于A151誘導(dǎo)的抑制效果。對照的寡核苷酸沒有抑制作用。實施例3SAT05對CpG ODN刺激下人外周血單個核細胞產(chǎn)生抗病毒活性的影響用Ficoll-Hypaque密度梯度離心法從人外周血分離人外周血單個核細胞(Ficoll試劑購自Pharmacia公司，血液樣品由吉林省血液中心提供)。由臺酹蘭染色法確定人外周血單個核細胞的成活率為95% -99%。Vero E6細胞(非洲綠猴腎細胞系，源自Type Culture Collection,美國)用含10% (v/v)熱滅活的胎牛血清和抗生素(100 IU of penicillin/ml and 100 IU ofstreptomycin/ml)的MDM培養(yǎng)液在37°C、5% CO2的細胞孵箱內(nèi)培養(yǎng)。采用Vero E6細胞病變法檢測經(jīng)CpG ODN處理人外周血單個核細胞培養(yǎng)上清的抗病毒活性。簡略介紹如下在存在SAT05或A 151或?qū)φ展押塑账?ODN)的情況下，將人外周血單個核細胞與CpG2216共同培養(yǎng)48小時，收集上清。將Vero E6細胞(3X IO4/孔)接種到平底96孔板，培養(yǎng)24小時。之后，和100 ill上述收集的上清培養(yǎng)18小時，再加入10XTCID50(TCID50，半數(shù)組織感染劑量)的VSV病毒(水泡性口炎病毒)繼續(xù)培養(yǎng)48小時。培養(yǎng)結(jié)束后，用0. 5%的結(jié)品紫染色。用多孔微量滴定板檢測儀測定OD值(A578nm)，以O(shè)D值來表示病毒的細胞病變效應(yīng)。如圖3所示，由CT重復(fù)序列[(CT)n]構(gòu)成的SAT05可以抑制由CpG 2216刺激下的人外周血單個核細胞抗病毒物質(zhì)的產(chǎn) 生。另一個實驗證明，抑制抗病毒活性和I型干擾素廣生的減少有關(guān)。實施例4SAT05f對CpG ODN刺激下人外周血單個核細胞抗病毒活性的影響用Ficoll-Hypaque密度梯度離心法從人外周血分離單個核細胞(Ficoll試劑購自Pharmacia公司，血液樣品由吉林省血液中心提供)。由臺酹蘭染色法確定人外周血單個核細胞的成活率為95% -99%。Vero E6細胞(非洲綠猴腎細胞系，Type Culture Collection,美國)用含10 % (v/v)熱滅活的胎牛血清和抗生素(100 IU of penicillin/ml and 100 IU ofstreptomycin/ml)的MDM培養(yǎng)液在37°C、5% CO2的細胞孵箱內(nèi)培養(yǎng)。采用Vero E6細胞病變法檢測經(jīng)CpG ODN處理人外周血單個核細胞培養(yǎng)上清的抗病毒活性。簡略介紹如下在存在SAT05f 或A151或?qū)φ展押塑账?ODN)的情況下，將人外周血單個核細胞與CpG274共同培養(yǎng)48小時，收集上清。將Vero E6 cells (3 X IO4/孔)接種到平底型96孔板，培養(yǎng)24小時。之后，用IOOiU上述收集的上清培養(yǎng)18小時，再加入IOX TCID50(TCID50，半數(shù)組織感染劑量)的VSV病毒(水泡性口炎病毒)繼續(xù)培養(yǎng)48小時。培養(yǎng)結(jié)束后，用0.5%的結(jié)晶紫染色。用多孔微量滴定板檢測儀測定OD值(A578nm)，以O(shè)D值來表示病毒的細胞病變效應(yīng)。如圖4所示，由CT重復(fù)序列[(CCT)n]構(gòu)成的SAT05f可以抑制由CpG 274刺激下的人外周血單個核細胞抗病毒物質(zhì)的產(chǎn)生。另一個實驗證明，抑制抗病毒活性和I型干擾素廣生的減少有關(guān)。實施例5含有CT重復(fù)序列、CCT重復(fù)序列、富含CT序列的寡核苷酸對人外周血單個核細胞增殖的影響用Ficoll-Hypaque密度梯度離心法從人外周血分離單個核細胞(Ficoll試劑購自Pharmacia公司，血液樣品由吉林省血液中心提供)。由臺酹蘭染色法確定人外周血單個核細胞的成活率為95% -99%。人外周血單個核細胞以5 X IO5/孔的密度接種到U型底96孔板，在存在如圖5標明的各種濃度的寡核苷酸的條件下，與CpG274(5ii g/ml)共同培養(yǎng)48小時。