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疫苗組合物的制作方法

文檔序號:916500閱讀:441來源:國知局
專利名稱:疫苗組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及奈瑟氏球菌(Neisserial)免疫原性組合物和疫苗,它們的制備方法以及這種組合物在藥物中的用途。更具體而言,它涉及包括抗原組合的疫苗組合物,正如在保護測定法或血清殺菌測定法中所測量的那樣,其具有可使本發(fā)明的疫苗引發(fā)令人驚訝的良好免疫反應(yīng)的性質(zhì)。
置量
細(xì)菌中的奈瑟氏球菌菌株是很多人類病變的病原體,因此需要研制出可抗這些病原體的有效疫苗。特別是,淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)和腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseriameningitidis)所引起的病變可通過接種疫苗而治療。
淋病奈瑟氏球菌是淋病的病原體,淋病是全世界所報道的最常見的性傳播疾病之一,據(jù)估計每年有六千兩百萬個病例發(fā)病(Gerbase等人,1998 Lancet 351 ; (Suppl 3)2-4)。淋病的臨床表現(xiàn)包括泌尿生殖道、咽喉或直腸粘膜炎癥以及新生兒眼睛感染。婦女淋球菌(gonococcal)感染上升可導(dǎo)致不孕、子宮外妊娠、慢性盆腔炎和輸卵管-卵巢膿腫形成。敗血癥、關(guān)節(jié)炎、心內(nèi)膜炎和腦膜炎均 與并發(fā)性淋病有關(guān)。
大量淋球菌菌株對抗生素產(chǎn)生耐藥性導(dǎo)致發(fā)病率以及與淋病有關(guān)的并發(fā)癥增加。 用抗生素治療淋病的吸引人的替代方案是利用接種疫苗而預(yù)防淋病。目前還沒有抗淋病奈瑟氏球菌感染的疫苗。
腦膜炎奈瑟氏球菌是一種重要的病原體,特別是在兒童和年輕人中。敗血癥和腦膜炎是侵入性腦膜炎球菌病(MD)的最嚴(yán)重威脅生命的形式。這種疾病由于其較高的發(fā)病率和死亡率已經(jīng)成為全世界的健康問題。
根據(jù)莢膜多糖的抗原差異,已經(jīng)鑒定出了 13種腦膜炎奈瑟氏球菌血清組,最普遍的是A、B和C,它們導(dǎo)致全世界90%的該疾病。血清組B是歐洲、美國和拉丁美洲幾個國家中腦膜炎球菌病的最普遍原因。
已經(jīng)研制出了基于血清組A、C、W和Y的莢膜多糖的疫苗,它們表現(xiàn)出可控制腦膜炎球菌病的暴發(fā)(Peltola等人,1985 Pediatrics76 ;91_96)。然而,血清組B的免疫原性較差,且僅主要誘導(dǎo)IgM同種型的短暫抗體反應(yīng)(Ala’Aldeen D和Cartwright K 1996, J.1nfect. 33 ; 153-157)。因此,目前還沒有能夠抗導(dǎo)致絕大多數(shù)溫帶國家中大多數(shù)該疾病的血清組B腦膜炎球菌的廣泛有效的疫苗。尤為嚴(yán)重的是血清型B疾病在歐洲、澳洲和美洲的發(fā)生率日益增加,主要是在5歲以下的兒童中??寡褰MB腦膜炎球菌的疫苗的研制提出了一個特有的困難,即由于多糖莢膜與人神經(jīng)細(xì)胞粘著分子的免疫學(xué)相似性導(dǎo)致其免疫原性較差。將疫苗生產(chǎn)的方案集中于腦膜炎球菌外膜的表面外露結(jié)構(gòu),但卻被菌株之間這些抗原的顯著變異所阻礙。
進一步的研究采用由外膜小泡構(gòu)成的疫苗,其包括很多構(gòu)成細(xì)菌膜正常內(nèi)含物的蛋白。這些的其中之一是抗腦膜炎奈瑟氏球菌血清組B和C的YA-MENGOC-BC Cuban疫苗(Rodriguez 等人,1999 Mem Inst. Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro 94 ;433_440)。設(shè)計這種疫苗用來抗古巴的侵入性腦膜炎球菌病,這種病不能通過使用莢膜多糖AC疫苗進行的接種程序而被消除。流行的血清組是B和C,且VA-MENGOC-BC 疫苗已經(jīng)可以成功控制暴發(fā),據(jù)估計該疫苗抗腦膜炎奈瑟氏球菌血清組B菌株的效能為83% (Sierra等人,1990 In Neisseria, Walter Gruyter, Berlin, m. Atchman 等人(eds)p 129-134, Sierra 等人, 1991,NIPH Ann 14 ;195_210)。該疫苗可有效抗特異性暴發(fā),然而所引發(fā)的免疫反應(yīng)不能抗腦膜炎奈瑟氏球菌的其它菌株。
隨后在拉丁美洲,在由同源和異源血清組B腦膜炎球菌菌株引起的流行病過程中進行的功效研究已在年齡稍大的兒童和成人中表現(xiàn)出一些功效,但它的有效性在感染危險最大的、年齡較小的兒童中明顯偏低(Milagres等人,1994, Infect.1mmun. 62 ; 4419-4424)。這種疫苗在具有多菌株地方病的國家,如UK效果怎樣還不肯定。對抗異源菌株的免疫原性的研究僅證實了有限的交叉反應(yīng)性血清殺菌活性,特別是在嬰兒中(Tappeix) 等人,1999,JAMA 281 ;1520_1527)。
第二種外膜小泡疫苗是在挪威,使用在斯堪的納維亞流行的那些普遍血清型B 分離物研制的(Fredriksen等人,1991,NIPH Ann, 14 ;67_80)。該疫苗已在臨床試驗中進行了測試,并發(fā)現(xiàn)29個月后,它具有57%的保護功效(Bjune等人,1991,Lancet, 338 ; 1093-1096)。
然而,外膜小泡在疫苗中的使用與某些問題有關(guān)。例如,OMV包括有毒的脂多糖且它們可包括免疫顯性抗原,這些抗原或者是菌株特異性的,或者是可變表達(dá)的。已經(jīng)描述過的幾個方法都可用于克服外膜小泡制品疫苗的一些問題。WO 01/09350描述了例如通過降低毒性并修飾外膜小泡上存在的抗原而解決某些問題的方法。
WO 01/52885描述了把外膜小泡與其它抗原組合在一起的可能性且包括了超過 2,000種潛在的奈瑟氏球菌蛋白列表,從該列表可推測研制出對更寬血清型范圍都具有功效的疫苗。
目前所用的抗-腦膜炎球菌疫苗存在著多種問題?;诘鞍椎耐饽ひ呙鐑A向于特異性且僅對少數(shù)菌株有效。多糖疫苗也是次最優(yōu)的,這是因為它們傾向于引發(fā)較差且短暫的免疫反應(yīng),特別是對血清組B (Lepow等人 1986 ;Peltola 1998,Pediatrics 76 ;91_96)。
奈瑟氏球菌感染提出了一個重要的保健問題,即對淋病奈瑟氏球菌而言,還沒有可用的疫苗,或?qū)δX膜炎奈瑟氏球菌而言,僅有有限的抗異源菌株的功效和能力的疫苗。顯然需要研制抗奈瑟氏球菌感染更好的疫苗,它們能夠改善目前所用疫苗的功效并抗更大范圍的菌株。
附圖描述


圖1.-對由tbpA和hsf表達(dá)被上調(diào)的重組腦膜炎奈瑟氏球菌菌株制備的OMV中的TbpA和Hsf的檢測。通過用考馬斯亮藍(lán)染色的SDS-PAGE分析(4-20%梯度凝膠)分離 OMV 制品(10 μ g)。
圖2.-在大腸桿菌(E. coli)中產(chǎn)生的重組Hsf過客(passenger)結(jié)構(gòu)域的檢測, IOyg純化的Hsf過客蛋白(第2和3道)通過12% SDS-PAGE凝膠上分離,并與分子量標(biāo)記(第I道)相比較。
圖3. -Hap過客純度的分析,這是通過㈧考馬斯染色,⑶銀染,(C)抗-His 5蛋白質(zhì)印跡和(D)抗-大腸桿菌檢測的。10 yg純化抗原是在4-20%丙烯酰胺梯度凝膠上通過SDS-PAGE分離的。
圖4.-從腦膜炎奈瑟氏球菌菌株FAM20分離的FrpA和FrpC蛋白共有的序列相似性區(qū)。(A)腦膜炎奈瑟氏球菌菌株FAM20RTX蛋白FrpA和FrpC的結(jié)構(gòu)域組成。(B)從腦膜炎奈瑟氏球菌菌株H44/76獲得的FrpA/C擴增產(chǎn)物。
圖5.-重組Frp23(具有23個重復(fù)單位的FrpA/C保守區(qū))抗原在大腸桿菌中的表達(dá)。用對照載體(pET24d)或重組構(gòu)建體(分別為Frp3、Frp13和Frp23)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌BL21DE3的非誘導(dǎo)(NI)和誘導(dǎo)⑴的總細(xì)胞提取物的SDS-PAGE分析。用考馬斯藍(lán)(A) 將凝膠染色或?qū)⒛z轉(zhuǎn)移到硝化纖維素上并用抗_His6小鼠血清進行免疫檢測。
圖6.-在大腸桿菌中表達(dá)的FHAB 2/3rd片段的優(yōu)選DNA序列。
圖7.-來源于誘導(dǎo)大腸桿菌B121DE3提取物的重組FHAB 2/3rd的純化。(A)純化過程中的主要步驟。(B)對在純化過程不同步驟采樣的蛋白級分進行的SDS-PAGE分析。
圖8.-針對腦膜炎奈瑟氏球菌的FHAB 2/3r1、Hap、Hap過客結(jié)構(gòu)域、Hsf和Hsf過客結(jié)構(gòu)域抗原的抗-血清的粘附阻斷活性。
圖9.-表示Hsf、TbpA和NspA在來源于不同腦膜炎奈瑟氏球菌菌株的外膜小泡制品中的表達(dá)水平的考馬斯藍(lán)染色凝膠。第I道-分子量標(biāo)記;第2道-從莢膜多糖被下調(diào)的菌株H44/76制備的外膜小泡;第3道-從莢膜多糖和PorA被下調(diào)的菌株H44/76制備的外膜小泡;第4道-從莢膜多糖和PorA被下調(diào)且NspA被上調(diào)的菌株H44/76制備的外膜小泡;第5道-從莢膜多糖和PorA被下調(diào)且Hsf被上調(diào)的菌株H44/76制備的外膜小泡;第6 道-從莢膜多糖和PorA被下調(diào)且TbpA被上調(diào)的菌株H44/76制備的外膜小泡;第7道-從莢膜多糖和PorA被下調(diào)且TbpA和Hsf被上調(diào)的菌株H44/76制 備的外膜小泡;第8道-從莢膜多糖和PorA被下調(diào)且TbpA和NspA被上調(diào)的菌株H44/76制備的外膜小泡。
圖10. Hap過客純化流程。
本發(fā)明公開了奈瑟氏球菌抗原的特定組合,當(dāng)它們組合在一起時,可使疫苗抗奈瑟氏球菌感染的功效令人驚訝地提高。
奈瑟氏球菌感染要經(jīng)歷若干不同的階段。例如,腦膜炎球菌的生活周期包括鼻因定居、粘膜附著、進入血流、在血液中增殖、誘導(dǎo)中毒性休克、穿過血/腦屏障并在腦脊液和 /或腦脊膜中增殖。細(xì)菌表面上的不同分子參與感染周期的不同階段。通過使用有效量參與奈瑟氏球菌感染的不同過程特定抗原的組合產(chǎn)生免疫反應(yīng),可獲得具有令人吃驚的較高功效的奈瑟氏球菌疫苗。
具體而言,來源于不同種類的特定抗原的組合可引發(fā)針對感染多個階段的免疫反應(yīng),在這些不同種類的特定抗原中,有些參與附著到宿主細(xì)胞,有些參與鐵的獲得,有些是自體轉(zhuǎn)運蛋白而有些是毒素??乖倪@種組合可令人吃驚地提高(優(yōu)選協(xié)同提高)疫苗抗奈瑟氏球菌感染的功效,其中以最佳方式通過免疫反應(yīng)針對細(xì)菌的不止一個功能。
疫苗的功效可通過多種測定法評價。在動物模型中進行的保護測定法是本領(lǐng)域熟知的。此外,血清殺菌測定法(SBA)是最普遍認(rèn)可的免疫學(xué)標(biāo)記,以評價腦膜炎球菌疫苗的功效(Perkins 等人,J Infect Dis. 1998,177 :683-691)。
抗原的某些組合(例如,某些自體轉(zhuǎn)運蛋白和某些鐵獲得蛋白的組合)可導(dǎo)致動物模型測定法中的保護提高和/或協(xié)同產(chǎn)生更高的SBA效價。不希望受到理論的束縛,抗原的這種協(xié)同組合可通過抗原組合所產(chǎn)生免疫反應(yīng)的許多特性實現(xiàn)??乖旧碓谀紊锨蚓?xì)胞上通常是表面外露的,傾向于保守且未以最佳殺菌反應(yīng)所需的充足量存在于表面細(xì)胞上,該最佳殺菌反應(yīng)由單獨抗該抗原引起的抗體產(chǎn)生。將本發(fā)明抗原組合起來生產(chǎn)的制劑可導(dǎo)致殺菌抗體的有利組合,這些殺菌抗體與奈瑟氏球菌細(xì)胞的相互作用超出了臨界閾值。在這種臨界水平下,足量性質(zhì)良好的抗體與細(xì)菌表面結(jié)合,從而通過補體有效殺死細(xì)菌并因此見到更高水平的殺菌作用。
因為血清殺菌測定法(SBA)可密切反映疫苗候選物的功效,因此通過抗原組合獲得的良好SBA效價可很好地表征包括該抗原組合的疫苗的保護功效。本發(fā)明涉及分離的或與另一抗原共同富含于混合物中的兩種抗原組合的用途。當(dāng)組合在一起時,這種抗原組合有利地相互作用,且優(yōu)選協(xié)同引發(fā)殺菌活性更高的免疫反應(yīng)(正如在血清殺菌測定法或 SBA中所測量的那樣),且優(yōu)選高于由抗原單獨引發(fā)的加成反應(yīng),更優(yōu)選高于由至少1.2、1. 5、2、3、4、5、6、7、8、9個因子,最優(yōu)選由至少10個因子引發(fā)的加成反應(yīng)。
本發(fā)明的其它優(yōu)點在于免疫原性組合物中來源于不同蛋白家族的本發(fā)明抗原組合可抗更大范圍的菌株。
本發(fā)明涉及包括很多(兩種或多種)蛋白的免疫原性組合物,所述蛋白選自至少兩個不同種類的蛋白,它們在奈瑟氏球菌中具有不同的功能。這種蛋白種類的例子是粘附素、自體轉(zhuǎn)運蛋白、毒素、整合外膜蛋白和Fe獲得蛋白。本發(fā)明的疫苗組合在抗同源奈瑟氏球菌菌株(衍生抗原的菌株)且還優(yōu)選在抗異源奈瑟氏球菌菌株的疫苗功效方面顯示出令人吃驚的提聞。
本發(fā)明提供免疫原性組合物,它包括至少或恰好兩種、三種、四種、五種、六種、七種、八種、九種 或十種不同的抗原,這些抗原選自下列至少或恰好兩個、三個、四個或全部五個選自下述種類的抗原
至6夂一種奈瑟氏球菌粘附素;
至6>一種奈瑟氏球菌自體轉(zhuǎn)運蛋白;
至6夂一種奈瑟氏球菌毒素;
至6》一種奈瑟氏球菌Fe獲得蛋白;
至6>一種奈瑟氏球菌膜相關(guān)蛋白(優(yōu)選外膜蛋白,特別是整合外膜蛋白)。
優(yōu)選,本發(fā)明提供包括至少或恰好兩種、三種、四種、五種、六種、七種、八種、九種或十種不同奈瑟氏球菌抗原的免疫原性組合物。最優(yōu)選這些抗原選自下列的至少或恰好兩組、三組、四組或五組選自下述蛋白
