專利名稱：一種靶向抑制POLD1基因表達(dá)的siRNA序列的制作方法
—種靶向抑制P0LD1基因表達(dá)的siRNA序列
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)與生物醫(yī)藥領(lǐng)域，尤其涉及一種靶向抑制POLDl基因表達(dá)的siRNA序列。
背景技術(shù)：
DNA復(fù)制是細(xì)胞正常分裂、增殖的關(guān)鍵一步。DNA聚合酶δ (ρο δ )是真核生物DNA復(fù)制的最主要復(fù)制酶，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，ρο δ由4個(gè)亞基組成，分別是ρ125、ρ50、ρ68、ρ12。ρ125亞基是它的催化亞基，具有5' -3'聚合酶活性和3' -5'核酸外切酶活性，這使該酶在DNA復(fù)制、修復(fù)、維持基因組穩(wěn)定性、重組及細(xì)胞周期調(diào)控中都起到重要作用。癌的惡性增殖需要DNA的大量復(fù)制滿足其持續(xù)的細(xì)胞分裂活動(dòng)。近年來，ρο δ與細(xì)胞癌變之間的關(guān)系逐漸被研究者重視。國(guó)內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，Ρ125的表達(dá)與肝腫瘤的惡性程度、腫瘤細(xì)胞分化程度、靜脈侵襲和肝內(nèi)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。Ρ125高表達(dá)的肝癌細(xì)胞系Ifep3B和H印G2 的侵襲能力明顯強(qiáng)于P125低表達(dá)的Huh7細(xì)胞系。pl25的表達(dá)與POLDlmRNA(P0LDI是編碼DNA聚合酶δ催化亞基ρ125的基因)表達(dá)呈正相關(guān)，在轉(zhuǎn)錄水平上沉默POLDl基因表達(dá)，能明顯降低肝癌細(xì)胞的侵襲能力。POLDl基因是多種增殖性調(diào)控基因最終產(chǎn)生效應(yīng)的基因，也可能自身的變化就是細(xì)胞癌變的重要原因。在肝癌細(xì)胞H印G2中，POLDl基因的第472密碼子由酪氨酸突變?yōu)榻M氨酸；乳腺癌易感基因BRCA1/2的熱點(diǎn)突變區(qū)就潛伏在POLDl基因上；P0LD1基因的突變使乳腺癌的發(fā)生率增加了 2倍。在小鼠體內(nèi)將POLDl基因一個(gè)等位基因的ExoII功能區(qū)D400位點(diǎn)突變后，能夠誘發(fā)小鼠淋巴癌及上皮癌。此外，在結(jié)腸癌、宮頸癌中也發(fā)現(xiàn)了 POLDl基因的高表達(dá)。因此，通過進(jìn)一步研究闡明POLDl基因表達(dá)或pl25功能活性被抑制后直接阻斷癌細(xì)胞增殖的機(jī)理，分離鑒定阻斷癌細(xì)胞異常增殖的有效作用靶點(diǎn)，為新藥開發(fā)提供最確切的理論依據(jù)。小RNA干擾(small interference RNA, RNAi)技術(shù)是近幾年發(fā)展起來的一種阻抑基因表達(dá)的新方法。RNAi作用的高度特異性，有可能特異地抑制致病的突變等位基因，但又不影響正常等位基因功能，所以RNAi在基因治療上有廣闊的應(yīng)用前景。RNAi作用機(jī)制是雙鏈RNA(dsRNA)導(dǎo)入細(xì)胞后，在Dicer酶的作用下，降解為21_23bp，3’端帶有2個(gè)突出堿基的siRNA,并與細(xì)胞內(nèi)核酸內(nèi)外切酶、解鏈酶、Argonaute蛋白等結(jié)合,形成具有多個(gè)亞單元的核糖核苷酸蛋白復(fù)合物-RISC(RNA-inducing silencing complex),高效遞進(jìn)式介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)源性的同源mRNA的降解。哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)，導(dǎo)入長(zhǎng)雙鏈RNA可導(dǎo)致基因表達(dá)廣泛抑制，直接應(yīng)用短雙鏈的siRNA同樣高效介導(dǎo)RNAi，并避免非特異性基因抑制效應(yīng)。且短雙鏈siRNA通過化學(xué)方法易合成，操作簡(jiǎn)便、轉(zhuǎn)染效率高，對(duì)細(xì)胞的或者組織的毒副作用小，可大規(guī)模制備，臨床應(yīng)用方便，在藥物開發(fā)方面具有不可替代的優(yōu)勢(shì)。但是，由于siRNA的堿基分布，兩端自由能大小及靶mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)等因素的影響，靶向同一基因mRNA不同靶點(diǎn)的siRNA，封閉基因表達(dá)的效果明顯不同。在siRNA沉默特定基因的實(shí)驗(yàn)中，為保證siRNA能高效降解靶mRNA，一般需要針對(duì)靶基因設(shè)計(jì)合成多條不同序列的siRNA，從中篩選出有效序列。