之后加入[3H]胸腺卩密唳(New England Nuclear, Boston, MA)培養(yǎng)16小時。實驗設(shè)4個對照組“PBS”組是指人外周血單個核細胞只與CpG274(5 u g/ml)共培養(yǎng)；“細胞”組是指培養(yǎng)的人外周血單個核細胞未與CpG274共培養(yǎng)；“A 151”組是指人外周血單個核細胞CpG274(5iig/ml)共培養(yǎng)，并加入A151 1612A4”組是指人外周血單個核細胞CpG274(5iig/ml)共培養(yǎng)，并加入1612A4(Control ODN)。在玻璃纖維濾器上收獲細胞，用閃爍計數(shù)器檢測結(jié)果。用平均cpm±SD表示細胞增殖情況。每個樣品設(shè)3個復(fù)孔。如圖5所示，含有CT重復(fù)序列、CCT重復(fù)序列、富含CT序列的寡核苷酸可以抑制由CpG274刺激的人外周血單個核細胞增殖。實施例6、MS08對CpG ODN誘導(dǎo)人外周血單個核細胞(PBMCs)增殖的影響用Ficoll-Hypaque密度梯度離心法從人外周血分離人外周血單個核細胞(Ficoll試劑購自Pharmacia公司，血液樣品由吉林省血液中心提供)。用臺酹蘭染色法確定人外周血單個核細胞的成活率為95%-99%。用[3H]胸腺嘧啶摻入法檢測人外周血單個核細胞的增殖情況。簡略地說，人外周血 單個核細胞以5X IO5/孔的密度接種到U型底96 孔板，在存在 MS08(見 SQE ID NO 16)或?qū)φ展押塑账?MS19 (5’_AAAGAAAGAAAGAAAGAAAGAAAG-3，)的情況下，與 CpG 2006(1 u g/ml)或 CpG C274(l u g/ml)或 CpG684(l u g/ml)共孵育48小時，之后加入[3H]胸腺卩密唳(New England Nuclear, Boston, MA)培養(yǎng)16小時。在玻璃纖維濾器上收獲細胞，用閃爍計數(shù)器檢測結(jié)果。用平均cpm±SD表示細胞增殖情況。每個樣品設(shè)3復(fù)孔。如圖6的結(jié)果所示，由TC重復(fù)序列[(TC)n]構(gòu)成的MS08可以抑制由CpG 2006或CpG C274或CpG 684刺激下的人外周血單個核細胞增殖。對照的寡核苷酸未顯現(xiàn)抑制作用。實施例7MS08對CpG ODN刺激下人外周血單個核細胞產(chǎn)生抗病毒活性的影響用Ficoll-Hypaque密度梯度離心法從人外周血分離人外周血單個核細胞(Ficoll試劑購自Pharmacia公司，血液樣品由吉林省血液中心提供)。由臺酹蘭染色法確定人外周血單個核細胞的成活率為95% -99%。Vero E6細胞(非洲綠猴腎細胞系，源自Type Culture Collection,美國)用含10% (v/v)熱滅活的胎牛血清和抗生素(100IU of penicillin/ml and 100 IU ofstreptomycin/ml)的MDM培養(yǎng)液在37°C、5% CO2的細胞孵箱內(nèi)培養(yǎng)。采用Vero E6細胞病變法檢測經(jīng)CpG ODN處理人外周血單個核細胞培養(yǎng)上清的抗病毒活性。簡略介紹如下在存在MS08或?qū)φ展押塑账酠S19 (5’ -AAAGAAAGAAAGAAAGAAAGAAAG-3’)情況下，將人外周血單個核細胞與 CpG2216 或 CpG C274 或 CpG 302 (5'-tcg tcg ggt gcg acg tcg cag ggggg-3')共同培養(yǎng)48小時，收集上清。將Vero E6細胞(3X IO4/孔)接種到平底96孔板，培養(yǎng)24小時。之后，和100 ill上述收集的上清培養(yǎng)18小時，再加入10XTCID50(TCID50，半數(shù)組織感染劑量)的VSV病毒(水泡性口炎病毒)繼續(xù)培養(yǎng)48小時。培養(yǎng)結(jié)束后，用0.5%的結(jié)晶紫染色。用多孔微量滴定板檢測儀測定OD值(A578nm)，以O(shè)D值來表示病毒的細胞病變效應(yīng)。如圖7所示，由TC重復(fù)序列[(TC)n]構(gòu)成的MS08可以抑制由CpG 2216或CpGC274或CpG 302刺激下的人外周血單個核細胞抗病毒物質(zhì)的產(chǎn)生。另一個實驗證明，抑制抗病毒活性和I型干擾素產(chǎn)生的減少有關(guān)。序列表〈110〉長春華普生物技術(shù)有限公司<120>Toll樣受體調(diào)節(jié)性寡核苷酸及其用于治療免疫介導(dǎo)疾病的用途<160>16