·選自 FhaB、NspA, PilC, Hsf、Hap、MafA, MafB, 0mp26、NMB0315、NMB 0995、NMB 1119和NadA的至少一種奈瑟氏球菌粘附素;
選自Hsf、Hap、IgA蛋白酶、AspA和NadA的至少一種奈瑟氏球菌自體轉(zhuǎn)運蛋白;
·選自 FrpA、FrpC、FrpA/C、VapD、NM-ADPRT,以及 LPS 免疫型 L2 和 LPS 免疫型 L3 之一或兩者的至少一種奈瑟氏球菌毒素;
·選自 TbpA、TbpB, LbpA, LbpB, HpuA, HpuB, Lipo28 (GNA2132)、Sibp、NMB0964、 NMB0293、FbpA, Bcp、BfrA, BfrB和P2086 (XthA)的至少一種奈瑟氏球菌Fe獲得蛋白;或
·選自 PilQ、0MP85、FhaC、NspA、TbpA、LbpA、TspA、TspB、TdfH、PorB、MltA、HpuB、 HimD、HisD、GNA1870、0stA、HlpA(GNA1946)、NMB I124、NMB I162、NMB 1220、NMB 1313、NMB 1953、HtrA和PldA的至少一種奈瑟氏球菌膜相關(guān)蛋白,優(yōu)選外膜蛋白,優(yōu)選整合外膜蛋白。
本發(fā)明的抗原都是分離的,即它們被人工改變。優(yōu)選,它們被純化至某種程度,最優(yōu)選超過40、50、60、70、80、90、95或99%純度(與本發(fā)明免疫原性組合物的其它組分組合前)。
優(yōu)選本發(fā)明的免疫原性組合物包括至少一種奈瑟氏球菌粘附素和至少一種奈瑟氏球菌自體轉(zhuǎn)運蛋白且任選包括奈瑟氏球菌毒素、奈瑟氏球菌Fe獲得蛋白或奈瑟氏球菌膜相關(guān)蛋白(優(yōu)選整合外膜蛋白)。優(yōu)選所述抗原選自上述抗原。
優(yōu)選本發(fā)明的免疫原性組合物包括至少一種奈瑟氏球菌粘附素和至少一種奈瑟氏球菌毒素且任選包括奈瑟氏球菌自體轉(zhuǎn)運蛋白、奈瑟氏球菌Fe獲得蛋白或奈瑟氏球菌膜相關(guān)蛋白(優(yōu)選整合外膜蛋白)。優(yōu)選所述抗原選自上述抗原。
優(yōu)選本發(fā)明的免疫原性組合物包括至少一種奈瑟氏球菌粘附素和至少一種奈瑟氏球菌Fe獲得蛋白且任選包括奈瑟氏球菌毒素、奈瑟氏球菌自體轉(zhuǎn)運蛋白或奈瑟氏球菌膜相關(guān)蛋白(優(yōu)選整合外膜蛋白)。優(yōu)選所述抗原選自上述抗原。
優(yōu)選本發(fā)明的免疫原性組合物包括至少一種奈瑟氏球菌粘附素和至少一種奈瑟氏球菌膜相關(guān)蛋白(優(yōu)選整合外膜蛋白)且任選包括奈瑟氏球菌毒素、奈瑟氏球菌Fe獲得蛋白或奈瑟氏球菌自體轉(zhuǎn)運蛋白。優(yōu)選所述抗原選自上述抗原。
優(yōu)選本發(fā)明的免疫原性組合物包括至少一種奈瑟氏球菌自體轉(zhuǎn)運蛋白和至少一種奈瑟氏球菌毒素且任選包括奈瑟氏球菌粘附素、奈瑟氏球菌Fe獲得蛋白或奈瑟氏球菌膜相關(guān)蛋白(優(yōu)選整合外膜蛋白)。優(yōu)選所述抗原選自上述抗原。
優(yōu)選本發(fā)明的免疫原性組合物包括至少一種奈瑟氏球菌自體轉(zhuǎn)運蛋白和至少一種奈瑟氏球菌Fe獲得蛋白且任選包括奈瑟氏球菌粘附素、奈瑟氏球菌毒素或奈瑟氏球菌膜相關(guān)蛋白(優(yōu)選整合外膜蛋白)。優(yōu)選所述抗原選自上述抗原。
優(yōu)選本發(fā)明的免疫原性組合物包括至少一種奈瑟氏球菌自體轉(zhuǎn)運蛋白和至少一種奈瑟氏球菌膜相關(guān)蛋白(優(yōu)選整合外膜蛋白)且任選包括奈瑟氏球菌粘附素、奈瑟氏球菌Fe獲得蛋白或奈瑟氏球菌毒素。優(yōu)選所述抗原選自上述抗原。
優(yōu)選本發(fā)明的免疫原性組合物包括至少一種奈瑟氏球菌毒素和至少一種奈瑟氏球菌Fe獲得蛋白且任選包括奈瑟氏球菌粘附素、奈瑟氏球菌自體轉(zhuǎn)運蛋白或奈瑟氏球菌膜相關(guān)蛋白(優(yōu)選整合外膜蛋白)。優(yōu)選所述抗原選自上述抗原。
優(yōu)選本發(fā)明的免疫原性組合物包括至少一種奈瑟氏球菌毒素和至少一種奈瑟氏球菌膜相關(guān)蛋白(優(yōu)選整合外膜蛋白)且任選包括奈瑟氏球菌粘附素、奈瑟氏球菌自體轉(zhuǎn)運蛋白或奈瑟氏球菌毒素。優(yōu)選所述抗原選自上述抗原。
優(yōu)選本發(fā)明的免疫原性組合物包括至少一種奈瑟氏球菌Fe獲得蛋白和至少一種奈瑟氏球菌膜相關(guān)蛋白(優(yōu)選整合外膜蛋白)且任選包括奈瑟氏球菌粘附素、奈瑟氏球菌自體轉(zhuǎn)運蛋白或奈瑟氏球菌毒素。優(yōu)選所述抗原選自上述抗原。
優(yōu)選在本發(fā)明的免疫原性組合物中提供全部5組抗原。
當(dāng)具體提到蛋白時,優(yōu)選是天然、全長的蛋白及其天然變體(即, 從奈瑟氏球菌, 優(yōu)選腦膜炎球菌菌株獲得的天然蛋白),它還可包括其抗原性片段(特別是在亞單位疫苗中)。這些是含有或包括從蛋白氨基酸序列上連續(xù)獲取的至少10個氨基酸,優(yōu)選20個氨基酸,更優(yōu)選30個氨基酸,更優(yōu)選40個氨基酸或最優(yōu)選50個氨基酸的片段(此處常常具體描述的)。此外,抗原性片段是指與抗奈瑟氏球菌全長蛋白產(chǎn)生的抗體或通過用奈瑟氏球菌感染哺乳動物宿主產(chǎn)生的抗體進行免疫反應(yīng)的片段??乖云芜€包括當(dāng)以有效劑量施用時,可針對奈瑟氏球菌感染引發(fā)保護性免疫反應(yīng)的片段,更優(yōu)選它可防止腦膜炎奈瑟氏球菌和/或淋病奈瑟氏球菌感染,最優(yōu)選它可防止腦膜炎奈瑟氏球菌血清組B感染。
本發(fā)明還包括本發(fā)明奈瑟氏球菌蛋白的重組融合蛋白,或其片段。這些可將不同的奈瑟氏球菌蛋白或其片段組合在同一多肽中??蛇x擇性地,本發(fā)明還包括奈瑟氏球菌蛋白或其片段的個體融合蛋白,即具有異源序列,如T-細(xì)胞表位或純化標(biāo)記的供給者,例如 β -半乳糖苷酶、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶、綠色熒光蛋白(GFP)、附加表位如FLAG、myc標(biāo)記、聚組氨酸、或病毒表面蛋白如流感病毒血細(xì)胞凝集素、破傷風(fēng)類毒素、白喉類毒素、CRM197的融合蛋白。_2] 本發(fā)明的抗原
NMB參照符號是指可從www. neisseria, org訪問的序列參照符號。
1.粘附素
粘附素包括FhaB(WC) 98/02547)、NadA(J. Exp. Med (2002) 195 :1445 ;NMB 1994)、也可稱作 NhhA 的 Hsf (NMB 0992) (W0 99/31132)、Hap (NMB1985) (W0 99/55873)、 NspA(W096/29412), MafA(NMB 0652)和 MafB(NMB 0643) (Annu Rev Cell Dev Biol. 16 ; 423-457(2000) ;Nature Biotech 20 ;914-921 (2002)), 0mp26 (NMB 0181)、NMB 0315、NMB 0995、NMB 1119 和 PilC(Mol. Microbiol. 1997,23 ;879_892)。這些是參與奈瑟氏球菌與宿主細(xì)胞表面結(jié)合的蛋白。Hsf是粘附素的其中一個例子,同時也是自體轉(zhuǎn)運蛋白。因此本發(fā)明的免疫原性組合物可包括Hsf與其它自體轉(zhuǎn)運蛋白的組合,其中Hsf發(fā)揮其粘附素的作用。這些粘附素可來源于腦膜炎奈瑟氏球菌或淋病奈瑟氏球菌或其它奈瑟氏球菌菌株。本發(fā)明還包括來源于奈瑟氏球菌的其它粘附素。
FhaB
此抗原已在WO 98/02547SEQ ID NO :38 (核苷酸3083-9025)中描述-還可參見 NMB 0497。本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)FhaB在誘導(dǎo)單獨的抗-粘附抗體方面特別有效,且特別是與本發(fā)明其它抗原組合時。雖然可使用全長FhaB,本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)特定的C-末端截短物至少令人驚訝地有效且優(yōu)選甚至在對交叉-菌株的作用方面更有效。已經(jīng)有利地顯示出這種截短物更易克隆。本發(fā)明的FhaB截短物通常與FhaB分子的N-末端三分之二,優(yōu)選位于 1200-1600位置、更優(yōu)選1300-1500位置、最優(yōu)選1430-1440位置的新的C-末端相對應(yīng)。具體的實施方案在1433或1436處具有C-末端。因此,本發(fā)明的這種FhaB截短物和包括這種截短物的疫苗是本發(fā)明的獨立方面而且是本發(fā)明組合免疫原性組合物的組分。N-末端還可被截短達(dá)10、20、30、40或50個氨基酸。
2.自體轉(zhuǎn)運蛋白
自體轉(zhuǎn)運蛋白通常由信號序列、過客結(jié)構(gòu)域和用于附著外膜的錨定結(jié)構(gòu)域組成。自體轉(zhuǎn)運蛋白的例子包括 Hsf (W0 99/31132) (NMB0992)、HMW、Hia(van Ulsen 等人, Immunol. Med. Microbiol. 2001 32 ;53-64), Hap(NMB1985)(WO 99/55873 ;van Ulsen 等人,Tmmunol. Med. Microbiol. 2001 32 ;53_64)、UspA、UspA2、NadA (NMB1994) (Comanducci等人,J- Exp. Med. 2002195 1445-1454)、AspA (Infection and Immunity 2002, 70 (8); 4447-4461 ;NMB 1029)、Aida-1 樣蛋白、SSh-2 和 Tsh。NadA (J. Exp. Med (2002) 195 1445) 是自體轉(zhuǎn)運蛋白的另一個例子,同時也是粘附素。本發(fā)明的免疫原性組合物因此包括NadA 與粘附素的組合,其中NadA作為自體轉(zhuǎn)運蛋白發(fā)揮作用。這些蛋白可來源于腦膜炎奈瑟氏球菌或淋病奈瑟氏球菌或其它奈瑟氏球菌菌株。本發(fā)明還包括來源于奈瑟氏球菌的其它自體轉(zhuǎn)運蛋白。
Hsf
Hsf具有與自體轉(zhuǎn)運蛋白共用的結(jié)構(gòu)。例如,來源于腦膜炎奈瑟氏球菌菌株 H44/76的Hsf由氨基酸1-51組成的單一序列、表面外露且包括可變區(qū)(氨基酸52-106、 121-124、191-210和230-234)的成熟蛋白(氨基酸52-479)氨基末端的頭區(qū)、頸區(qū)(氨基酸480-509)、疏水的α -螺旋區(qū)(氨基酸518-529)和其中4個跨膜鏈跨越外膜的錨定結(jié)構(gòu)域(氨基酸539-591)。
雖然全長Hsf可用于本發(fā)明的免疫原性組合物中,但是各種Hsf截短物和缺失物也可有利地使用,這取決于疫苗的類型。
當(dāng)Hsf用于亞單位疫苗中時,優(yōu)選使用可溶性過客結(jié)構(gòu)域的一部分;例如氨基酸 52-479的完全結(jié)構(gòu)域,最優(yōu)選其保守部分,例如氨基酸134-479的特別有利的序列。Hsf的優(yōu)選形式可被截短,以缺失在WO 01/55182中公開的蛋白可變區(qū)。優(yōu)選的變體可包括在WO 01/55182中限定的1、2、3、4、或5個可變區(qū)的缺失。在N或C末端的任何一端或兩端,上述序列和下面描述的那些可被伸展或截短達(dá)1、3、5、7、10或15個氨基酸。
Hsf的優(yōu)選片段因此包括Hsf的整個頭區(qū),優(yōu)選包含氨基酸52-473。Hsf的其它優(yōu)選片段包括表面外露的頭區(qū),它包括一個或多個下列氨基酸序列52-62、76_93、116-134、 147-157、157-175、199-211、230-252、252-270、284-306、328-338、362-391、408-418、 430-440 和 469-479。
當(dāng)Hsf存在于外膜小泡制品中時,它可被表達(dá)為全長蛋白或優(yōu)選被表達(dá)為由氨基酸1-51和134-591的融合體組成 的有利變體(產(chǎn)生氨基酸序列134-C末端的成熟外膜蛋白)。Hsf的優(yōu)選形式可被截短,從而缺失WO 01/55182中公開的蛋白可變區(qū)。優(yōu)選的變體可包括在W001/55182中限定的1、2、3、4、或5個可變區(qū)的缺失。優(yōu)選第一和第二個可變區(qū)缺失。優(yōu)選的變體是使氨基酸序列52-237或54-237之間的殘基缺失,更優(yōu)選使氨基酸 52-133或55-133之間的殘基缺失。所述成熟蛋白可缺少信號肽。
Hap
對來源于腦膜炎奈瑟氏球菌的Hap-樣蛋白進行的計算機分析顯示出至少3個結(jié)構(gòu)域。以來源于菌株Η44/76的Hap-樣序列為例,包含氨基酸1_42的結(jié)構(gòu)域I編碼自體轉(zhuǎn)運蛋白家族特征性的sec依賴性信號肽,包含氨基酸43-950的結(jié)構(gòu)域2編碼很可能表面外露且易進入免疫系統(tǒng)的過客結(jié)構(gòu)域,包含殘基951-C末端(1457)的結(jié)構(gòu)域3被預(yù)測編碼可能裝配成桶-樣結(jié)構(gòu)且被錨定在外膜中的β_鏈。因為結(jié)構(gòu)域2可能是表面外露、良好保守的(在所有試驗菌株中超過80%)且可作為亞單位抗原在大腸桿菌中產(chǎn)生,因此它代表了目標(biāo)疫苗候選物。因為結(jié)構(gòu)域2和3很可能是表面外露且良好保守的(Pizza等人, (2000), Science 287 =1816-1820),因此它們代表了目標(biāo)疫苗候選物。結(jié)構(gòu)域2被稱作過客結(jié)構(gòu)域。
本發(fā)明的免疫原性組合物可包括全長Hap蛋白,優(yōu)選被摻入到OMV制品中。本發(fā)明的免疫原性組合物還可包括Hap的過客結(jié)構(gòu)域,在菌株H44/76中,其由氨基酸殘基43-950 組成。Hap的這一片段可特別有利地用于本發(fā)明的亞單位組合物中。在N或C末端的任何一端或兩端,Hap過客結(jié)構(gòu)域的上述序列可被伸展或截短達(dá)1、3、5、7、10、15、20、25、或30個氨基酸。