有效siRNA序列的設(shè)計(jì)篩選是siRNA介導(dǎo)RNAi實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵點(diǎn)之一。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于提供一種靶向抑制人POLDl基因表達(dá)的siRNA序列，能聞效抑制POLDl基因的表達(dá)，從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)、增殖和運(yùn)動(dòng)轉(zhuǎn)移，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞死亡。本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的一種靶向抑制人POLDl基因表達(dá)的siRNA序列，所述siRNA序列包括下述八條序列中的至少一條POLDlsiRNAl 序列，其正義鏈為 5’ CCCACCAUCAGCCAUAGAU3’，其反義鏈 5’ 為AUCUAUGGCUGAUG⑶GGG3，； P0LDlsiRNA2 序列，其正義鏈為 5’ GUUGGAGAUUGACCAUUAU3’，其反義鏈為5， AUAAUG⑶CAAUCUCCAAC3，；P0LDlsiRNA3 序列，其正義鏈為 5’ CCACCUUCAUCCGUAUCAU3’，其反義鏈為5， AUGAUACGGAUGAAG⑶GG3，；P0LDlsiRNA4 序列，其正義鏈為 5’ CCGGUUACAACAUCCAGAA3’，其反義鏈為5，UUCUGGA腳腳AACCGG3，；P0LDlsiRNA5 序列，其正義鏈為 5’ CAGACCCUCAAGGUACAAA3’，其反義鏈為5，UU腳ACCUUGAGG⑶CUG3，；P0LDlsiRNA6 序列，其正義鏈為 5’ GCCUGACUGAGGAUCAGUUCA3’，其反義鏈為5， UGAACUGAUCCUCA⑶CAGGC3，；P0LDlsiRNA7 序列，其正義鏈為 5’ GGUGGAGUCUAAGUACACA3’，其反義鏈為5， UGUGUACUUAGACUCCACC3，；P0LDlsiRNA8 序列，其正義鏈為 5’ GGACCAGGGAGAAUUAAUA3’，其反義鏈為5， UAUUAAUUCUCCCUGGUCC3，。進(jìn)一步地，所述siRNA序列包括以下三條序列POLDlsiRNAl 序列，其正義鏈為 5’ CCCACCAUCAGCCAUAGAU3’，其反義鏈 5’ 為AUCUAUGGCUGAUG⑶GGG3，；P0LDlsiRNA2 序列，其正義鏈為 5’ GUUGGAGAUUGACCAUUAU3’，其反義鏈為5， AUAAUG⑶CAAUCUCCAAC3，；P0LDlsiRNA4 序列，其正義鏈為 5’ CCGGUUACAACAUCCAGAA3’，其反義鏈為5，UUCUGGA腳腳AACCGG3，。進(jìn)一步地，所述siRNA序列包括以下兩條序列POLDlsiRNAl 序列，其正義鏈為 5’ CCCACCAUCAGCCAUAGAU3’，其反義鏈 5’ 為AUCUAUGGCUGAUG⑶GGG3，；P0LDlsiRNA4 序列，其正義鏈為 5’ CCGGUUACAACAUCCAGAA3’，其反義鏈為5，UUCUGGA腳腳AACCGG3，。本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)首先，POLDl基因是腫瘤基因治療的良好靶點(diǎn)，應(yīng)用siRNA介導(dǎo)的RNAi技術(shù)可以比以往的任何手段更高效、特異、方便的抑制靶基因的表達(dá)。本發(fā)明提供能高效抑制POLDl基因表達(dá)的siRNA序列，并作用于腫瘤細(xì)胞，檢測(cè)POLDl siRNA抑制POLDl基因表達(dá)后，腫瘤細(xì)胞在增殖、運(yùn)動(dòng)轉(zhuǎn)移、細(xì)胞周期等方面的變化，為POLDl siRNA應(yīng)用于惡性腫瘤的臨床
治療奠定重要基礎(chǔ)。其次，本發(fā)明提供能高效抑制POLDl基因表達(dá)的siRNA序列，為POLDl基因功能的進(jìn)一步研究奠定重要基礎(chǔ)，從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)、增殖和運(yùn)動(dòng)轉(zhuǎn)移，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞死亡。通過研究癌細(xì)胞中對(duì)POLDl基因癌性表達(dá)和pl25功能活性癌性表現(xiàn)的抑制，尋找癌細(xì)胞增殖阻斷的靶點(diǎn)，為發(fā)展最有效的新的抗癌或抗細(xì)胞增殖性疾病藥物提供理論基礎(chǔ)。

