專利名稱：一種抗菌劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域。特別涉及一種抗菌劑及其制備方法。
背景技術(shù)：
抗生素是用于治療各種細(xì)菌感染或抑制致病微生物感染的藥物。重復(fù)使用一種抗生素可能會(huì)使致病菌產(chǎn)生耐藥性。目前，人們對(duì)抗生素的高使用頻率和高使用劑量使得細(xì)菌耐藥性問題越來越突出。為防止和減少致病菌耐藥性的產(chǎn)生，一方面我們應(yīng)堅(jiān)持合理用
藥，杜絕濫用抗生素，另一方面要不斷改進(jìn)和研制新的抗菌藥物?？咕氖菑V泛分布于生物體內(nèi)的一類多肽分子，分子量通常為200(T7000Da左右，由2(Γ60個(gè)氨基酸殘基組成。抗菌肽具有廣譜抗菌活性，對(duì)細(xì)菌有很強(qiáng)的殺傷作用，尤其是其對(duì)某些耐藥性病原菌的殺滅作用更引起了研究者的關(guān)注。另外，人們還發(fā)現(xiàn)，某些抗菌肽對(duì)部分病毒、真菌、原蟲和癌細(xì)胞等具有殺滅作用，甚至能提高免疫力、加速傷口愈合等過程。因此，抗菌肽的廣泛的生物學(xué)活性顯示了其在醫(yī)學(xué)上良好的應(yīng)用前景?？咕脑谧匀唤缰袕V泛存在，人們相繼從細(xì)菌、真菌、兩棲類、昆蟲、高等植物、哺乳動(dòng)物乃至人類中發(fā)現(xiàn)并分離獲得了抗菌肽。但目前抗菌肽的提取過程費(fèi)時(shí)、工藝復(fù)雜、費(fèi)用昂貴、產(chǎn)量低，無法實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)，這成為制約抗菌肽進(jìn)入實(shí)際應(yīng)用的最大障礙。因此，開展抗菌肽基因工程研究具有重要意義。目前，已進(jìn)入臨床應(yīng)用的基因工程藥物多數(shù)是采用原核表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)的，但由于抗菌肽對(duì)細(xì)菌的殺傷作用，不能用原核表達(dá)系統(tǒng)直接表達(dá)具有生物活性的抗菌肽。國(guó)內(nèi)研究者大量研究表明，利用酵母表達(dá)抗菌肽是一條可行的道路，但表達(dá)廣率仍有待進(jìn)一步提聞。芋螺毒素(conotoxin，CTL)是由海洋軟體動(dòng)物芋螺(CbflM)分泌的一類用于自衛(wèi)和捕食的活性肽類毒素，能特異性地作用于鉀、鈉、鈣等離子通道、細(xì)胞膜上的各種神經(jīng)遞質(zhì)和激素的受體，從而干擾細(xì)胞或神經(jīng)中的信號(hào)傳遞。芋螺毒素分子質(zhì)量小，通常由1(Γ30個(gè)氨基酸殘基組成。研究發(fā)現(xiàn)，盡管芋螺毒素種類繁多，序列多變，但它們的信號(hào)肽序列卻非常保守。同時(shí)，成熟肽中富含半胱氨酸，具有高度保守的二硫鍵骨架。1992年，Eldridge等人在苜猜尺蠖核型多角體病毒californica multiplenucleopolyhedrovirus,AcMNPV)中發(fā)現(xiàn)了一種與芋螺毒素結(jié)構(gòu)非常類似的小分子肽,根據(jù)其保守的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)命名為類芋螺毒素(conotoxin-like，CTL)。序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，在目前已測(cè)序的桿狀病毒中超過三分之一的病毒含有基因。但到目前為止，還沒有研究揭示其在體內(nèi)和體外的任何功能。我們利用PCR技術(shù)從AcMNPV中克隆到ctl基因，進(jìn)而構(gòu)建重組桿狀病毒，感染離體昆蟲細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)胞外產(chǎn)物對(duì)金黃色葡萄球菌、微球菌、短小芽孢桿菌等多種臨床致病菌具有抑制活性，在醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種抗菌劑及其制備方法。