3.鐵獲得蛋白
鐵獲得蛋白包括TbpA(NMB 0461) (W0 92/03467,US5912336, W093/06861 和 EP 586266)、TbpB (NMB 0460) (W0 93/06861 和 EP 586266)、LbpA (NMB 1540) (Med Microbiol (1999) 32 :1117)、LbpB(Mffll541) (W0/99/09176)、HpuA(U73112. 2) (MoI Microbiol. 1997,23 ;737_749)、HpuB (NC. 003116.1)(MoI Microbiol. 1997,23 ;737_749)、 也被稱作 XthA 的 P2086 (NMB 0399)(13th International Pathogenic Neisseria Conference 2002)、FbpA (NMB 0634)、FbpB, BfrA (NMB 1207)、BfrB (NMB 1206)、也被稱作 GNA2132 的 Lipo28(NMB 2132)、Sibp(NMB1882)、HmbR、HemH、Bcp (NMB 0750)、Iron (III)ABC 轉(zhuǎn)運蛋白-通透酶蛋白(Tettelin 等人,Science 287 ;1809_1815 2000)、Iron (III) ABC 轉(zhuǎn)運蛋白-周質(zhì)(Tettelin 等人,Science 287 ;1809_1815 2000)、TonB 依賴性受體(NMB 0964和 NMB 0293) (Tettelin 等人,Science 287 ;1809_1815 2000)和轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合蛋白相關(guān)蛋白(Tettelin等人,Science 287 ;1809_1815 2000)。這些蛋白可來源于腦膜炎奈瑟氏球菌、淋病奈瑟氏球菌或其它奈瑟氏球菌菌株。本發(fā)明還包括來源于奈瑟氏球菌的其它鐵獲得蛋白。
TbpA
TbpA與TbpB相互作用在奈瑟氏球菌外膜上形成蛋白復(fù)合體,其結(jié)合轉(zhuǎn)鐵蛋白。在結(jié)構(gòu)上,TbpA包括具有TonB箱 的胞內(nèi)N-末端結(jié)構(gòu)域和活塞結(jié)構(gòu)域,該活塞結(jié)構(gòu)域為多個由短胞內(nèi)環(huán)和較長的胞外環(huán)連接的跨膜β鏈。
已經(jīng)區(qū)別了 TbpB的兩個家族,它們分別具有較高的分子量和較低的分子量。TbpB 的高和低分子量形式與TbpA的不同家族結(jié)合,可以同源性為基礎(chǔ)區(qū)別該不同家族。盡管它們的分子量相似,但還是將它們稱作高分子量和低分子量家族,這是因為它們與TbpB的高或低分子量形式結(jié)合(Rokbi 等人,FEMS Microbiol. Lett. 100 ;51,1993)。術(shù)語 TbpA (高) 和TbpA(低)用于表示TbpA的這兩種形式,且與TbpB相似。本發(fā)明的免疫原性組合物可包括來源于腦膜炎奈瑟氏球菌血清組A、B、C、Y和W-135的TbpA和TbpB以及來源于包括淋病奈瑟氏球菌在內(nèi)的其它細(xì)菌的鐵獲得蛋白。轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合蛋白TbpA和TbpB已經(jīng)被分別稱作 Tbpl 和 Tbp2 (Cornelissen 等人,Infection and Immunity 65 ;822,1997)。
TbpA包括若干不同的區(qū)。例如,就來源于腦膜炎奈瑟氏球菌菌株H44/76的TbpA 而言,氨基末端的186個氨基酸形成內(nèi)部球狀結(jié)構(gòu)域,22個β鏈跨越膜,形成β桶結(jié)構(gòu)。 這些是由短胞內(nèi)環(huán)和較大的胞外環(huán)連接的。胞外環(huán)2、3和5具有最高程度的序列變異性且環(huán)5是表面外露的。環(huán)5和4參與配體結(jié)合。
TbpA的優(yōu)選片段包括TbpA的胞外環(huán)。使用來源于腦膜炎奈瑟氏球菌菌株Η44/76 的TbpA序列,這些環(huán)與環(huán)I的氨基酸200-202、環(huán)2的氨基酸226-303、環(huán)3的氨基酸 348-395、環(huán)4的氨基酸438-471、環(huán)5的氨基酸512-576、環(huán)6的氨基酸609-625、環(huán)7的氨基酸661-671、環(huán)8的氨基酸707-723、環(huán)9的氨基酸769-790、環(huán)10的氨基酸814—844和環(huán)11的氨基酸872-903相對應(yīng)。在序列對比后,在其它Tbp蛋白中的相應(yīng)序列也可構(gòu)成優(yōu)選片段。最優(yōu)選的片段可包括構(gòu)成Tbp的環(huán)2、環(huán)3、環(huán)4或環(huán)5的氨基酸序列。
當(dāng)本發(fā)明的免疫原性組合物包括TbpA時,它優(yōu)選同時包括TbpA (高)和 TbpA (低)。
雖然優(yōu)選TbpA存在于OMV疫苗中,但它也可以是亞單位疫苗的一部分。例如,可被引入到本發(fā)明免疫原性組合物中的分離的鐵獲得蛋白也是本領(lǐng)域熟知的(W000/25811)。 它們可在細(xì)菌宿主中表達(dá),使用洗滌劑提取(例如2% Elugent)并通過親和層析或使用本領(lǐng)域熟知的標(biāo)準(zhǔn)柱層析技術(shù)純化(Oakhill等人,Biochem J. 2002 364 ;613_6)。
當(dāng)TbpA存在于OMV疫苗中時,它的表達(dá)可通過此處討論的基因技術(shù)上調(diào),或可優(yōu)選通過親代菌株在下述鐵有限條件下生長而被上調(diào)。該方法還可導(dǎo)致可變鐵-調(diào)節(jié)蛋白, 特別是FrpB的上調(diào),其可變?yōu)槊庖唢@性的且它因此可按下面所述有利地下調(diào)這種蛋白(特別是FrpB)的表達(dá)(且優(yōu)選使編碼這種蛋白的基因缺失),以確保本發(fā)明的免疫原性組合物引發(fā)抗存在于大范圍奈瑟氏球菌菌株中的抗原的免疫反應(yīng)。它優(yōu)選具有存在于免疫原性組合物中的TbpA (高)和TbpA (低),且優(yōu)選這是通過將來源于表達(dá)TbpA可選擇形式的兩種菌株的OMV混合獲得的。
4.毒素
毒素包括FrpA (NMB 0585 ;NMB 1405)、FrpA/C (見下面的定義)、FrpC (NMB 1415 ; Mffl 1405) (W0 92/01460)、匪-ADPRT (Mffl 1343) (13th International Pathogenic Neisseria Conference 2002Masignani 等人,pl35)、VapD (NMB 1753)、脂多糖(LPS ;也被稱作脂低聚糖或LOS)免疫型L2和LPS免疫型L3。FrpA和FrpC所含的區(qū)在這兩個蛋白之間是保守的且所述蛋白的優(yōu)選片段是含有該保守片段的多肽,優(yōu)選含有FrpA/C序列的氨基酸227-1004。這些抗原可來源于腦膜炎奈瑟氏球菌或淋病奈瑟氏球菌或其它奈瑟氏球菌菌株。本發(fā)明還包括來源于奈瑟氏球菌的其它毒素。
在可選擇性的實施方案中,毒素可包括參與毒性調(diào)節(jié)的抗原,例如在脂多糖合成中起作用的OstA。
FrpA 和 FrpC
腦膜炎奈瑟氏球菌編碼兩種RTX蛋白,它們被稱作FrpA和FrpC,是在鐵有限條件下分泌的(Thompson 等人,(1993) J. Bacteriol. 175 :811-818 ;Thompson 等人,(1993) Infect.1mmun. 61 :2906-2911)。RTX(重復(fù)毒素)蛋白家族在靠近它們的C-末端處共有下列一致序列的一系列9個氨基酸重復(fù)單位Leu Xaa Gly Gly Xaa Gly (Asn/Asp)Asp Xaa (LXGGXGN/dDX)。大腸桿菌HlyA中的重復(fù)單位被認(rèn)為是Ca 2+結(jié)合的位點。正如在圖4中所描繪的,腦膜炎球菌FrpA和FrpC蛋白,正如在菌株FAM20中所表征的,在它們的中心和 C-末端區(qū)共有廣泛的氨基酸相似性但在N-末端的相似性(如果有的話)非常有限。此外, 由于9個氨基酸基序的重復(fù)(在FrpA中重復(fù)13次、在FrpC中重復(fù)43次),在FrpA和FrpC 之間保守的區(qū)顯示出某些多態(tài)性。
本發(fā)明的免疫原性組合物可包括全長FrpA和/或FrpC或優(yōu)選,含有在FrpA和 FrpC之間保守的序列的片段。所述保守序列是由9個氨基酸的重復(fù)單位構(gòu)成的。本發(fā)明的免疫原性組合物優(yōu)選包括多于3個重復(fù)單位、多于10個重復(fù)單位、多于13個重復(fù)單位、多于20個重復(fù)單位或多于23個重復(fù)單位。
這種截短物具有較之全長分子更有利的性質(zhì)且包含這種抗原并被摻入到本發(fā)明的免疫原性組合物中的疫苗形成本發(fā)明的獨立方面。
在FrpA和FrpC之間保守的序列被命名為FrpA/C,且當(dāng)FrpA或FrpC形成本發(fā)明免疫原性組合物的組分時,可有利地使用FrpA/C。FrpA序列的氨基酸277-1004是優(yōu)選的保守區(qū)。在N或C末端的任何一端或兩端,上述序列可被伸展或截短達(dá)1、3、5、7、10、15、20、 25、或30個氨基酸。
LPS
LPS (脂多糖,也被稱作LOS-脂低聚糖)是奈瑟氏球菌外膜上的內(nèi)毒素。已知LPS 的多糖部分可誘導(dǎo)殺菌抗體。
LPS低聚糖部分內(nèi)的異質(zhì)性在不同的奈瑟氏球菌菌株之間產(chǎn)生結(jié)構(gòu)和抗原多樣性 (Griffiss等人,Inf.1mmun. 1987 ;55 :1792-1800)。這已被用于將腦膜炎球菌菌株細(xì)分成 12 個免疫型(Scholtan 等人,J Med Microbiol 1994,41 :236-243)。免疫型 L3、L7 和 L9 在免疫學(xué)方面是相同的且在結(jié)構(gòu)上是相似的(或甚至是相同的)并因此已被命名為L3、7、 9 (或,為了本說明書的目的,統(tǒng)稱為“L3”)。腦膜炎球菌LPS L3、7、9(L3)、L2和L5可通過唾液酸化,或通過加入胞苷5'-—磷酸-N-乙?;窠?jīng)氨酸而被修飾。雖然L2、L4和 L6LPS在免疫學(xué)方面是可區(qū)別的,但它們在結(jié)構(gòu)上相似,且在此處提到L2時,L4或L6在本發(fā)明的范圍內(nèi)可被任選替代。見M. P. Jennings等人,Microbiology 1999,145, 3013-3021 和Mol Microbiol2002,43 :931_43,其中進一步舉例說明了 LPS的結(jié)構(gòu)和異質(zhì)性。
當(dāng)LPS,優(yōu)選腦膜炎球菌LPS包括在本發(fā)明的疫苗中時,優(yōu)選且有利地存在免疫型L2和L3之一或兩者。LPS優(yōu)選存在于外膜小泡中(優(yōu)選用低百分比的洗滌劑,更優(yōu)選 0-0. 5%,0. 02-0. 4%,0. 04-0. 3%,0. 06-0. 2%,0. 08-0. 15%或 0.1 %,最優(yōu)選脫氧膽酸鹽 [D0C]提取小泡時),還可以是亞單位疫苗的一部分。LPS可使用熟知的過程,包括熱水-苯酌■過程分離(Wesphal 和 Jann Meth. Carbo. Chem. 5 ;83-91 1965)。還可見 Galanos 等人, Eur J Biochem 9 :245_249,和 Wu 等人,1987,Anal Bio Chem 160:281-289。LPS 可簡單使用 或與T-細(xì)胞表位的來源,如破傷風(fēng)類毒素、白喉類毒素、CRM-197或OMV外膜蛋白綴合使用。使分離的LOS綴合的技術(shù)也是已知的(見,例如,EP 941738,其引入此處作為參考)。
當(dāng)LOS(特別是本發(fā)明的L0S)存在于皰制劑中時,優(yōu)選通過使LOS與也存在于皰制劑上的一種或多種外膜蛋白(例如,腦膜炎球菌中的PorA或PorB)綴合的方法使LOS原位綴合。
該方法可有利地提高皰制劑內(nèi)LOS抗原的穩(wěn)定性和/或免疫原性(提供T-細(xì)胞幫助)和/或抗原性-因此以其保護性最強的構(gòu)象為非T-依賴性低聚糖免疫原提供T-細(xì)胞幫助-如在其天然環(huán)境中的、腦膜炎球菌外膜表面上的L0S。此外,LOS在皰內(nèi)的綴合可導(dǎo)致LOS解毒(脂類A部分被穩(wěn)定埋藏在外膜中,因此很少引起毒性)。因此,這里提到的從htrB-或msbB-突變體中分離皰,或通過向組合物中加入多粘菌素B的無毒肽功能性等價物的解毒方法(見 WO 93/14115, WO 95/03327、Velucchi 等人,(1997) J Endotoxin Res 4 :1_12,和EP 976402,多粘菌素B的無毒肽功能性等價物的進一步描述-特別是(序列 KTKCKFLKKC,其中2個半胱氨酸形成二硫鍵)肽SAEP 2的使用)可能并不是必需的(但其可被加入到組合中用于增加安全性)。因此,本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)包括皰的組合物可形成用于治療或預(yù)防由衍生皰的生物所引起疾病的疫苗基礎(chǔ),其中存在于皰中的LOS已以皰內(nèi)模式與同時存在于皰中的外膜蛋白綴合,其中這種疫苗基本上是無毒的且能夠誘導(dǎo)抗其天然環(huán)境中的LOS的T-依賴性殺菌反應(yīng)。
本發(fā)明因此進一步提供這種皰內(nèi)LOS綴合的腦膜炎球菌皰制品。