下面參照附圖結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。圖I為MTT法檢測(cè)POLDlsiRNA抑制癌細(xì)胞增殖結(jié)果圖； 圖2為熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)POLDlsiRNA對(duì)POLDlmRNA表達(dá)的抑制作用結(jié)果圖；圖3A為蛋白質(zhì)電泳圖；圖3B為P125蛋白質(zhì)的相對(duì)表達(dá)量圖。圖4為顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化結(jié)果圖；圖5為HE染色觀察細(xì)胞核形態(tài)變化結(jié)果圖；圖6為克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖；圖7為Transwell檢測(cè)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)轉(zhuǎn)移能力結(jié)果圖；圖8為AnnexinV-PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡結(jié)果圖；圖9為PI單染，流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期結(jié)果圖。
具體實(shí)施方式本發(fā)明涉及一種靶向抑制人POLDl基因表達(dá)的siRNA序列，所述siRNA序列包括下述八條序列中的至少一條POLDI s iRNAI 序列，其正義鏈為 5 ’ CCCACCAUCAGCCAUAGAU3 ’，其反義鏈 5 ’ 為AUCUAUGGCUGAUG⑶GGG3，；P0LDlsiRNA2 序列，其正義鏈為 5’ GUUGGAGAUUGACCAUUAU3’，其反義鏈為5， AUAAUG⑶CAAUCUCCAAC3，；P0LDlsiRNA3 序列，其正義鏈為 5’ CCACCUUCAUCCGUAUCAU3’，其反義鏈為5， AUGAUACGGAUGAAG⑶GG3，；P0LDlsiRNA4 序列，其正義鏈為 5’ CCGGUUACAACAUCCAGAA3’，其反義鏈為5，UUCUGGA腳腳AACCGG3，；P0LDlsiRNA5 序列，其正義鏈為 5’ CAGACCCUCAAGGUACAAA3’，其反義鏈為5，UU腳ACCUUGAGG⑶CUG3，；P0LDlsiRNA6 序列，其正義鏈為 5’ GCCUGACUGAGGAUCAGUUCA3’，其反義鏈為5， UGAACUGAUCCUCA⑶CAGGC3，；P0LDlsiRNA7 序列，其正義鏈為 5’ GGUGGAGUCUAAGUACACA3’，其反義鏈為5， UGUGUACUUAGACUCCACC3，；P0LDlsiRNA8 序列，其正義鏈為 5’ GGACCAGGGAGAAUUAAUA3’，其反義鏈為5， UAUUAAUUCUCCCUGGUCC3，。較優(yōu)的，所述siRNA序列包括以下三條序列POLDlsiRN Al 序列，其正義鏈為 5’ CCCACCAUCAGCCAUAGAU3’，其反義鏈 5’ 為AUCUAUGGCUGAUG⑶GGG3，；P0LDlsiRNA2 序列，其正義鏈為 5’ GUUGGAGAUUGACCAUUAU3’，其反義鏈為5， AUAAUG⑶CAAUCUCCAAC3，；P0LDlsiRNA4 序列，其正義鏈為 5’ CCGGUUACAACAUCCAGAA3’，其反義鏈為5，UUCUGGA腳腳AACCGG3，。較優(yōu)的，所述siRNA序列包括以下兩條序列POLDlsiRNAl 序列，其正義鏈為 5’ CCCACCAUCAGCCAUAGAU3’，其反義鏈 5’ 為AUCUAUGGCUGAUG⑶GGG3，；P0LDlsiRNA4 序列，其正義鏈為 5’ CCGGUUACAACAUCCAGAA3’，其反義鏈為5，UUCUGGA腳腳AACCGG3，。所述siRNA序列中的各正義鏈和反義鏈的3’端均以UU或dTdT為懸垂修飾。本發(fā)明siRNA序列的獲得方式如下根據(jù)生物信息學(xué)方法在genebank獲取人POLDlmRNA序列(LOCUS NM_002691. 2)，采用RNA structure分析軟件對(duì)POLDlmRNA序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，總結(jié)以往提出的siRNA設(shè)計(jì)原則，綜合分析其GC含量、兩端自由能大小、mRNA作用位點(diǎn)的二級(jí)結(jié)構(gòu)、siRNA對(duì)堿基偏愛性的要求等，設(shè)計(jì)siRNA系列。根據(jù)該軟件對(duì)設(shè)計(jì)出的siRNA系列的評(píng)價(jià)，進(jìn)一步采用NCBI GenBank(美國(guó)國(guó)立醫(yī)學(xué)圖書館和美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院編寫)提供的BLAST軟件，對(duì)選擇的靶序列進(jìn)行同源分析，排除siRNA非特異性地抑制其他基因片段的可能，初步篩選出8條siRNA序列，并委托上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司代為合成上述8條siRNA序列。所述8條siRNA序列的堿基序列、作用位點(diǎn)、GC含量以及評(píng)估等級(jí)如表I所示。表I