本發(fā)明公開了一種含有ctl基因、啟動(dòng)子的中間載體pFastBac-Piel-ctl,它的結(jié)構(gòu)如圖2所示。所述中間載體pFastBac-Piel-ctl是通過下述方法構(gòu)建得到
(1)根據(jù)苜蓿尺蠖核型多角體病毒(AcMNPV)的基因設(shè)計(jì)一對(duì)引物，以AcMNPV基因組DNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為94°C 4min ； 94°C 20s, 62°C 30s, 72 V30s, 30個(gè)循環(huán)；72°C 7min。瓊脂糖凝膠電泳后進(jìn)行膠回收，將基因連入pMD18_T形成重組質(zhì)粒pMD18-T_ctl ；
(2)利用SnaBI和BamHI將家蠶核型多角體病毒(BmNPV)的Piel啟動(dòng)子取代pFastBacl上原有的多角體基因啟動(dòng)子，得到pFastBacl-Piel ；用BamHI和KpnI切割重組質(zhì)粒pMD18-T-ctl，回收ctl片段，克隆到經(jīng)同樣雙酶切的pFastBacl-Piel，將基因置于Piel啟動(dòng)子下游，構(gòu)建出中間載體pFastBac-Piel-ctl。本發(fā)明所述抗菌劑，通過以下步驟制備得到
Cl)制備含有類芋螺毒素(Ci7)基因的中間載體PFastBac-Piel-ctl，所述中間載體包括來自家蠶核型多角體病毒(BmNPV)早期啟動(dòng)子朽W、來自苜蓿尺蠖核型多角體病毒(AcMNPV)的 ctl 基因；
(2)將所述的中間載體轉(zhuǎn)化含桿粒DNA的大腸桿菌DHlOB菌株，經(jīng)轉(zhuǎn)座后，通過藍(lán)白斑篩選含有重組桿粒的大腸桿菌，提取含ctl基因的重組桿粒DNA ;用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑將所述的重組桿粒DNA轉(zhuǎn)染離體培養(yǎng)的昆蟲細(xì)胞，收集含有ctl基因的重組病毒BV粒子的細(xì)胞培養(yǎng)液，作為重組病毒的種子液；
(3)以病毒種子液感染大量培養(yǎng)的昆蟲細(xì)胞，感染3飛天后，離心收集細(xì)胞培養(yǎng)物的上清液，直接作為抗菌劑。昆蟲-桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)是基因工程四大表達(dá)系統(tǒng)之一，以該系統(tǒng)表達(dá)外源蛋白時(shí)，產(chǎn)量高。本發(fā)明所用的類芋螺毒素基因(Ci7)來源于桿狀病毒，利用桿狀病毒能感染的昆蟲細(xì)胞生產(chǎn)CTL類抗菌劑，有利于表達(dá)產(chǎn)物形成具有生物活性的天然結(jié)構(gòu)。此外，桿狀病毒只感染鱗翅目等無脊椎動(dòng)物，對(duì)人畜無害，因此，本發(fā)明生產(chǎn)的抗菌劑具有很高的安全性。


圖I :重組桿狀病毒的構(gòu)建。A :PCR擴(kuò)增基因；B :中間載體pFastBac-Piel-ctl酶切鑒定；C :重組病毒的PCR鑒定。Ml DL2000 ；Μ2 λ-HindIII ；1 基因的PCR產(chǎn)物；2 =BamHI/KpnI雙酶切；3 =SnaBI/BamHI雙酶切；4 :重組病毒的PCR鑒定；5 :野生型病毒對(duì)照。圖2 :中間載體 pFastBac-Piel-ctl 圖譜。圖3 =AcMNPV CTL抑菌實(shí)驗(yàn)。A :金黃色葡萄球菌，B :微球菌，C :短小芽孢桿菌；1 野生型AcMNPV (100 Ug總蛋白)，2 :氨芐青霉素(10 μ g)，3 5 :重組AcMNPV (分別為50，100，150 1^總蛋白)。
具體實(shí)施例方式在本發(fā)明中所使用的術(shù)語(yǔ)，除非有另外說明，一般具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的含義。下面結(jié)合具體的實(shí)施例，并參照數(shù)據(jù)進(jìn)一步詳細(xì)地描述本發(fā)明。這些實(shí)施例只是為了舉例說明本發(fā)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例一中間載體pFastBac-Piel-ctl的構(gòu)建 UAcMNPV基因組中基因的克隆與鑒定