這種皰制品是否可從正極討論的細(xì)菌(見WO 01/09350)中被分離出來,然后經(jīng)過已知的綴合化學(xué)過程使LOS低聚糖部分上的基團(例如,NH2*C00H)與皰外膜蛋白上的基團(例如,nh2*cooh)綴合還在討論。可使用利用戊二醛、甲醛、或戊二醛/甲醛混合物的交聯(lián)技術(shù),但優(yōu)選使用選擇性更強的化學(xué)過程如EDAC或EDAC/NHS(J. V. Staros, R. ff.Wright 和 D. M. Swingle. Enhancement by N-hydroxysuccinimide of water-soluble carbodiimide—mediated coupling reactions.Analytical chemistry 156 220-222(1986) jBBioconjugates Techniques. Greg T. Hermanson (1996)pp 173-176)??墒褂玫摹⒛軌蛟贚OS與蛋白分子之間生成共價鍵的其它綴合化學(xué)過程或處理在EP 941738 中描述。
優(yōu)選皰制品在沒有莢膜多糖存在的條件下綴合。所述皰可從不(按照下面所述天然地或經(jīng)由突變)產(chǎn)生莢膜多糖的菌株中分離,或可從絕大多數(shù)且優(yōu)選全部污染莢膜多糖中純化。以這種方式,皰內(nèi)LOS綴合反應(yīng)更加有效。
優(yōu)選存在于皰中的超過10、20、30、40、50、60、70、80、90、或95%的LOS是交聯(lián)的/綴合的。
皰內(nèi)綴合應(yīng)優(yōu)選整合下列方法的1、2或全部3個步驟綴合pH應(yīng)大于pH 7.0, 優(yōu)選大于或等于pH 7.5(最優(yōu)選在pH 9下);在反應(yīng)過程中應(yīng)當(dāng)維持1-5%、優(yōu)選2-4%、 最優(yōu)選約3%蔗糖的條件;在綴合反應(yīng)中應(yīng)當(dāng)將NaCl降到最低,優(yōu)選0. 1M、0. 05M、0. ·01M、 0. 005M、0. 001M、且最優(yōu)選根本不存在。所有這些方法特征可確保在整個綴合過程中皰均保持穩(wěn)定且保持在溶液中。
EDAC/NHS綴合方法是皰內(nèi)綴合的優(yōu)選方法。EDAC/NHS優(yōu)于甲醛,甲醛可交聯(lián)至非常高的程度,由此不利地影響濾過率。EDAC與羧酸(如LOS中的KD0)反應(yīng),產(chǎn)生活性酯中間體。在有胺親核試劑(如外膜蛋白,如PorB中的賴氨酸)存在的條件下,酰胺鍵是用異脲副產(chǎn)物的釋放形成的。然而,EDAC-介導(dǎo)的反應(yīng)的效能可通過Sulfo-NHS酯中間體的形成而增加。Sulfo-NHS酯在水溶液中存在的時間比EDAC單獨與羧酸鹽反應(yīng)形成的活性酯要長。因此,更高產(chǎn)率酰胺鍵的形成可使用這種兩階段方法實現(xiàn)。EDAC/NHS綴合在 J. V. Staros, R. W. Wright 和 D. M. Swingle. Enhancement by N-hydroxysuccinimide of water-soluble carbodiimide—mediated coupling reactions. Analytical chemistry 156 :220-222(1986) JfIBioconjugates Techniques. Greg T. Hermanson (1996) pp 173-176 中討論。優(yōu)選在反應(yīng)中使用0. 01-5mg EDAC/mg皰、更優(yōu)選O. 05-lmg EDAC/mg皰。所用EDAC 的量取決于存在于樣品中的LOS量,而其又依次取決于用于提取皰的脫氧膽酸鹽(DOC) %。 在低% DOC(例如,O. 1% )下,使用較大用量的EDAC(lmg/mg及以上),然而在高% DOC(例如O. 5% )下,使用較小用量的EDAC(0. 025-0. lmg/mg)以避免太多皰間交聯(lián)。
因此本發(fā)明的方法優(yōu)選是用于產(chǎn)生皰內(nèi)綴合LOS (優(yōu)選腦膜炎球菌)的方法,該方法包括在有EDAC/NHS存在、pH 7. Ο-pH 9. O (優(yōu)選約pH 7. 5) ,1-5% (優(yōu)選約3% )蔗糖、 且任選在基本上沒有NaCl (如上所述)的條件下使皰綴合,并分離反應(yīng)混合物中綴合皰的步驟。
所述反應(yīng)隨后使用抗-LOS(例如,抗-L2或抗_L3)mAb在反應(yīng)混合物的蛋白質(zhì)分離凝膠上進行,其顯示隨著反應(yīng)時間的進行,皰中LOS的比例增大,LOS的分子量增加。
使用這種技術(shù)可回收的皰產(chǎn)率99%。
人們發(fā)現(xiàn)EDAC是一種極好的皰內(nèi)交聯(lián)劑,這是因為它可使LOS與OMP充分交聯(lián), 用于提高LOS T-依賴性免疫原性,但不會使它交聯(lián)至非常高的程度而導(dǎo)致如濾過率較差、 聚集和皰間交聯(lián)的問題發(fā)生。所產(chǎn)生的皰的形態(tài)學(xué)與未綴合的皰相似(利用電子顯微鏡)。 此外,上述方案可避免發(fā)生過度交聯(lián)(其可降低天然存在于皰表面上的保護性0ΜΡ,例如 TbpA或Hsf的免疫原性)。
優(yōu)選衍生皰的腦膜炎球菌是不能產(chǎn)生莢膜多糖的突變株(例如,下述突變株的其中一種,特別是siaD_)。還優(yōu)選可有效抗腦膜炎球菌病的免疫原性組合物同時包含L2和 L3皰,其中L2和L3 LOS均與皰外膜蛋白綴合。此外,優(yōu)選皰內(nèi)綴合皰中的LOS結(jié)構(gòu)與從 IgtB-腦膜炎球菌菌株衍生的一致(如下所述)。最優(yōu)選免疫原性組合物包括皰內(nèi)綴合的皰來源于不能產(chǎn)生莢膜多糖且是IgtB的突變腦膜炎球菌菌株;包含來源于不能產(chǎn)生莢膜多糖的突變腦膜炎球菌菌株的L2和L3皰;包含來源于lgtB—突變腦膜炎球菌菌株的L2 和L3皰;或最優(yōu)選包含來源于不能產(chǎn)生莢膜多糖且是lgtB_的突變腦膜炎球菌菌株的L2和 L3皰。
可用于本發(fā)明的一般L3腦膜炎球菌菌株是H44/76menB菌株。一般的L2菌株是 B16B6menB菌株或39E腦膜炎球菌C型菌株。
如上所述,本發(fā)明的皰已通過綴合作用被解毒至一定程度,且無需進一步解毒,然而進一 步的解毒方法可用于增加安全性,例如,使用來源于htrB—或msbB—腦膜炎球菌菌株的皰或向皰組合物中加入多粘菌素B的無毒肽功能性等價物[與脂類A具有較高親和性的分子](優(yōu)選SEAP 2)(如上所述)。
在上述方法中,提供腦膜炎球菌泡及含有皰的免疫原性組合物,其具有重要的抗原L0S,該抗原基本上無毒,沒有自身免疫性問題,具有T-依賴性特征,存在于其天然環(huán)境中,且能夠誘導(dǎo)抗超過90%腦膜炎球菌菌株的殺菌抗體反應(yīng)(在L2+L3組合物的情況下)。
優(yōu)選皰內(nèi)LOS綴合應(yīng)整合下列方法的1、2、或全部3個步驟綴合pH應(yīng)大于pH 7.0,優(yōu)選大于或等于pH 7.5(最優(yōu)選在pH 9下);在反應(yīng)過程中應(yīng)當(dāng)維持1-5%、優(yōu)選 2-4%、最優(yōu)選約3%蔗糖的條件;在綴合反應(yīng)中應(yīng)當(dāng)將NaCl降到最低,優(yōu)選O. 1M、0. 05M、 O. 01M、0. 005M.0. 001M、且最優(yōu)選根本不存在。所有這些方法特征可確保在整個綴合過程中抱保持穩(wěn)定且保持于溶液中。
雖然可通過各種技術(shù)和化學(xué)過程使LOS與外膜蛋白在皰內(nèi)綴合,但EDAC/NHS綴合方法是皰內(nèi)綴合的優(yōu)選方法。EDAC/NHS優(yōu)于甲醛,甲醛可交聯(lián)至非常高的程度,由此對濾過率有不利的影響。EDAC與羧酸反應(yīng),產(chǎn)生活性酯中間體。在有胺親核試劑存在的條件下, 酰胺鍵是用異脲副產(chǎn)物的釋放形成的。然而,EDAC-介導(dǎo)的反應(yīng)的效能可通過Sulfo-NHS 酯中間體的形成而增加。Sulfo-NHS酯在水溶液中存在的時間比EDAC單獨與羧酸鹽反應(yīng)形成的活性酯要長。因此,更高產(chǎn)率酰胺鍵的形成可使用這種兩階段方法實現(xiàn)。EDAC/NHS 綴合在 J. V. Staros, R. ff. Wright 和 D. M. Swingle. Enhancement by N-hydroxysuccinimide of water-soluble carbodiimide—mediated coupling reactions. Analytical chemistry 156 :220-222(1986) jBBioconjugates Techniques. Greg T. Hermanson(1996)pp 173—176中討論。
因此本發(fā)明的方法優(yōu)選是用于產(chǎn)生皰內(nèi)綴合LOS (優(yōu)選腦膜炎球菌)的方法,該方法包括在有EDAC/NHS存在、pH 7. Ο-pH 9· O (優(yōu)選約pH 7. 5)的pH、l_5% (優(yōu)選約3%)蔗糖、且任選基本上沒有NaCl (如上所述)的條件下使皰綴合,以及從反應(yīng)混合物中分離綴合皰的步驟。
所述反應(yīng)隨后使用抗-LOS (例如,抗-L2或抗_L3)mAb在反應(yīng)混合物的分離凝膠上進行,其顯示隨著反應(yīng)時間的進行,皰中LOS的比例增大,LOS的分子量增加。
使用這種技術(shù)可回收的皰產(chǎn)率99%。
人們發(fā)現(xiàn)EDAC是一種極好的皰內(nèi)交聯(lián)劑,這是因為它可使LOS與OMP充分交聯(lián), 用于提高LOS T-依賴性免疫原性,但不會使它交聯(lián)至非常高的程度而導(dǎo)致如濾過率較差和皰間交聯(lián)的問題發(fā)生。此外,應(yīng)當(dāng)避免過度交聯(lián),從而避免天然存在于皰表面上的保護性 0ΜΡ,例如Tbp免疫原性的任何降低。
5.整合外膜蛋白
奈瑟氏球菌蛋白的其它種類也可以是包括在本發(fā)明奈瑟氏球菌疫苗中的候選物,且能夠以令人吃驚的有效方式與其它抗原組合。膜相關(guān)蛋白、特別是整合膜蛋白且最有利地是外膜蛋白,特別是整合外膜蛋白可用于本發(fā)明的組合物中。這種蛋白的例子是也被稱作OmplA的Pld A(NMB 0464) (W000/15801),其是奈瑟氏球菌磷脂酶外膜蛋白。其它例子是 TspA(NMB 0341) (Infect.1mmun. 1999,67 ;3533_3541)和 TspB(T-細(xì)胞刺激蛋白)(W0 00/03003 ;NMB 1548、NMB 1628 或 NMB1747)。其它例子包括 Pi IQ (NMB 1812) (W099/61620)、也被稱作 D15-的 0MP85 (NMB0182) (W000/23593)、 NspA (U52066) (W096/29412)、FhaC (NMB 0496 或 NMB 1780)、PorB (NMB 2039) (Mol. Biol. Evo l. 12 :363-370,1995)、HpuB (NC. 003116.1)、TdfH(NMB1497) (Microbiology 2001,147 ; 1277-1290) ,OstA (NMB0280)、也被稱作 GNA33 和 Lipo30 的 MltA(NMB0033) ,HtrA (NMB 0532 ; W099/55872)、HimD (NMB 1302)、HisD(NMB 1581)、GNA 1870 (NMB 1870)、HlpA (NMB 1946)、 NMB 1124,NMB 1162,NMB 1220,NMB 1313,NMB 1953、HtrA、TbpA(NMB 0461) (W0 92/03467) (還可見上面的鐵獲得蛋白)和LbpA(NMB 1541)。
0MP85
本發(fā)明的免疫原性組合物可包括全長0MP85,優(yōu)選作為OMV制品的一部分。0MP85 的片段也可用于本發(fā)明的免疫原性組合物中,特別是,優(yōu)選將由氨基酸殘基1-475或 50-475組成的0MP85表面外露結(jié)構(gòu)域摻入到本發(fā)明免疫原性組合物的亞單位組分中。在N 或C末端的任何一端或兩端,0MP85的表面外露結(jié)構(gòu)域的上述序列可被伸展或截短達(dá)1、3、 5、7、10、15、20、25、或30個氨基酸。優(yōu)選刪除0MP85片段的信號序列。
OstA
OstA可在脂多糖的合成中發(fā)揮作用且可被認(rèn)為是毒性調(diào)節(jié)劑。OstA可選擇性地包括在毒素類中,其中毒素種類被擴大至包括毒性調(diào)節(jié)劑以及毒素。
免疫原件組合物
免疫原性組合物是包括至少一種抗原的組合物,當(dāng)給予宿主時,所述抗原能夠產(chǎn)生免疫反應(yīng)。優(yōu)選,這種免疫原性制品能夠產(chǎn)生抗奈瑟氏球菌,優(yōu)選抗腦膜炎奈瑟氏球菌或淋病奈瑟氏球菌感染的保護性免疫反應(yīng)。
本發(fā)明涉及包括至少兩種抗原的免疫原性組合物,其優(yōu)選可引發(fā)協(xié)同殺菌、保護性或粘附阻斷反應(yīng)的一種或多種。
本發(fā)明的SBA殺菌測定法
這種協(xié)同反應(yīng)可通過由抗原組合引發(fā)的SBA來表征,抗原組合引發(fā)的SBA較之由每個抗原單獨引發(fā)的SBA要高至少50%、2倍、3倍、優(yōu)選4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍且最優(yōu)選10倍。優(yōu)選SBA是相對于衍生抗原的同源性菌株測量的,且優(yōu)選是相對于一組異源性菌株測量的。(見下面代表性小組,例如屬于A-4聚簇的BZlO (B 2b P1. 2);屬于ET-37 復(fù)合體的B16B6 (B 2a P1. 2);和H44/76 (B :15 P1. 7,16))。SBA是最普遍認(rèn)可的免疫學(xué)標(biāo)記,可評價腦膜炎球菌疫苗的功效(Perkins等人,J Infect Dis. 1998,177 :683-691)。令人滿意的SBA可通過任何已知方法測定。SBA可利用從動物模型或人類受試者獲得的血清進行(見實施例17-20)。