<210>1<211>20<212>DNA〈213〉人工合成的<400>1ctctctctct ctctctctct20 <210>2<211>24<212>DNA〈213〉人工合成的<400>2cctcctcctc ctcctcctcc tcct24<210>3<211>24<212>DNA〈213〉人工合成的<400>3ctctctttag ggttagggct ctct24<210>4<211>24<212>DNA〈213〉人工合成的<400>4ttagggctct ctctctcttt aggg24<210>5<211>24<212>DNA〈213〉人工合成的<400>5ctctctttag ggttagggtt aggg24<210>6<211>24<212>DNA〈213〉人工合成的<400>6ttagggttag ggttagggct ctct24<210>7<211>24<212>DNA
權(quán)利要求
1.Toll樣受體調(diào)節(jié)性寡核苷酸，其特征在于該寡核苷酸是由CCT重復(fù)單位(CCT)n的序列組成，或由CT重復(fù)單位(CT)n的序列組成，或由TC重復(fù)單位(TC)n的序列組成，其中的C是胞嘧啶，T是胸腺嘧啶，n是2-50的整數(shù)，是重復(fù)單位的個數(shù)。
2.權(quán)利要求I所述的寡核苷酸，其中該寡核苷酸是SEQID NO :1-16所不的序列之一。
3.權(quán)利要求I所述的寡核苷酸，其中該寡核苷酸是序列為SEQID NO I 5 ' -ctctctctctctctctctct-3’ 所不的寡核苷酸，或者是 SEQ ID NO 16 5’ -tctctctctctctctctctctctc-3’ 所不的寡核苷酸。
4.權(quán)利要求I或3任一項所述的寡核苷酸用于制備用于通過拮抗TOLL樣受體TLR的激活來治療或預(yù)防免疫介導(dǎo)的疾病的藥物的用途，所述疾病是擴張型心肌病，糖尿病或系統(tǒng)性紅斑狼瘡。
5.按照權(quán)利要求4所述的用途，其中的寡核苷酸是單獨應(yīng)用或與藥學可接受的載體一起使用。
6.按照權(quán)利要求4所述的用途，其中所述藥物為適于經(jīng)腸內(nèi)，腸外，外用和吸入施用的形式。
7.按照權(quán)利要求4所述的用途，其中所述藥物的施用對象是脊椎動物。
8.按照權(quán)利要求4所述的用途，其中所述藥物的施用對象是人。
9.按照權(quán)利要求4所述的用途，其中所述的寡核苷酸作為藥物組合物中的有效成分進行使用。
10.按照權(quán)利要求4所述的用途，其中所述的寡核苷酸在給予個體時可以單獨使用，或自身聯(lián)合使用，或與一種或幾種其他的活性物質(zhì)聯(lián)合使用。
11.按照權(quán)利要求4所述的用途，其中所述的寡核苷在給予個體時可以單獨應(yīng)用或/和遞送載體聯(lián)合應(yīng)用。
12.按照權(quán)利要求4所述的用途，其中所述的寡核苷酸通過用來在體外處理個體免疫細胞，再將處理過的細胞回輸給同一個體來使用。
13.按照權(quán)利要求4所述的用途，其中所述的寡核苷酸的應(yīng)用劑量為治療有效劑量。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種Toll樣受體調(diào)節(jié)性寡核苷酸及其功能性類似物以及應(yīng)用該寡核苷酸及其功能性類似物在用于預(yù)防和治療免疫介導(dǎo)的疾病中的用途。這個發(fā)明提供的寡核苷酸含有CT重復(fù)序列[(CT)n]或CCT重復(fù)序列[(CCT)n]或TC重復(fù)序列[(TC)n]，或為富含CT或CCT或TC的寡核苷酸。免疫介導(dǎo)的疾病包括自身免疫性疾病、移植排斥、超敏反應(yīng)、微生物過強刺激宿主免疫系統(tǒng)引起的疾病和TOLL樣受體激活相關(guān)性疾病。
文檔編號A61K31/7088GK102851295SQ20121027521
公開日2013年1月2日 申請日期2007年2月7日 優(yōu)先權(quán)日2006年8月28日
發(fā)明者王麗穎, 胡大利, 于永利 申請人:長春華普生物技術(shù)有限公司