根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)AcMNPV基因組的中基因序列(Gene ID: 9627745)設(shè)計(jì)并合成一對(duì)引物(PI : 5 ’ -AGGGGATCCATGCAAATCAAAACTGTAC-3，(SEQ ID NO. I) :P2 :5’ -TGGGGTACCTTGTGGTAAGCAATMTTAAATATG-3’ (SEQ ID NO. 2)，下劃線部分為BamHI 和KpnI 的酶切位點(diǎn))。以AcMNPV基因組DNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件為94°C 4min ； 94°C 20s，62°C 30s, 72 V 30s, 30個(gè)循環(huán)；72°C 7min。2%瓊脂糖凝膠電泳(見圖1A)，切膠回收目的片段，直接與PMD18-T (TAKARA公司)16°C過夜連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5 α菌株，經(jīng)PCR和酶切鑒定出陽(yáng)性重組質(zhì)粒pMD18-T-ctl，并進(jìn)行DNA測(cè)序鑒定。2、中間載體pFastBac-Piel-ctl的構(gòu)建與鑒定
根據(jù)家蠶核型多角體病毒(BmNPV)基因組的中iel基因啟動(dòng)子序列設(shè)計(jì)并合成一對(duì)引物(P3 :5’-TCTTACGTAGATTTGCAGTTCGGGACATAA-3，(SEQ ID NO. 3))(P4 :5，-GTTCAGGATCCTGTCGCCGCCAATGTCA-3’(SEQ ID NO. 4))，下劃線部分為 SnaBI 和 BamHI 的酶切位點(diǎn)。以 BmNPV基因組DNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件如上所述，PCR產(chǎn)物經(jīng)SnaBI/BamHI雙酶切后取代中間載體pFastBacl( Invitrogen公司)上原有的多角體基因啟動(dòng)子,形成具有Piel啟動(dòng)子的中間載體pFastBacl-Piel。將pMD18-T-ctl用BamHI和KpnI酶切后，回收ctl片段，然后克隆到pFastBacl-Piel的BamHI-KpnI位點(diǎn)，所構(gòu)建的中間載體pFastBac-Piel-ctl的圖譜見圖2。采用雙酶切法鑒定中間載體用SnaBI和BamHI進(jìn)行雙酶切，可切出一條621bp的啟動(dòng)子片段；用BamHI和KpnI雙酶切，可切出一條159bp的基因片段(見圖1B)。實(shí)施例二重組桿狀病毒的構(gòu)建 I、重組桿狀病毒的構(gòu)建與鑒定
取5 μ L pFastBacl-Piel-ctl轉(zhuǎn)化含有AcMNPV的大腸桿菌DHlOB菌株，或轉(zhuǎn)化含有BmNPV的大腸桿菌DHlOB菌株，轉(zhuǎn)化后涂布于LBac平板，37°C靜止培養(yǎng)24 48 h，使藍(lán)斑顯色充分，挑取白色菌落，進(jìn)一步在LBac平板上劃線純化。將純化的白色菌落接種于LB液體培養(yǎng)基(含卡那霉素、四環(huán)素、慶大霉素)，37°C振蕩培養(yǎng)18 20h，提取重組AcMNPV或BmNPV的 DNA，使用 M13 通用引物(P5 :5’ -CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’ (SEQ ID NO. 5) ；P6 5’-AGCGGATAACAATTTCACACGGGA -3’ (SEQ ID NO. 6))進(jìn)行 PCR 鑒定，擴(kuò)增大小約為 2. 9kbp(見圖1C)。2、重組桿狀病毒BV粒子的獲得