用人血清進行SBA的優(yōu)選方法如下。在第一次接種前、第二次接種后2個月和第三次接種后I個月(I年中進行3次接種是一般的人類初次接種程序,例如在第0、2和4個月或第0、1、或6個月時給予)采集血液樣品。這種人類初次接種程序可對I歲以下的嬰兒進行(例如,與Hib接種同時進行),或也可給2-4歲的兒童或青少年接種以測試這種初次接種程序的SBA。如果適合,可在初次接種后6-12個月以及激發(fā)劑量后I個月再次采集血液樣品。
如果在(初次接種程序的)第三支疫苗給藥后一個月(在2-4歲兒童或青少年中,但優(yōu)選在生命第一年的嬰兒中),抗衍生本發(fā)明抗原的腦膜炎球菌菌株的SBA(抗體稀釋度)效價(與接種前效價相比)增加4倍的受試者百分比超過30%、優(yōu)選超過40%、更優(yōu)選超過50%、最優(yōu)選超過60%受試者,那么對于具有同源殺菌活性的抗原或皰制品而言, SBA是令人滿意的。
當(dāng)然,如果它也可相對于衍生它的腦膜炎球菌菌株引發(fā)令人滿意的SBA的話,則具有異源殺菌活性的抗原 或皰制品也可構(gòu)成具有同源殺菌活性的皰制品。
如果在(初次接種程序的)第三支疫苗給藥后一個月(在2-4歲兒童或青少年中,但優(yōu)選在生命第一年的嬰兒中),抗腦膜炎球菌3種異源菌株的SBA (抗體稀釋度)效價(與接種前效價相比)增加4倍的受試者百分比超過20%、優(yōu)選超過30%、更優(yōu)選超過 35%、最優(yōu)選超過40%受試者,那么對于具有異源殺菌活性的抗原或皰制品而言,SBA是令人滿意的。這種試驗是具有異源殺菌活性的抗原或皰制品是否可誘導(dǎo)抗各種腦膜炎球菌菌株的交叉殺菌抗體的良好表征。所述三種異源菌株應(yīng)當(dāng)優(yōu)選具有彼此不同且優(yōu)選與制備或衍生具有異源殺菌活性的抗原或皰制品的菌株不同的電泳型(ET)-復(fù)合體或多基因座序列分型(MLST)模式(見Maiden等人,PNAS USA 1998,95:3140-5)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)能夠很容易地測定具有不同ET-復(fù)合體的三種菌株,其可反映在腦膜炎球菌之間,特別是腦膜炎球菌B型菌株之間觀察到的基因多樣性,這些菌株被認(rèn)為是重要疾病負(fù)擔(dān)的原因和 /或代表認(rèn)可的MenB劇毒譜系(見Maiden等人,見上)。例如,可使用的三種菌株是下列 屬于 A-4 聚簇的 BZlO (B 2b P1. 2);屬于 ET-37 復(fù)合體的 B16B6 (B :2a P1. 2);和屬于 ET-5 復(fù)合體的H44/76(B :15 :P1. 7,16),或?qū)儆谕?ET/聚簇的任何其它菌株。這種菌株可用于測試從例如屬于ET-S復(fù)合體的腦膜炎球菌菌株CU385(B 4 P1. 15)制備或衍生的、具有異源殺菌活性的抗原或皰制品。可使用的其它樣品菌株來源于譜系3流行性克隆(例如,NZ124[B 4 P1. 7,4]) 另一 ET-37 菌株是 NGP165(B :2a P1. 2)。測量SBA活性的方法是本領(lǐng)域已知的。例如,可使用的方法在W099/09176的實施例IOC中描述。在一般情況中,所試驗的菌株培養(yǎng)物是在生長的對數(shù)期(優(yōu)選在鐵缺失的條件中-通過向生長培養(yǎng)基中加入鐵螯合劑如EDDA)生長的??蓪⑵鋺腋≡诰哂蠦SA的培養(yǎng)基(如具有O. 3% BSA的Hanks培養(yǎng)基)中,以便獲得調(diào)至約20000CFU/ml的試驗細(xì)胞懸浮液。一系列反應(yīng)混合物可通過將一系列2倍稀釋的試驗血清(優(yōu)選在56°C熱滅活 30分鐘)[例如,50 μ I/孔體積]和20000CFU/ml試驗的腦膜炎球菌菌株懸浮液(例如, 25 μ I/孔體積)混合而制備。應(yīng)培養(yǎng)(例如,37°C 15分鐘)并振搖(例如,210rpm)反應(yīng)小瓶。此外,終反應(yīng)混合物[例如,100 μ I體積]還可包含補體源[如,25%終體積的預(yù)試幼兔血清],并按照上面所述培養(yǎng)[例如,37°C 60分]。無菌的聚苯乙烯U-底96-孔微量滴定平板可用于該測定法??墒褂枚嗟酪埔浩鲝拿總€孔中采集等分試樣[例如,10 μ I],滴在Mueller-Hinton瓊脂平板(優(yōu)選含有1% Isovitalex和I %熱滅活的馬血清)上并培養(yǎng)(例如,在37°C、5% CO2中培養(yǎng)18小時)。優(yōu)選,單獨的菌落高達(dá)80CFU/等分試樣。將下列二種試驗樣品用作對照緩沖液+細(xì)菌+補體;緩沖液+細(xì)菌+滅活補體;血清+細(xì)菌 +滅活補體。SBA效價可使用程序直接計算,該程序可對數(shù)據(jù)進行加工從而得到稀釋度的測量值,該測量值與通過回歸計算得到的50%細(xì)胞死亡相對應(yīng)。
動物保護測定法
可選擇性地,協(xié)同反應(yīng)可通過抗原組合在動物保護測定法中的功效而表征。例如, 可使用實施例12或13中描述的測定法。優(yōu)選,與單獨使用抗原,特別是抗原的次優(yōu)劑量相比,通過抗原組合而得到保護的動物數(shù)量明顯增加。
用于防止淋病奈瑟氏球菌感染的成功疫苗可能需要不止一個下列要素血清和/ 或粘膜抗體的產(chǎn)生以促進補體介導(dǎo)的淋球菌死亡,和/或通過白細(xì)胞如多形核白細(xì)胞提高吞噬作用并殺死微生物,和/或防止淋球菌附著于宿主組織;誘導(dǎo)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng),它們也可參與保護。
本發(fā)明皰淋病疫苗制品功效的提高可通過分析誘導(dǎo)的血清和/或粘膜抗體免疫反應(yīng)來評價,它們具有抗粘附和/或調(diào)理性和/或殺菌活性,如其他人所述(McChesneyD 等人,Infect. Tmmun. 36 :1006,1982 ;Boslego J 等人Efficacy trial of a purified gonococci pilus vaccine, in Program and Abstracts of the 24th Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Washington, American Society for Microbiology, 1984 ;Siegel M 等人,J.1nfect. Dis 145 :300,1982 ;de la Pas, Microbiology,141(Pt4) :913-20,1995)。
近來描述了由淋病奈瑟氏球菌所致的生殖器感染小鼠模型(Plante M,J.1nfect. Dis.,182 :848-55,2000)。本發(fā)明皰淋病疫苗功效的提高還可通過其防止或降低淋病奈瑟氏球菌在這種小鼠感染模型中定居的能力而評價。
粘附阻斷測定法
可選擇性地,協(xié)同反應(yīng)可通過抗原組合在粘附阻斷測定法中的功效而表征。例如, 可使用實施例11中描述的測定法。優(yōu)選與使用抗單獨抗原產(chǎn)生的抗血清,特別是次優(yōu)劑量的抗體相比,由抗抗原組合產(chǎn)生的抗血清誘導(dǎo)的阻斷程度顯著提高。
亞單位組合物
本發(fā)明的免疫原性組合物可以是一種亞單位組合物。亞單位組合物是在將組分混合形成抗原性組合物之前,其中組分已經(jīng)被分離并純化到至少50%、優(yōu)選至少eo^jo^、 80 %、90%純度的組合物。
本發(fā)明的免疫原性亞單位組合物優(yōu)選包括選自下列的至少2種抗原FhaB、PilC、 Hsf、Hap、NadA、0MP85、IgA蛋白酶、AspA、AspA的過客結(jié)構(gòu)域、Hsf的過客結(jié)構(gòu)域、Hap的過客結(jié)構(gòu)域、FrpA、FrpC、TbpA、TbpB> LbpA> LbpB> HpuA> HpuB> TspA、TspB> PldA、PilQ、FhaC、 NspAJP LPS免疫型L2和LPS免疫型L3之一或兩者。
亞單位組合物可以是水溶性蛋白的水溶液。它們可包含洗滌劑、優(yōu)選非-離子、兩性離子或離子洗滌劑,以便使抗原的疏水部分溶解。它們可包含脂類,這樣就可形成脂質(zhì)體結(jié)構(gòu),使抗原以跨越脂膜的結(jié)構(gòu)呈遞。
外膜小泡制品
腦膜炎奈瑟氏球菌血清組B(menB)分泌足量的外膜皰從而使得能夠以工業(yè)規(guī)模制造它們。外膜小泡還可經(jīng)由用洗滌劑提取細(xì)菌細(xì)胞的方法制備(見例如,EP 11243)。
本發(fā)明的免疫原性組合物還可包括具有至少兩種抗原的外膜小泡制品,所述抗原已被上調(diào),或者被重組上調(diào)或通過其它方式被上調(diào),包括在鐵-缺失條件下生長。在這種外膜小泡制品中被上調(diào)的抗原的例子包括NspA、Hsf、Hap、0MP85、TbpA (高)、TbpA(低)、 LbpA、TbpB、LbpB、PilQ、AspA、TdfH, PorB、HpuB、P2086、NM-ADPRT、MafA、MafB 和 PldA。這種制品還可任選包括LPS免疫型L2和LPS免疫型L3之一或兩者。
來源于奈瑟氏球菌菌株的皰制品的制備可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的任何方法獲得。優(yōu)選使用在 EP 301992、US5, 597,572、EP 11243 或 US4, 271,147、Frederikson 等人(NIPH Annals [1991], 14 :67-80)、Zollinger 等人,(J. Clin.1nvest . [1979], 63 :836-848)、Saunders 等人,(Infect.1mmun. [1999] ,67 :113-119)、Drabick 等人 (Vaccine [2000],18 :160-172)或W001/09350 (實施例8)中公開的方法。通常,使用洗滌劑,優(yōu)選脫氧膽酸鹽提取0MV,且核酸被任選酶促除去。純化是通過超速離心后,任選接著進行大小排阻層析實現(xiàn)的。如果包括本發(fā)明2種或多種不同的皰,則它們可在單一容器中組合形成本發(fā)明的多價制品(雖然制品也被認(rèn)為是多價的,如果本發(fā)明的不同皰是處于單獨容器中的單獨組合物,但它們是在同一時間[由同一醫(yī)師]給予宿主的]。OMV制品通常是通過0.2 μ m濾器過濾而滅菌的,且優(yōu)選貯存在蔗糖溶液(例如3%)中,該蔗糖溶液已知可使皰制品溶解。
蛋白在外膜小泡制品內(nèi)的上調(diào)可通過將基因的附加拷貝插入到衍生OMV制品的奈瑟氏球菌菌株中而獲得??蛇x擇性地,可將衍生OMV制品的奈瑟氏球菌菌株中的基因啟動子交換成較強的啟動子。這種技術(shù)在W001/09350中描述。與從未修飾的腦膜炎奈瑟氏球菌(例如菌株H44/76)衍生的OMV中存在的蛋白水平相比,蛋白的上調(diào)將導(dǎo)致OMV中存在的蛋白水平更高。優(yōu)選所述水平要高1. 5、2、3、4、5、7、10或20倍。
當(dāng)LPS是OMV中的附加抗原時,使用低濃度提取洗滌劑(例如,脫氧膽酸鹽或 D0C)的方案可優(yōu)選用于OMV制備方法中,以便保持高水平的結(jié)合LPS而特別除去有毒的結(jié)合較差的 LPS。所用 DOC 的濃度優(yōu)選 0-0. 5% D0C,O. 02-0. 4% D0C,O. 04-0. 3% D0C,更優(yōu)選 O. 06% -O. 2% DOC 或 O. 08-0. 15% D0C,最優(yōu)選約或準(zhǔn)確的 O. 1% D0C。
“強的啟動子序列”是指增加編碼目標(biāo)抗原的基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)控制元件。
“上調(diào)表達(dá)”是指相對于未修飾(即天然存在的)皰而言,可提高目標(biāo)抗原表達(dá)的任何方式。應(yīng)當(dāng)了解‘上調(diào)’的量取決于特定的目標(biāo)抗原,但不會超出破壞皰的膜完整性的量??乖纳险{(diào)是指較之未修飾的皰高至少10%的表達(dá)。優(yōu)選高至少50%。更優(yōu)選高至少100% (2倍)。最優(yōu)選高3、4、5、7、10、20倍??蛇x擇性地或附加地,上調(diào)表達(dá)是指就代謝或營養(yǎng)變化而言表達(dá)是非-條件性的,特別是在TbpA、TbpB, LbpA和LbpB的情況下。優(yōu)選當(dāng)從在鐵有限條件中生長的細(xì)菌中衍生皰時,評價表達(dá)水平(例如在有鐵螯合劑存在的條件下)。
又為了清楚的目的,術(shù)語‘將細(xì)菌菌株進行改造以產(chǎn)生較少所述抗原’或下調(diào)是指相對于未修飾的(即天然存在的皰)而言,優(yōu)選通過缺失使目標(biāo)抗原表達(dá)(或功能性基因產(chǎn)物的表達(dá))降低的任何方式,這樣表達(dá)較之未修飾的皰要低至少10%。優(yōu)選低至少50% 且最優(yōu)選完全缺乏。如果下調(diào)蛋白是酶或功能性蛋白,則下調(diào)可通過引入一次或多次突變而獲得,導(dǎo)致酶或功能活性降低10%、20%、50%、80%或優(yōu)選100%。
調(diào)節(jié)奈瑟氏球菌蛋白表達(dá)所需的改造步驟可以以本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的各種方式進行。例如,可插入序列(例如,啟動子或開放閱讀框),并通過轉(zhuǎn)座子插入技術(shù)破壞啟動子/基因。例如,上調(diào)基因的表達(dá)時,可經(jīng)由轉(zhuǎn)座子將強啟動子插入到基因起始密碼子的直到2kb上游(更優(yōu)選200-600bp上游,最優(yōu)選約400bp上游)。還可利用點突變或缺失(特別是對基因的下調(diào)表達(dá)而言)。
然而,這種方法可能相當(dāng)不穩(wěn)定或不確定,且因此優(yōu)選改造步驟是經(jīng)由同源重組事件進行。優(yōu)選,該事件發(fā)生在細(xì)菌染色體上至少30個核苷酸的序列(誘重組區(qū))和在菌株內(nèi)轉(zhuǎn)化的載體上至少30個核苷酸的序列(第二誘重組區(qū))之間。優(yōu)選該區(qū)是40-1000 個核苷酸,更優(yōu)選100-800個核苷酸,最優(yōu)選500個核苷酸。這些誘重組區(qū)應(yīng)當(dāng)足夠相似, 這樣它們就能夠在十分嚴(yán)格的條件下彼此雜交。