權(quán)利要求
1.一種靶向抑制人POLDl基因表達(dá)的SiRNA序列，其特征在于所述siRNA序列包括下述八條序列中的至少一條 POLDlsiRNAl 序列，其正義鏈為 5’ CCCACCAUCAGCCAUAGAU3’，其反義鏈 5’ 為AUCUAUGGCUGAUG⑶GGG3，； P0LDlsiRNA2序列，其正義鏈為5’ GUUGGAGAUUGACCAUUAU3’，其反義鏈為5， AUAAUG⑶CAAUCUCCAAC3，； P0LDlsiRNA3序列，其正義鏈為5’ CCACCUUCAUCCGUAUCAU3’，其反義鏈為5， AUGAUACGGAUGAAG⑶GG3，； P0LDlsiRNA4序列，其正義鏈為5’ CCGGUUACAACAUCCAGAA3’，其反義鏈為5，UUCUGGA腳腳AACCGG3，； P0LDlsiRNA5序列，其正義鏈為5’ CAGACCCUCAAGGUACAAA3’，其反義鏈為5，UU腳ACCUUGAGG⑶CUG3，； P0LDlsiRNA6 序列，其正義鏈為 5’ GCCUGACUGAGGAUCAGUUCA3’，其反義鏈為5， UGAACUGAUCCUCA⑶CAGGC3，； P0LDlsiRNA7序列，其正義鏈為5’ GGUGGAGUCUAAGUACACA3’，其反義鏈為5， UGUGUACUUAGACUCCACC3，； P0LDlsiRNA8序列，其正義鏈為5’ GGACCAGGGAGAAUUAAUA3’，其反義鏈為5， UAUUAAUUCUCCCUGGUCC3，。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種靶向抑制人POLDl基因表達(dá)的siRNA序列，其特征在于所述siRNA序列包括以下三條序列 POLDlsiRNAl 序列，其正義鏈為 5’ CCCACCAUCAGCCAUAGAU3’，其反義鏈 5’ 為AUCUAUGGCUGAUG⑶GGG3，； P0LDlsiRNA2序列，其正義鏈為5’ GUUGGAGAUUGACCAUUAU3’，其反義鏈為5， AUAAUG⑶CAAUCUCCAAC3，； P0LDlsiRNA4序列，其正義鏈為5’ CCGGUUACAACAUCCAGAA3’，其反義鏈為5，UUCUGGA腳腳AACCGG3，。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種靶向抑制人POLDl基因表達(dá)的siRNA序列，其特征在于所述siRNA序列包括以下兩條序列 POLDlsiRNAl 序列，其正義鏈為 5’ CCCACCAUCAGCCAUAGAU3’，其反義鏈 5’ 為AUCUAUGGCUGAUG⑶GGG3，； P0LDlsiRNA4序列，其正義鏈為5’ CCGGUUACAACAUCCAGAA3’，其反義鏈為5，UUCUGGA腳腳AACCGG3，。
4.根據(jù)權(quán)利要求I或2或3所述的一種靶向抑制人POLDl基因表達(dá)的siRNA序列，其特征在于所述siRNA序列中的各正義鏈和反義鏈的3’端均以UU或dTdT為懸垂修飾。
全文摘要
本發(fā)明提供一種靶向抑制人POLD1基因表達(dá)的siRNA序列，所述siRNA序列的正義鏈和反義鏈的3’端均以UU或dTdT為懸垂修飾，將本發(fā)明作用于腫瘤細(xì)胞，檢測(cè)POLD1基因被POLD1siRNA抑制后，腫瘤細(xì)胞在增殖、運(yùn)動(dòng)轉(zhuǎn)移及細(xì)胞周期方面的變化，經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR及蛋白質(zhì)免疫印跡方法檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)POLD1siRNA1、POLD1siRNA4可顯著下調(diào)POLD1 mRNA及蛋白水平的表達(dá)，并在人小細(xì)胞肺癌NCI-H446細(xì)胞上驗(yàn)證了設(shè)計(jì)合成的POLD1 siRNA對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖、運(yùn)動(dòng)轉(zhuǎn)移等生物學(xué)特性的影響，為POLD1 siRNA臨床應(yīng)用于腫瘤的治療奠定基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)A61K48/00GK102911938SQ20121027650
公開日2013年2月6日 申請(qǐng)日期2012年8月3日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月3日
發(fā)明者許瑞安, 張均平 申請(qǐng)人:華僑大學(xué)