27°C培養(yǎng)離體的Tn細(xì)胞或BmN細(xì)胞，每3天更換新鮮培養(yǎng)液一次。使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，將重組AcMNPV轉(zhuǎn)染Tn細(xì)胞，或?qū)⒅亟MBmNPV轉(zhuǎn)染BmN細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)3飛天，低速離心收集細(xì)胞上清液，上清液中含有大量重組病毒的BV粒子，作為重組病毒種子液。實(shí)施例三抗菌劑的制備及活性檢測(cè) I、抗囷劑的制備
將上述種子液接種于大量培養(yǎng)的Tn細(xì)胞或BmN細(xì)胞，感染3飛天后，低速離心，收集上清液，作為抗菌劑。2、抗菌劑活性的檢測(cè)采用Bradford法檢測(cè)抑菌劑中蛋白質(zhì)的含量，取不同蛋白質(zhì)質(zhì)量的抑菌劑，在LB平板上檢測(cè)其對(duì)金黃色葡萄球菌、微球菌、短小芽孢桿菌等的抗菌活性，抗菌活性以相對(duì)抑制率為指標(biāo)
相對(duì)抑制率=新型抑菌劑的抑菌圈直徑/IOPg氨芐青霉素的抑菌圈直徑X100%
權(quán)利要求
1.一種含有cW基因、啟動(dòng)子的中間載體pFastBac-Piel-ctl，其特征在于，它的結(jié)構(gòu)如圖2所示，它通過下述步驟構(gòu)建得到 (1)根據(jù)苜蓿尺蠖核型多角體病毒的^7基因設(shè)計(jì)引物，以苜蓿尺蠖核型多角體病毒基因組DNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳及膠回收后，將ctl基因連入PMD18-T，形成含有ctl基因的重組質(zhì)粒pMD18-T-ctl ； (2)利用SnaBI和BamHI將家蠶核型多角體病毒的Piel啟動(dòng)子取代pFastBacl上原有的多角體基因啟動(dòng)子，得到pFastBacl-Piel ；用BamHI和KpnI切割重組質(zhì)粒pMD18-T_ctl，回收ctl基因片段，克隆到pFastBacl-Piel，構(gòu)建含有ctl基因的中間載體pFastBac-Piel-ctlo
2.一種抗菌劑，其特征在于通過下述步驟制得 (1)將權(quán)利要求I所述中間載體pFastBac-Piel-ctl轉(zhuǎn)化含桿粒DNA的大腸桿菌DHlOB菌株，經(jīng)轉(zhuǎn)座后，通過藍(lán)白斑篩選含有重組桿粒的大腸桿菌，提取含ctl基因的重組桿粒DNA ;用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑將所述的重組桿粒DNA轉(zhuǎn)染離體培養(yǎng)的昆蟲細(xì)胞，收集含有ctl基因的重組病毒BV粒子的細(xì)胞培養(yǎng)液，作為重組病毒的種子液； (2)以病毒種子液感染大量培養(yǎng)的昆蟲細(xì)胞，感染3飛天后，離心收集細(xì)胞培養(yǎng)物的上清液，得到抗菌劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抗菌劑及其制備方法。采用PCR技術(shù)從苜蓿尺蠖核型多角體病毒(AcMNPV)中克隆類芋螺毒素基因(ctl)，構(gòu)建中間載體pFastBac-Pie1-ctl，經(jīng)轉(zhuǎn)座后構(gòu)建含有ctl基因的重組桿狀病毒，感染離體培養(yǎng)的昆蟲細(xì)胞，離心收集細(xì)胞外表達(dá)產(chǎn)物，胞外表達(dá)產(chǎn)物對(duì)金黃色葡萄球菌、微球菌、短小芽孢桿菌等多種臨床致病菌具有抑制活性。本發(fā)明借助昆蟲-桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)高效表達(dá)CTL類抗菌劑，安全性高，在醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)A61K39/12GK102787138SQ20121027594
公開日2012年11月21日 申請(qǐng)日期2012年8月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月6日
發(fā)明者何華綱, 曹青, 朱姍穎, 王文兵 申請(qǐng)人:江蘇大學(xué)