用于進行此處所述基因修飾事件的方法(如通過重組事件將基因上調(diào)或下調(diào)并將其它基因序列引入到奈瑟氏球菌基因組中)在W001/09350中描述。可在奈瑟氏球菌中被整合的一般強啟動子是 porA、porB、lgtF、Opa> pllO、1st、和 hpuAB。PorA 和 PorB 是 優(yōu)選的組成型強啟動子。已經(jīng)確定了 PorB啟動子活性包含在與PorB起始密碼子上游的核苷酸1-250相對應(yīng)的片段中。
通過在鐵有限培養(yǎng)基中牛長而上調(diào)抗原的表汰
本發(fā)明外膜小泡制品中某些抗原的上調(diào)優(yōu)選通過分離在鐵有限條件下生長的奈瑟氏球菌親代菌株中的外膜小泡而實現(xiàn)。培養(yǎng)基中低濃度的鐵將導(dǎo)致參與鐵獲得的蛋白表達(dá)增加,包括TbpA、TbpB、LbpA、LbpB、HpuA、HpuB和P2086。這些蛋白的表達(dá)由此被上調(diào)而無需重組修飾所涉及的基因,例如通過插入較強的啟動子或插入基因的附加拷貝。本發(fā)明還包括通過在鐵有限培養(yǎng)基中生長而上調(diào)鐵獲得蛋白,其中所述基因也已被重組修飾。
鐵有限是通過向培養(yǎng)基中加入鐵螯合劑而實現(xiàn)的。適宜的鐵螯合劑包括2,2-雙批唳,EDDHA (乙二胺-二 (O-輕基苯乙酸)和Desferal (甲磺酸去鐵胺,Sigma)。Desferal 是優(yōu)選的鐵螯合劑且以10-100 μ Μ、優(yōu)選25-75 μ Μ、更優(yōu)選50-70 μ Μ、最優(yōu)選60 μ M的濃度加入到培養(yǎng)基中。培養(yǎng)基的鐵內(nèi)含物主要來源于酵母提取物和大豆胨組分,且存在的用量可根據(jù)批次而變化。因此,在不同批的培養(yǎng)基中,不同濃度的Desferal對于獲得鐵獲得蛋白的上調(diào)是最佳的。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)能夠很容易地測定最佳濃度。在基礎(chǔ)條件下,應(yīng)向培養(yǎng)基中加入充足的鐵螯合劑,從而上調(diào)所需鐵-調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá),但也不能過量而不利地影響細(xì)菌的生長。
優(yōu)選將通過在鐵有限條件下生長的鐵獲得蛋白的上調(diào)與其它抗原的重組上調(diào)組合,從而獲得本發(fā)明的外膜小泡。
可變和非-保護性免疫顯性抗原的下調(diào)/除去
在細(xì)菌菌株中,很多表面抗原都是可變的且因此只能抗一組有限的緊密相關(guān)的菌株。本發(fā)明一方面涉及本發(fā)明的外膜小泡,其中其它蛋白的表達(dá)減少,或優(yōu)選編碼可變表面蛋白的基因缺失。這種缺失導(dǎo)致產(chǎn)生皰的細(xì)菌菌株當(dāng)以疫苗形式給藥時,抗各種菌株交叉反應(yīng)性的潛能更強,這是由于保守蛋白(留存在外膜上)對接種者的免疫系統(tǒng)施加了更強的影響。可在本發(fā)明皰免疫原性組合物中被下調(diào)的奈瑟氏球菌中這種可變抗原的例子包括 PorA、PorBλ Opa0
可被下調(diào)或切斷的其它類型基因是在體內(nèi)可被細(xì)菌很容易地接通(表達(dá))或切斷的基因。因為由這種基因編碼的外膜蛋白并不總是存在于細(xì)菌上,因此這種蛋白在皰制品中的存在還可由于上述原因而對疫苗有效性有害。下調(diào)或缺失的優(yōu)選例子是奈瑟氏球菌 Opc蛋白。由含Opc的皰疫苗誘導(dǎo)的抗-Opc免疫性僅具有有限的保護能力,這是因為感染生物很容易變?yōu)?pc_。
例如,這些可變或非-保護基因的表達(dá)可被下調(diào),或最終被切斷。如此則具有將免疫系統(tǒng)集中于更好抗原上的優(yōu)點,所述抗原僅少量存在于皰外表面上。下調(diào)還指表面外露的,上述外膜蛋白的可變免疫顯性環(huán)可被改變或缺失,從而產(chǎn)生免疫顯性較低的外膜蛋白。
下調(diào)表達(dá)的方法在W001/09350中公開。在 本發(fā)明的皰免疫原性組合物中被下調(diào)的優(yōu)選蛋白組合包括PorA與OpA、PorA與OpC、OpA與OpC、PorA與OpA與OpC。
已知有4種不同的Opa基因存在于腦膜炎球菌基因組(Aho等人,1991Mol. Microbiol. 5 :1429-37)中,因此當(dāng)提到Opa的表達(dá)被下調(diào)時,它是指優(yōu)選存在于腦膜炎球菌中的1、2、3或(優(yōu)選)全部4種基因都被下調(diào)。這種下調(diào)通常可按照W001/09350所述基因工程進行或通過查找很容易發(fā)現(xiàn)的、天然的、穩(wěn)定的腦膜炎球菌菌株而進行,它們自O(shè)pa 基因座的表達(dá)較低或沒有。這種菌株可使用Poolman等人(1985J. Med. Micro. 19 :203-209) 描述的技術(shù)發(fā)現(xiàn),其中0pa_細(xì)胞具有與表達(dá)Opa的細(xì)胞不同的表型,這可通過在平板上或顯微鏡下觀察細(xì)胞外觀而見到。一旦找到,在進行發(fā)酵以使Opa缺失后,通過在細(xì)胞內(nèi)含物上進行蛋白質(zhì)印跡而顯示出該菌株是穩(wěn)定的Opa'
當(dāng)外膜小泡中某些抗原的上調(diào)是通過在鐵有限條件下生長而實現(xiàn)的時,可變蛋白 Fr pB (Microbiology 142 ;3269_3274,(1996) ;J. Bacteriol. 181 ;2895_2901 (1999))也可被上調(diào)。本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn),按照W001/09350所述通過下調(diào)全部蛋白的表達(dá)或通過使FrpB 可變區(qū)缺失而在這些環(huán)境下下調(diào)FrpB表達(dá)是有利的。如此可確保由免疫原性組合物引發(fā)的免疫反應(yīng)針對存在于大范圍菌株中的抗原。在本發(fā)明的皰免疫原性組合物中,F(xiàn)rpB的下調(diào)優(yōu)選與PorA和OpA、PorA和OpC、OpA和OpC、PorA和OpA和OpC的下調(diào)組合。
在本發(fā)明可選擇性的實施方案中,外膜小泡中的FrpB被下調(diào),所述外膜小泡是從不是在鐵有限條件下生長的奈瑟氏球菌菌株制備的。
LPS 解毒
本發(fā)明免疫原性組合物中的皰可經(jīng)由W001/09350公開的LPS解毒方法解毒。本發(fā)明LPS解毒的具體方法包括使WOO1/09350中公開的htrB和/或msbB酶被下調(diào)/缺失。 奈瑟氏球菌的msbB和htrB基因還分別被稱作IpxLl和lpxL2 (W000/26384)且這些基因的缺失突變是通過失去一個仲?;湹膍sbB-突變LOS和失去兩個仲酰基鏈的htrB-突變 LOS而從表型方面表征的。WO 93/14155和WO 95/03327描述了可用于本發(fā)明組合物中的多粘菌素B的無毒肽功能性等價物。
這種方法優(yōu)選與皰提取方法組合,皰提取方法包括使用低水平的D0C、優(yōu)選 0-0. 3% D0C、更優(yōu)選O. 05% -O. 2% D0C、最優(yōu)選約或準(zhǔn)確的O. 1% DOC0
LPS解毒的其它方法包括如上所述向皰制品中加入多粘菌素B的無毒肽功能性等價物(優(yōu)選SAEP 2)。
交叉反應(yīng)性多糖
將細(xì)菌外膜皰從有莢膜的革蘭氏陰性菌中分離出來常常導(dǎo)致莢膜多糖的共-純化。在某些情況下,這種“污染”材料可顯示有用,這是因為多糖可提高由其它皰組分產(chǎn)生的免疫反應(yīng)。然而在其它情況下,污染性多糖材料在細(xì)菌皰制品中的存在可證明對皰在疫苗中的應(yīng)用有害。例如,已經(jīng)顯示出至少在腦膜炎奈瑟氏球菌的情況下,血清組B莢膜多糖不會帶來保護免疫性且很容易在人類中誘導(dǎo)不利的自身免疫反應(yīng)。因此,可將本發(fā)明的外膜小泡從細(xì)菌菌株中分離出來用于皰的生產(chǎn),其已被改造成沒有莢膜多糖。這樣一來皰即適用于人類。這種皰制品的特別優(yōu)選的例子是來源于沒有莢膜多糖的腦膜炎奈瑟氏球菌血清組B的皰制品。
這可通過使用修飾的皰產(chǎn)生菌株實現(xiàn),其中莢膜生物合成和/或輸出所需的基因已損壞。編碼莢膜多糖生物合成或輸出的基因的滅活可通過(優(yōu)選使用上述同源重組技術(shù))使控制區(qū)、編碼區(qū)或兩者突變(點突變、缺失或插入),或通過降低這種基因酶功能的任何其它方式而實現(xiàn)。此外,莢膜生物合成基因的滅活還可通過反義過量表達(dá)或轉(zhuǎn)座子誘變而實現(xiàn)。優(yōu)選方法是使多糖生物合成及輸出所需的腦膜炎奈瑟氏球菌Lps基因的一 部分或全部缺失。就該目的而言,置換質(zhì)粒PMF121 (在Frosh等人,1990,Mol. Microbiol. 4 1215-1218中所述)可用于傳遞使cpsCAD(+galE)基因聚簇缺失的突變。
已經(jīng)對抗L 3或L2 LPS所產(chǎn)生抗體的安全性產(chǎn)生了疑問,這是由于與存在于人鞘糖脂中的乳-N-neotetraose 低聚糖基團(Gal β l~4GlcNAc β l_3Gal β l~4Glc β1-)相似的結(jié)構(gòu)的存在。盡管已經(jīng)有很多人安全接種了脫氧膽酸鹽提取的含有殘余量L3LPS的小泡疫苗(G. Bjune 等人,Lancet (1991),338,1093-1096 ;GVG. Sierra 等人,NIPH anb (1991),14, 195-210),LOS糖末端部分的缺失可有利地防止與存在于人組織表面的結(jié)構(gòu)的任何交叉反應(yīng)。在優(yōu)選實施方案中,IgtB基因的滅活產(chǎn)生中間體LPS結(jié)構(gòu),其中缺少末端半乳糖殘基和唾液酸(突變留下L2和L3L0S中的4GlcNAc^ l-3Gal β l_4Glc31-結(jié)構(gòu))。這種中間體可在L3和L2LPS菌株中獲得。LPS的可選擇性且不太優(yōu)選的(短的)版本可通過關(guān)閉 IgtE基因獲得。LPS的其它選擇性且不太優(yōu)選的版本可通過關(guān)閉IgtA基因獲得。如果選擇這種lgtA_突變,優(yōu)選還可關(guān)閉IgtC表達(dá)從而防止形成非免疫原性LI免疫型。
LgtB-突變體是最優(yōu)選的,這是因為本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)這是用于解決安全性問題同時仍然保留可誘導(dǎo)殺菌抗體反應(yīng)的LPS保護性低聚糖表位的最佳截短。
因此,還包含L2或L3制品(純化的或在分離的皰中)的本發(fā)明免疫原性組合物或腦膜炎球菌皰制品通常有利地來源于奈瑟氏球菌菌株(優(yōu)選腦膜炎球菌),它們已被基因工程改造成永久性下調(diào)來源于IgtBUgtA或IgtE基因的功能性基因產(chǎn)物的表達(dá),優(yōu)選通過切斷基因,最優(yōu)選通過使基因啟動子和/或開放閱讀框的全部或一部分缺失。當(dāng)本發(fā)明上述免疫原性組合物來源于腦膜炎球菌B菌株時,還優(yōu)選除去莢膜多糖(其還包含人-樣糖結(jié)構(gòu))。雖然可將很多基因切斷以實現(xiàn)此目的,但本發(fā)明人有利地顯示優(yōu)選已將皰產(chǎn)生菌株進行基因工程改造以永久下調(diào)SiaD基因的功能性基因產(chǎn)物的表達(dá)(即,下調(diào)α -2-8聚唾液酸轉(zhuǎn)移酶的活性),優(yōu)選通過切斷基因,最優(yōu)選通過使基因啟動子和/或開放閱讀框的全部或一部分缺失。這種滅活在WO 01/09350中描述。SiaD (也被稱作synD)突變是多種突變中最有利的,可除去莢膜多糖的人-相似表位,這是因為突變中僅有一種對LOS保護性表位的生物合成沒有作用,因此在最終使用LOS作為保護性抗原的方法中是有利的,且對細(xì)菌生長的作用最小。因此本發(fā)明的優(yōu)選方面是上述皰免疫原性制品,其來源于lgtE_siaD_、lgtA_siaD_或優(yōu)選lgtB_siaD_腦膜炎球菌B突變株。所述菌株本身是本發(fā)明的另一方面。雖然由于上述原因siaD_突變是優(yōu)選的,但也可使用切斷腦膜炎球菌B莢膜多糖合成的其它突變。因此,可將皰產(chǎn)生菌株進行基因工程改造以永久下調(diào)來源于下列一種或·多種基因的功能性基因產(chǎn)物的表達(dá)ctrA、ctrB、ctrC、ctrD、synA(相當(dāng)于synX和siaA)、synB(相當(dāng)于siaB)或synC(相當(dāng)于siaC)基因,優(yōu)選通過切斷基因,最優(yōu)選通過使基因啟動子和/或開放閱讀框的全部或一部分缺失。IgtE-突變可與這些突變的一種或多種組合。優(yōu)選lgtB—突變與這些突變的一種或多種組合。因此本發(fā)明另一方面是上述皰免疫原性制品,其來源于腦膜炎球菌B的這種組合突變株。所述菌株本身是本發(fā)明的另一方面。含有各種Igt基因,包括IgtB和IgtE的奈瑟氏球菌基因座及其序列是本領(lǐng)域已知的(見Μ·Ρ· Jennings等人,Microbiology 1999,145,3013-3021和其中引證的參考文獻,以及 J. Exp. Med. 180 :2181-2190 [1994])。當(dāng)把全長(未-截短的)L0S用于終產(chǎn)品中時,希望LOS沒有被唾液酸化(因為這種LOS可產(chǎn)生抗絕大多數(shù)危險的、侵入性腦膜炎球菌B菌株的免疫反應(yīng),所述菌株也未被唾液酸化)。在這種情況下,使用具有缺失synA (相當(dāng)于synX和siaA)、synB(相當(dāng)于siaB)或synC(相當(dāng)于siaC)基因的莢膜陰性菌株是有利的,這是因為這種突變也可導(dǎo)致menB LOS不能被唾液酸化。