專利名稱：銀花泌炎靈片在制備逆轉(zhuǎn)大腸埃希菌耐藥性藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，尤其是指銀花泌炎靈片的新的藥物用途。
背景技術(shù)：
銀花泌炎靈片，國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)WS3-526 (Z_107)-2003 (Z)0處方，金銀花，半枝蓮，扁蓄，瞿麥，石韋，川木通，車(chē)前子，淡竹葉，桑寄生，燈心草。本品為淡綠色糖衣片，除去糖衣后片芯呈深褐色，味微苦，澀。功能與主治，清熱解毒，利濕通淋，用于急性腎盂腎炎，急性膀胱炎，下焦?jié)駸嶙C，證見(jiàn)，發(fā)熱惡寒，尿頻急、尿道刺痛或尿血、腰痛等?？诜?，一次8片，一日4次，兩周為一個(gè)療程，可連服三個(gè)療程，或遵醫(yī)囑。 感染性疾病是威脅人們健康的疾病類型之一，大腸埃希菌引起的泌尿系感染的發(fā)病率居所有感染性疾病的首位。近年來(lái)，由于抗菌藥物的廣泛使用使耐藥細(xì)菌的種類和數(shù)量不斷增加，使臨床治療時(shí)間增長(zhǎng)，感染復(fù)發(fā)機(jī)會(huì)增加，給臨床治療感染性疾病帶來(lái)了嚴(yán)重的挑戰(zhàn)。銀花泌炎靈片等傳統(tǒng)抑菌中藥受到了廣泛認(rèn)可，隨著對(duì)抑菌中藥藥理機(jī)制的深入研究，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌耐藥機(jī)制主要包括編碼拓?fù)洚悩?gòu)酶IV和DNA解旋酶的基因發(fā)生突變；主動(dòng)外排系統(tǒng)的作用；抗菌藥物的滲透障礙；多重耐藥基因的突變；質(zhì)粒介導(dǎo)的耐藥機(jī)制。在所有細(xì)菌耐藥機(jī)制中以編碼拓?fù)洚悩?gòu)酶IV和DNA解旋酶的基因發(fā)生突變最為基礎(chǔ)和重要，拓?fù)洚悩?gòu)酶IV為兩個(gè)C亞基和兩個(gè)E亞基組成的四聚體，在DNA復(fù)制后期的姊妹染色單體分離過(guò)程中有極其重要的作用。拓?fù)洚悩?gòu)酶IV C亞基由parC基因編碼，負(fù)責(zé)DNA的斷裂和重組，由于編碼這種酶的基因發(fā)生點(diǎn)突變不能產(chǎn)生完整的酶亞基或編碼的酶亞基被氨基酸取代，可能會(huì)影響到喹諾酮類藥物和靶位的結(jié)合從而影響到藥物對(duì)細(xì)菌的敏感性。銀花泌炎靈片具有不易使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性的特點(diǎn)，但其與抗生素的聯(lián)合應(yīng)用能否逆轉(zhuǎn)細(xì)菌耐藥性尚未見(jiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種銀花泌炎靈片在制備逆轉(zhuǎn)耐藥性的藥物中的應(yīng)用，以解決抗菌藥物誘導(dǎo)耐藥菌的出現(xiàn)并使感染性疾病臨床治療時(shí)間增長(zhǎng)、感染復(fù)發(fā)機(jī)會(huì)增加的問(wèn)題。銀花泌炎靈片在制備逆轉(zhuǎn)左氧氟沙星壓力下誘導(dǎo)大腸埃希菌耐藥性的藥物中的應(yīng)用。銀花泌炎靈片在臨床治療泌尿系感染等疾病方面已得到臨床醫(yī)生的充分認(rèn)可，現(xiàn)該藥應(yīng)用廣泛，已成為治療耐藥性細(xì)菌引起的感染性疾病的首選藥物之一，但由于中藥化學(xué)成分的復(fù)雜性，其逆轉(zhuǎn)細(xì)菌耐藥性的機(jī)理很難研究。本發(fā)明分別在含有銀花泌炎靈片、左氧氟沙星和銀花泌炎靈片聯(lián)合左氧氟沙星的M-H肉湯培養(yǎng)基中對(duì)大腸埃希菌ATCC25922進(jìn)行連續(xù)傳代培養(yǎng)，比較壓力傳代前后各組細(xì)菌是否被誘導(dǎo)出耐藥性，并且通過(guò)聚合酶連反應(yīng)(PCR)技術(shù)擴(kuò)增細(xì)菌gyrA和parC基因并且測(cè)定堿基序列，觀察基因點(diǎn)突變情況，對(duì)銀花泌炎靈片可以逆轉(zhuǎn)抗生素誘導(dǎo)細(xì)菌耐藥性的機(jī)理做出科學(xué)解釋。結(jié)果表明左氧氟沙星連續(xù)傳代可誘導(dǎo)大腸埃希菌ParC基因發(fā)生基因突變，而在銀花泌炎靈片-左氧氟沙星聯(lián)合用藥組傳代的細(xì)菌并沒(méi)有產(chǎn)生parC基因的突變，這表明銀花泌炎靈片能逆轉(zhuǎn)抗生素使細(xì)菌產(chǎn)生的耐藥性。使用時(shí)，在正常使用左氧氟沙星治療時(shí)，同時(shí)根據(jù)患者的身體狀況，服用銀花泌炎靈片，一次21片，每日3 4次。