在皰制品中,特別是在用低濃度DOC提取的制品中,可使用LPS作為本發(fā)明免疫原性組合物中的抗原。然而,可有利地將lgtE、IgtA(特別是與IgtC組合)、或優(yōu)選IgtB基因/基因產(chǎn)物的酶功能下調(diào)/缺失/滅活,以便除去人樣乳-N-neotetraose結(jié)構(gòu)。包含用于生物合成LPS低聚糖結(jié)構(gòu)的Igt基因的奈瑟氏球菌基因座(及其序列)是本領(lǐng)域已知的(Jennings 等人,Microbiology 1999 145 :3013-3021 和其中引證的參考文獻,以及 J. Exp.Med. 180 :2181-2190 [1994])。優(yōu)選IgtB (或功能性基因產(chǎn)物)被下調(diào)/缺失,這是因為它可留下完整的LPS保護性表位。在本發(fā)明的腦膜炎奈瑟氏球菌血清組B皰制品中,SiaD和IgtB的下調(diào)/缺失是優(yōu)選的,(雖然,在腦膜炎球菌B皰產(chǎn)生菌株中也可使用IgtIT與ctrA' ctrB' ctrC' ctrD\synA-(相當(dāng)于synJT和siaA)、synET(相當(dāng)于siaET)或syn(T(相當(dāng)于siaCT)中任何一個的組合),得到具有最佳安全性和LPS保護性表位保留的皰制品。本發(fā)明的另一方面是上述皰免疫原性制品,其來源于腦膜炎球菌B的這種組合突變株。所述菌株本身是本發(fā)明的另一方面。本發(fā)明的免疫原性組合物可包括至少1、2、3、4或5種不同的外膜小泡制品。當(dāng)包括兩種或多種OMV制品時,本發(fā)明至少個抗原在各OMV中被上調(diào)。這種OMV制品可來源于相同種類和血清組的奈瑟氏球菌菌株或優(yōu)選來源于不同種類、血清組、血清型、亞血清型或免疫型的奈瑟氏球菌菌株。例如,免疫原性組合物可包括一種或多種外膜小泡制品,其含有免疫型L2的LPS和含有免疫型L3的LPS的一種或多種外膜小泡制品。L2或L30MV制品優(yōu)選來源于穩(wěn)定的菌株,其在LPS低聚糖合成基因座具有最小的相變異性。
_2] 與亞單位組合物組合的外膜小泡 本發(fā)明的免疫原性組合物還可包括亞單位組合物和外膜小泡。有若干抗原由于它們的溶解性而特別適于包括在亞單位組合物中。這種蛋白的例子包括FhaB、NspA, Hsf的過客結(jié)構(gòu)域、Hap的過客結(jié)構(gòu)域、AspA的過客結(jié)構(gòu)域、AspA、0MP85、FrpA、FrpC、TbpB> LbpB>PilQ。外膜小泡制品具有選自下列的至少一種不同抗原,其在外膜小泡中已被重組上調(diào) NspA, Hsf、Hap、0MP85、TbpA(高)、TbpA(低)、LbpA, TbpB, LbpB, NadA, TspA, TspB, PilC,PilQ、TdfH, PorB, HpuB, P2086、NM-ADPRT, MafA, MafB 和 PldA ;且任選包括 LPS 免疫型 L2和LPS免疫型L3之一或兩者。
_4] 本發(fā)明具體的免疫原性組合物在下列具體組合中,當(dāng)抗原組合存在于泡中時,這種抗原組合應(yīng)如上所述被上調(diào)。本發(fā)明特別優(yōu)選的實施方案包括自體轉(zhuǎn)運蛋白和鐵獲得蛋白,更優(yōu)選Hsf和TbpA (高)和/或TbpA (低)。這種免疫原性組合物可優(yōu)選進一步包括OMP 85、FrpA、FrpC、LbpA, LbpB, Lipo28、Sibp、NMB0964、NMB0293、TspA、NadA, TspB、PilQ、FhaC, NspA、PldA,HimD, HisD、GNA1870、OspA、HlpA、FhaB, PilC、0mp26、NMB0315、NMB0995、NMB1119、TdfH,PorB、HpuB、P2086、NM-ADPRT、VapD和Hap中的至少一種。所有上述免疫原性組合物還可包括LPS免疫型L2和LPS免疫型L3之一或兩者。本發(fā)明的另一優(yōu)選實施方案包括Hsf和選自下列的至少一種其它抗原FrpA、FrpC、NM-ADPRT、VapD、LbpB、LbpA、TbpB、TbpA、P2086、HpuA、HpuB、Lipo28、Sibp、Hap、AspA、IgA 蛋白酶、0MP85、NspA、PilQ、HimD, HisD、GNA1870、OspA、HlpA、FhaC, NadA, PldA, TspA、TspB、TdfH, PorB和FhaB。所有上述免疫原性組合物還可包括LPS免疫型L2和LPS免疫型L3之一或兩者。優(yōu)選組合包括Hsf和0MP85(任選與Hap、FrpA或LbpB的一個或多個);Hsf和Hap (任選與FrpA、LbpB或0MP85的一個或多個);Hsf和FrpA (任選與Hap、LbpB或0MP85的一個或多個);Hsf和LbpB (任選與Hap、0MP85或FrpA的一個或多個)。由于Hsf既是粘附素又是自體轉(zhuǎn)運蛋白,因此特別優(yōu)選的組合包括Hsf、0MP85、TbpA、LPS免疫型L2和/或L3,優(yōu)選在多價皰制品中,其具有所提供的所有5組抗原的成員。優(yōu)選TbpA(低)和TbpA (高)均存在。本發(fā)明的另一免疫原性組合物包括FhaB和選自下列的至少一種其它抗原FrpA、FrpC、NM-ADPRT、VapD, LbpB、LbpA、TbpB、HpuA、HpuB, P2086、Lipo28、Sibp、NMB0964、NMB0293、TdfH, PorB、PldA、Hap、IgA 蛋白酶、AspA、PilQ、HimD, HisD、GNA1870、OspA、HlpA、0MP85、NspA、PilC、0mp26、NMB0315、NMB0995、NMB 1119、NadA, PldA、TbpA、Hsf, TspA 和TspB、以及LPS免疫型L2和LPS免疫型L3之一或兩者。優(yōu)選組合包括FhaB和Hsf (任選與0MP85、LbpB、Hap 或 FrpA 的一個或多個);FhaB 和 0MP85 (任選與 LbpB、Hap 或 FrpA 的一個或多個);FhaB和LbpB (任選與Hap或FrpA的一個或多個);FhaB和Hap (任選與FrpA)。優(yōu)選組合包括FhaB、LbpB、Hsf (作為0ΜΡ)和FrpA,其具有所提供的全部5組抗原的成員。本發(fā)明的另一免疫原性組合物包括NspA和選自下列的至少一種其它抗原FrpA、FrpC、NM-ADPRT、VapD、LbpB、LbpA、TbpB、TbpA、HpuA、HpuB、P2086、Lipo28、Sibp、NMB0964、NMB0293、Hap、0MP85、PilQ、AspA、IgA 蛋白酶、似(^、卩1(^、!18€、他?、丁8 八、丁8 8、丁(1邡、?0池、和LPS免疫型L2和LPS免疫型L3之一或兩者。優(yōu)選組合包括NspA和Hsf (任選與0MP85、Hap、LbpA或TbpA的一個或多個);NspA和0MP85 (任選與Hap、LbpA或TbpA的一個或多個);NspA和Hap (任選與LbpA或TbpA的一個或多個);NspA和LbpA (任選與TbpA)。特別優(yōu)選的組合包括NspA、Hsf、TbpA、LPS免疫型L2和/或L3,優(yōu)選在多價皰制品中,其具有所提供的全部5組抗原的成員。優(yōu)選TbpA(低)和TbpA(高)均存在。本發(fā)明沒有要求保護具有WO 00/25811中所公開的抗原的個別組合的免疫原性組合物。優(yōu)選,如果它們的抗原內(nèi)含物僅由轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合蛋白和NspA組成(或在皰疫苗中,上調(diào)的或富聚的抗原內(nèi)含物僅由轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合蛋白和NspA組成),則這類免疫原性組 合物或疫苗不包括在本發(fā)明內(nèi),然而可包括由NspA以及TbpA(高)和TbpA(低)組成或包括NspA以及TbpA(高)和TbpA(低)的特定抗原(或上調(diào)的抗原)組合。任選地,沒有要求保護包括轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合蛋白和NspA的組合(亞單位)或上調(diào)(皰)的組合物或疫苗。本發(fā)明另一免疫原性組合物包括NadA和選自下列的至少一種其它抗原FrpA、FrpC、NM-ADPRT、VapD, LbpB、LbpA、TbpB、TbpA、P2086、Lipo28、Sibp、NMB0964、NMB0293、Hap、0MP85、NspA、PilQ、HimD, HisD、GNA1870、OspA、HlpA、HpuA、HpuB、AspA、IgA 蛋白酶、PldA、Hsf、TspA、TspB、TdfH, PorB、以及 LPS 免疫型 L2 和 LPS 免疫型 L3 之一或兩者。本發(fā)明另一免疫原性組合物包括TbpA(低)和選自下列的至少一種抗原FrpA、FrpC、NM-ADPRT、VapD、LbpB、LbpA、TbpB、I gA 蛋白酶、NspA、HpuA、HpuB、Hap、0MP85、NspA (當(dāng)與 TbpA(高)組合時)、PilQ、HimD, HisD、GNA1870、OspA、HlpA、PilC、0mp26、NMB0315、NMB0995、NMBl 119、MafA、MafB, AspA、NadA、PldA、Hsf、TspA、TspB、TdfH, PorB 和 haB、以及LPS免疫型L2和LPS免疫型L3之一或兩者。優(yōu)選組合包括TbpA (低)和Hsf和LbpA ;TbpA (低)和0MP85 (任選與LbpA和Hap之一或兩者);TbpA (低)和LbpA和Hap。本發(fā)明另一免疫原性組合物包括TbpA(高)和選自下列的至少一種其它抗原FrpA、FrpC、NM-ADPRT, VapD, LbpB、LbpA、TbpB、Hap、0MP85、NspA (當(dāng)與 TbpA (低)組合)、PilC、0mp26、NMB0315、NMB0995、NMB 1119、PilQ、HimD, HisD、GNA1870、OspA、HlpA、MafA,MafB, AspA、IgA 蛋白酶、PldA、FhaB、NadA、PldA、Hsf、TspA、TspB、TdfH, PorB 和 FhaB、以及LPS免疫型L2和LPS免疫型L3之一或兩者。優(yōu)選組合包括TbpA (高)和Hsf和LbpA ;TbpA (高)和0MP85 (任選與LbpA和Hap之一或兩者);TbpA (高)和LbpA和Hap。本發(fā)明另一免疫原性組合物包括LbpA和選自下列的至少一個其它抗原FrpA、FrpC、NM-ADPRT、VapD, LbpB、TbpB、Hap、0MP85、NspA、PilC、Omp26, NMB0315、NMB0995、NMB1119、NadA, PldA、TbpA、Hsf、TspA、TspB、MafA, MafB, IgA 蛋白酶、AspA、FhaB、PilQ、HimD, HisD、GNA1870、OspA、HlpA、TdfH, PorB 和 FhaB 以及 LPS 免疫型 L2 和 LPS 免疫型 L3之一或兩者。優(yōu)選組合包括LbpA和Hsf (任選與Hap)。本發(fā)明另一免疫原性組合物包括LbpB和選自下列的至少一個其它抗原FrpA、FrpC、NM-ADPRT、VapD, LbpA、TbpB、Hap、0MP85、NspA、PilC、Omp26, NMB0315、NMB0995、NMB1119、NadA, PldA、TbpA、Hsf、TspA、TspB、MafA, MafB, IgA 蛋白酶、AspA、FhaB、PilQ、HimD、HisD、GNA1870、0spA、HlpA、TdfH、PorB 和 FhaB、以及 LPS 免疫型 L2 和 LPS 免疫型 L3之一或兩者。優(yōu)選組合包括LbpB和Hsf(任選與0MP85、Hap或FrpA的一個或多個);LbpB和0MP85 (任選與Hap或FrpA的一個或多個);LbpB和Hap (任選與FrpA)。本發(fā)明另一免疫原性組合物包括0MP85和選自下列的至少一個其它抗原FrpA、FrpC、NM-ADPRT、VapD, LbpB、LbpA、TbpB、TbpA、HpuA、HpuB、P2086、Lipo28、Sibp、NMB0964、NMB0293、Hap、IgA 蛋白酶、AspA、Hsf、NspA、PilC、0mp26、NMB0315、NMB0995、NMB1119、MafA、MafB、NadA、PldA、Hsf、TspA、TspB、PilQ、TdfH、PorB 和 FhaB、以及 LPS 免疫型 L2 和 LPS 免疫型L3之一或兩者。優(yōu)選組合包括0MP85和Hsf (任選與LbpA或NspA的一個或多個);0MP85和LbpA (任選與Hap和NspA的一個或多個);0MP85和Hap (任選與NspA)。