具體實(shí)施例方式下邊通過(guò)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明。I、材料與方法
I.I材料
I.I. I菌株來(lái)源大腸埃希菌ATCC 25922來(lái)自于吉林大學(xué)病原微生物研究室。I. I. 2實(shí)驗(yàn)藥品: 銀花泌炎靈片(吉林華康藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)101215);左旋氧氟沙星(浙江杭康藥業(yè)有限公司，批號(hào)20110605)
I.I. 3實(shí)驗(yàn)器材
生物安全柜(BHC-1300 II A/B3 AIRTECH)，紫外分光光度計(jì)(2800UV/VIS ,UNIC),高速低溫離心機(jī)(D-37520 Kendro)，PCR儀(EDC-810，東勝創(chuàng)新生物技術(shù)有限公司)。I. I. 4實(shí)驗(yàn)試劑
營(yíng)養(yǎng)瓊脂(北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠批號(hào)20111202), M-H肉湯培養(yǎng)基(北京雙旋微生物制品廠批號(hào)20111125),Easy Taq DNA polymerase、High Pure dNTPs、EasyTaq IOXBuffer (TRAAS), PCR Purification Kit (QIAGEN, German)。I. 2實(shí)驗(yàn)方法
I.2. I肉湯二倍稀釋法測(cè)定銀花泌炎靈片MIC
二倍肉湯稀釋法定量測(cè)定大腸埃希菌ATCC25922對(duì)銀花泌炎靈片的敏感性。M-H肉湯稀釋銀花泌炎靈片，將藥物稀釋為 400mg/ml、300mg/ml、200mg/ml、150mg/ml、100mg/ml、75mg/ml、50mg/ml，每毫升培養(yǎng)基中接入濃度為108CFU/ml大腸埃希菌500 yl。放入細(xì)菌培養(yǎng)箱37°C培養(yǎng)18-24小時(shí)。因?yàn)橹兴帨啙?，難以測(cè)定其OD值，故取IOOul混合液涂布于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng)18-24小時(shí)，第一個(gè)出現(xiàn)稀疏單菌落的平板即為MIC。I. 2. 2微量肉湯稀釋法測(cè)定左氧氟沙星MIC
微量肉湯稀釋法測(cè)定大腸埃希菌ATCC25922對(duì)左氧氟沙星的敏感性。在經(jīng)過(guò)滅菌處理的聚乙烯96孔板中稀釋左氧氟沙星，最高濃度為60ug/ml，倍比稀釋20個(gè)孔，每孔接入濃度為106Cfu/ml菌液100 iil，放入孵箱培養(yǎng)18-24小時(shí)，最后一個(gè)肉眼可見(jiàn)澄清的孔即為MIC。I. 2. 3藥物連續(xù)傳代壓力誘導(dǎo)下的細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生試驗(yàn)
分3組左氧氟沙星組、銀花泌炎靈片-左氧氟沙星聯(lián)合用藥組、空白對(duì)照組。左氧氟沙星組藥物濃度為0. 0075ug/ml ;聯(lián)合用藥組取兩種藥物MIC濃度；以不添加任何抗生素或中藥液的M-H肉湯培養(yǎng)基為空白對(duì)照。每12 h傳代I次，(首次細(xì)菌接入量為108cfu/ml)同時(shí)做菌落計(jì)數(shù)，公式參照N=3. 344X44/^0為傳代次數(shù)，N1為轉(zhuǎn)接細(xì)菌數(shù)，N2為培養(yǎng)12 h后的細(xì)菌數(shù))計(jì)算傳代倍數(shù)，培養(yǎng)至200代左右，傳代后接種在營(yíng)養(yǎng)瓊脂上分離細(xì)菌。1.2.4 DNA 提取水煮法提取不同藥物濃度中傳代得到的大腸埃希菌ATCC25922全基因組DNA序列。1.2.5 擴(kuò)增 gyrA、parC 基因
擴(kuò)增parC基因以ATCC25922全基因組為模版，用PCR技術(shù)擴(kuò)增編碼基因parC 的 DNA 片段，parC-5，(5，-GCGAATAAGTTGAGGAATCAG-3，)，par_3，，(5，-AGCTCGGAATAITTCGACAAC-3’)為引物。PCR 反應(yīng)體系A(chǔ)TCC25922 全基因組 2ul、parC-5’(5，-GCGAATAAGTTGAGGAATCAG-3，) 2ul、par_3，，(5，- AGCTCGGAATATTTCGACAAC-3，) 2ul、Easy Taq DNA polymerase lul、High Pnre dNTPs 4ul、雙蒸水 34ul 總反應(yīng)體系為 50ul。PCR產(chǎn)物擴(kuò)增預(yù)變性94°C 5分鐘，經(jīng)94°C I分鐘、56 °C 30秒、72 °C 30秒共30個(gè)循環(huán)，最后一個(gè)循環(huán)72°C延長(zhǎng)至10分鐘。擴(kuò)增gyrA基因以ATCC25922全基因組為模版，用PCR技術(shù)擴(kuò)增編碼基因 gyrA 的 DNA 片段，gyrA-5’(5，- TACACCGGTCAACAITGAGG-3’)，gyrA-3’，(5，- TTAATGATTGCCGCCGTCGG _3’)為引物。PCR 反應(yīng)體系A(chǔ)TCC25922 全基因組 2ul、gyrA-5’ (5’- TACACCGGTCAACATTGAGG -3’)2ul、gyrA_3’ ， (5’- TTAATGATTGCCGCCGTCGG_3，)2ul、Easy Taq DNA polymerase lul、High Pnre dNTPs 4ul、雙蒸水 34ul 總反應(yīng)體系為50ul。PCR產(chǎn)物擴(kuò)增預(yù)變性94°C 5分鐘，經(jīng)94°C I分鐘、56°C 30秒、72°C 30秒共30個(gè)循環(huán)，最后一個(gè)循環(huán)72°C延長(zhǎng)至10分鐘。1.2.6 PCR 產(chǎn)物純化
PCR Purification Kit (QIAGEN German)純化 PCR 產(chǎn)物，純化后產(chǎn)物總量為 50ul。產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定純化產(chǎn)物濃度。I. 2. 7 PCR產(chǎn)物基因測(cè)序
上海英駿生物技術(shù)有限公司北京測(cè)序部進(jìn)行PCR產(chǎn)物測(cè)序。2 結(jié)果
2.I大腸埃希菌ATCC25922經(jīng)藥物壓力下誘導(dǎo)耐藥實(shí)驗(yàn)結(jié)果
表I :左氧氟沙星對(duì)各組大腸埃希菌傳代前后的抑菌活性結(jié)果
權(quán)利要求
1.銀花泌炎靈片在制備逆轉(zhuǎn)左氧氟沙星壓力下誘導(dǎo)大腸埃希菌耐藥性的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及銀花泌炎靈片在制備逆轉(zhuǎn)大腸埃希菌耐藥性藥物中的應(yīng)用，屬于醫(yī)藥領(lǐng)域。銀花泌炎靈片在制備逆轉(zhuǎn)左氧氟沙星壓力下誘導(dǎo)大腸埃希菌耐藥性的藥物中的應(yīng)用。在銀花泌炎靈片-左氧氟沙星聯(lián)合用藥組傳代的細(xì)菌并沒(méi)有產(chǎn)生parC基因的突變，這表明銀花泌炎靈片能逆轉(zhuǎn)抗生素使細(xì)菌產(chǎn)生的耐藥性。
文檔編號(hào)A61K36/899GK102764386SQ20121027853
公開(kāi)日2012年11月7日 申請(qǐng)日期2012年8月8日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月8日
發(fā)明者劉傳貴, 張廣民, 杜鶴, 王放, 王槐棟, 胡亞, 胡廣, 董長(zhǎng)萍, 遲曉娟, 閆智力 申請(qǐng)人:吉林華康藥業(yè)股份有限公司