本發(fā)明另一免疫原性組合物包括Hap和選自下列的至少一個其它抗原FrpA、FrpC、NM-ADPRT、VapD, LbpB、LbpA、TbpB、TbpA、HpuA、HpuB、P2086、Lipo28、Sibp、NMB0964、NMB0293、PilQ、HimD, HisD、GNA1870、OspA、HlpA、NspA、IgA 蛋白酶、AspA、0MP85、NspA、PilC、0mp26、NMB0315、NMB0995、NMBl119、MafA, MafB, NadA, PldA、Hsf、TspA、TspB、TdfH,PorB和FhaB、以及LPS免疫型L2和LPS免疫型L3之一或兩者。本發(fā)明另一免疫原性組合物包括FrpA和選自下列的至少一個其它抗原LbpB、LbpA、TbpA、TbpB、HpuA、HpuB、P2086、Lipo28、Sibp、NMB0964、NMB0293、PilQ、HimD, HisD、GNA1870、OspA、HlpA、TspA、TspB、Hap、IgA 蛋白酶、AspA、NadA, FhaB、PilQ、HimD, HisD、GNA1870、OspA、HlpA、0MP85、NspA、PilC、0mp26、NMB0315、NMB0995、NMBl119、MafA, MafB,PldA、Hsf、TspA、TspB、TdfH, PorB 和 FhaB、以及 LPS 免疫型 L2 和 LPS 免疫型 L3 之一或兩者。本發(fā)明另一免疫原性組合物包括FrpC和選自下列的至少一個其它抗原LbpB、LbpA、TbpA、TbpB、HpuA、HpuB、P2086、Lipo28、Sibp、NMB0964、NMB0293、PilQ、HimD, HisD、GNA1870、OspA、HlpA、TspA、TspB、Hap、IgA 蛋白酶、AspA、NadA, FhaB、0MP85、NspA、PilC、0mp26、NMB0315、NMB0995、NMB1119、MafA、MafB、PldA、Hsf、TspA、TspB、TdfH、PorB 和 FhaB、以及LPS免疫型L2和LPS免疫型L3之一或兩者。本發(fā)明另一免疫原性組合物包括LPS免疫型L2和LPS免疫型L3之一或兩者以及選自下列的至少一個其它抗原LbpB、LbpA、TbpA、TbpB、HpuA、HpuB、P2086、Lipo28、Sibp、NMB0964、NMB0293、PilQ、HimD, HisD、GNA1870、OspA、HlpA、TspA、TspB、Hap、IgA 蛋白酶、AspA、NadA、FhaB、0MP85、NspA、PilC、0mp26、NMB0315、NMB0995、NMB1119、MafA、MafB、PldA、Hsf、TspA、TspB、TdfH, PorB 和 FhaB。本發(fā)明免疫原性組合物中的優(yōu)選抗原組合包括如下組合,該組合包含鐵獲得蛋白、自體轉(zhuǎn)運蛋白和FhaB ;鐵獲得蛋白、自體轉(zhuǎn)運蛋白和PilC ;鐵獲得蛋白、自體轉(zhuǎn)運蛋白和NadA ;鐵獲得蛋白、自體轉(zhuǎn)運蛋白和FrpA ;鐵獲得蛋白、自體轉(zhuǎn)運蛋白和PilQ ;鐵獲得蛋白、自體轉(zhuǎn)運蛋白和TspA ;鐵獲得蛋白、自體轉(zhuǎn)運蛋白和TspB ;鐵獲得蛋白、自體轉(zhuǎn)運蛋白和NspA ;鐵獲得蛋白、自體轉(zhuǎn)運蛋白和FrpC ;更優(yōu)選包含鐵獲得蛋白、自體轉(zhuǎn)運蛋白和Hap ;鐵獲得蛋白、自體轉(zhuǎn)運蛋白和FrpA/C ;鐵獲得蛋白、自體轉(zhuǎn)運蛋白和LbpB ;鐵獲得蛋白、自體轉(zhuǎn)運蛋白和0ΜΡ85Φ15)。最優(yōu)選,摻入0ΜΡ85Φ15)作為外膜小泡制品的一部分。包含LPS的本發(fā)明免疫原性組合物優(yōu)選具有與T-輔助細(xì)胞表位來源,優(yōu)選蛋白綴合的LPS,且就OMV中的LPS而言,優(yōu)選外膜蛋白。特別優(yōu)選的實施方案包括已經(jīng)與OMP在外膜小泡制品中(如上所述)原位(優(yōu)選皰內(nèi))綴合的LPS。本發(fā)明的免疫原性組合物可包括來源于腦膜炎奈瑟氏球菌血清組A、B、C、Y、W_135或淋病奈瑟氏球菌的抗原(蛋白、LPS和多糖)。優(yōu)選本發(fā)明的免疫原性組合物或疫苗不由W000/71725第3頁第18行-第52頁第2行表中所列的SEQ ID的特定組合和/或W000/71725中實施例1_11描述的任何單個
組合組成和/或含有這些組合。優(yōu)選,本發(fā)明不要求保護W001/52885中公開的個別組合。其它組合 本發(fā)明的免疫原性組合物還可包括細(xì)菌莢膜多糖或低聚糖。莢膜多糖或低聚糖可來源于下列一種或多種腦膜炎奈瑟氏球菌血清組A、C、Y、和/或W-135、流感嗜血桿菌b (Haemophilus influenzae b)、月市炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)、A 組鏈球菌、B組鏈球菌、金黃色葡萄球菌(Staphylococcas aureus)和表皮葡萄球菌(Stapylocoausepidermidis)。本發(fā)明另一方面是含有本發(fā)明抗原性組合物和其它抗原的疫苗組合物,其可有利地用于抗某些疾病狀況,包括與病毒或革蘭氏陽性菌有關(guān)的那些。在其中一個優(yōu)選組合中,本發(fā)明的抗原性組合物是用下列腦膜炎球菌莢膜多糖或低聚糖的1、2、3或優(yōu)選全部4種配制的,其可以是簡單的或與蛋白載體:A、C、Y或W-135綴合的。優(yōu)選本發(fā)明的免疫原性組合物是用A和C ;或C ;或C和Y配制的。這種含有源自腦膜炎奈瑟氏球菌,優(yōu)選血清組B的蛋白的疫苗可被有利地用作通用的腦膜炎球菌疫苗。在另一優(yōu)選實施方案中,本發(fā)明的抗原性組合物,優(yōu)選用簡單或綴合的腦膜炎球菌莢膜多糖或低聚糖A、C、Y或W-135的1、2、3或全部4種配制(如上所述)的,是用綴合的流感嗜血桿菌b莢膜多糖或低聚糖,和/或一種或多種簡單或綴合的肺炎球菌莢膜多糖或低聚糖配制的。任選地,所述疫苗還可包括一種或多種蛋白抗原,它們可保護宿主免受肺炎鏈球菌感染。這種疫苗可被有利地用作通用腦膜炎疫苗。在又一優(yōu)選實施方案中,本發(fā)明的免疫原性組合物是用來源于腦膜炎奈瑟氏球菌、流感嗜血桿菌b、肺炎鏈球菌、A組鏈球菌、B組鏈球菌、金黃色膿葡萄球菌或表皮葡萄球菌中一種或多種的莢膜多糖或低聚糖配制的。肺炎球菌的英膜多糖抗原優(yōu)選選自血清型1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F 和 33F(最優(yōu)選選自1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F)。進一步優(yōu)選的實施方案包括流感嗜血桿菌的PRP莢膜多糖。進一步優(yōu)選實施方案包括金黃色葡萄球菌的5型、8型或336莢膜多糖。進一步優(yōu)選實施方案包括表皮葡萄球菌的I型、II型或III型莢膜多糖。進一步優(yōu)選實施方案包括B組鏈球菌的Ia型、Ic型、II型或III型莢膜多糖。進一步優(yōu)選實施方案包括A組鏈球菌的莢膜多糖,優(yōu)選還包括至少一種M蛋白且更優(yōu)選多種類型的M蛋白。本發(fā)明這種莢膜多糖可與載體蛋白如破傷風(fēng)類毒素、破傷風(fēng)類毒素片段C、白喉類毒素、CRM197、肺炎球菌溶血素、蛋白D(US6342224)非-綴合或綴合。所述多糖綴合物可通過任何已知的偶聯(lián)技術(shù)制備。例如,可經(jīng)由硫醚鍵使多糖偶聯(lián)。這種綴合方法依靠用1-氰基-4-二甲氨基四氟硼酸吡啶錨(CDAP)活化多糖而形成氰酸酯?;罨嗵强梢虼伺c載體蛋白上的氨基直接偶聯(lián)或經(jīng)由間隔基團偶聯(lián)。優(yōu)選,使用包括形成硫醚鍵的雜絡(luò)合化學(xué)過程使氰酸酯與己二胺偶聯(lián),使氨基-衍生的多糖與載體蛋白偶聯(lián)。這種綴合物在PCT公開申請 W093/15760Uniformed Services University 中描述。綴合物還可通過如US 4365170 (Jennings)和 US4673574 (Anderson)中描述的直接還原胺化方法制備。其它方法在EP-0-161-188、EP-208375和EP-0-477508中描述。其它方法包括通過碳二亞胺縮合使己二酸酰肼(ADH)衍生的溴化氰活化的多糖與蛋白載體偶聯(lián)(Chu C.等人,Infect.1mmunity, 1983245256)。當(dāng)包括低聚糖時,優(yōu)選使它們綴合在一起。優(yōu)選的肺炎球菌蛋白抗原是在肺炎球菌外表面上暴露的那些肺炎球菌蛋白(在肺炎球菌至少部分生活周期內(nèi)能夠由宿主免疫系統(tǒng)識別),或是由肺炎球菌分泌或釋放的蛋白。最優(yōu)選,所述蛋白是毒素、粘附素、2-組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白、或肺炎鏈球菌的脂蛋白,或其片段。特別優(yōu)選的蛋白包括,但不限于肺炎球菌溶血素(優(yōu)選通過化學(xué)處理或突變解毒)[Mitchell 等人,Nucleic Acids Res. 1990 年 7 月 11 日:18(13) :4010 “Comparisonof pneumolysin genes and proteins from Streptococcus pneumoniae types I and 2. ”, Mitchell 等人,Biochim Biophys Acta 1989 年 I 月 23 日;1007(1) :67-72,“Expression of the pneumolysin gene in Escherichia coli rapid purificationand biological properties. ”,WO 96/05859(A. Cyanamid)> WO 90/06951 (Paton 等人)、WO 99/03884 (NAVA) ] ;PspA 及其跨膜缺失變體(US 5804193-Briles 等人);PspC及其跨膜缺失變體(W0 97/09994-Briles等人);PsaA及其跨膜缺失變體(Berry和 Paton, Infect Tmmun 1996 年 12 月;64(12) :5255-62, “Sequence heterogeneityof PsaA, a 37_kilodalton putative adhesin essential for virulence ofStreptococcuspneumoniae”);肺炎球菌膽堿結(jié)合蛋白及其跨膜缺失變體;CbpA及其跨膜缺失變體(W097/4115UW0 99/51266);甘油醛_3_磷酸-脫氫酶(Infect.1mmun. 1996 64 3544) ;HSP70 (WO 96/40928) ;PcpA(Sanchez_Beato 等人,F(xiàn)EMS Microbiol Lett 1998,164 207-14) ;M樣蛋白(EP 0837130)和粘附素18627 (EP 0834568)。進一步優(yōu)選的肺炎球菌蛋白抗原是W098/18931中公開的那些,特別是W098/18930和PCT/US99/30390中選擇的那些。本發(fā)明的免疫原性組合物/疫苗還可任選包括由其它革蘭氏陰性菌,例如粘膜炎莫拉氏菌(Moraxella catarrhal is)或流感嗜血桿菌制備的外膜小泡制品。站月旲炎吳垃氏囷桐制品本發(fā)明的免疫原性組合物還可包括來源于粘膜炎莫拉氏菌的OMV制品。如W001/09350所述,基因工程改造的OMV制品可來源于粘膜炎莫拉氏菌。優(yōu)選將下列基因(編碼保護性抗原)的一種或多種上調(diào)0MP106(W097/41731和W096/34960)、HasR(PCT/EP99/03824)、PilQ (PCT/EP99/03823)、0MP85 (PCT/EP00/01468)、lipo06 (GB9917977. 2)、IipolO (GB 9918208.1)、lipoll (GB 9918302.2)、lipol8(GB 9918038. 2)、P6 (PCT/EP99/03038)、ompCD、CopB(Helminen ME 等人,(1993)Infect.1mmun. 61 :2003-2010)、D15 (PCT/EP99/03822)、OmplAl (PCT/EP99/06781)、Hly3 (PCT/EP99/03257)、LbpA 和LbpB(WO 98/55606)、TbpA 和 TbpB(W097/13785 和 WO 97/32980)、OmpE、UspAl 和 UspA2(WO93/03761)、和0mp21。作為可被異源引入到其他革蘭氏陰性菌中的基因,它們也是優(yōu)選的。優(yōu)選將下列基因的一個或多個下調(diào)CopB、OMP106, OmpBU TbpA、TbpB、LbpA、和LbpB0優(yōu)選將下列基因的一個或多個下調(diào)htrB、msbB和ΙρχΚ。優(yōu)選將下列基因的一個或多個上調(diào)pmrA、pmrB、pmrE、和pmrF。流感嗜血■桿菌皰制品本發(fā)明的免疫原性組合物還可包括來源于流感嗜血桿菌的OMV制品。如W001/09350所述,基因工程改造的OMV制品可來源于流感嗜血桿菌。優(yōu)選將下列基因(編碼保護性抗原)的一個或多個上調(diào)D15(W094/12641)、P6(EP 281673)、TbpA (W096/40929、W095/13370)、TbpB (W096/40929 ;W095/13370)、P2、P5 (W094/26304)、0MP26 (W097/01638)、HMWl、HMW2、HMW3、HMW4、Hia、Hsf、Hap、Hin47、和Hif (該操縱子中的所有基因均應(yīng)被上調(diào)以將菌毛蛋白上調(diào))。作為可被異源引入到其他革蘭氏陰性菌中的基因,它們也是優(yōu)選的。
優(yōu)選將下列基因的一個或多個下調(diào)P2、P5、Hif、IgAl_蛋白酶、HgpA、HgpB、HMWl、HMW2、Hxu、htrB、msbB 和 IpxK。優(yōu)選將下列基因的一個或多個上調(diào)pmrA、pmrB、pmrE、和pmrF。本發(fā)明的免疫原性組合物/疫苗還可任選包括抗白喉、破傷風(fēng)和百日咳鮑特氏菌(Bordetella pertussis)感染中一種或多種的抗原。百日咳鮑特氏菌組分可被殺死,無論是全細(xì)胞百日咳鮑特氏菌(Pw)還是無細(xì)胞的百日咳鮑特氏菌(Pa),其包含來源于PT、FHA和69kDapertactin的至少一種抗原(優(yōu)選2或所有3種)。通常,提供抗白喉和破傷風(fēng)保護的抗原是白喉類毒素和破傷風(fēng)類毒素。類毒素是化學(xué)滅活的毒素或通過引入點突變而滅活的毒素。免疫原性組合物/疫苗還可任選地包括一種或多種保護宿主免受非-分型(non-typeable)流感嗜血桿菌、RSV感染的抗原和/或一種或多種可保護宿主免受流感病毒感染的抗原。這種疫苗可有利地用作通用中耳炎疫苗。優(yōu)選的非分型流感嗜血桿菌蛋白抗原包括絲束蛋白(US 5766608)和含有來自絲束蛋白的肽的融合蛋白(例如,LBl融合蛋白)(US5843464_0hio State ResearchFoundation)、0MP26、P6、蛋白 D、TbpA、TbpB、Hia、Hmwl> Hmw2> Hap、和 D15。優(yōu)選的流感病毒抗原包括完整的、活的或滅活的病毒、脫落流感病毒,其在卵或MDCK細(xì)胞中生長,或非洲綠猴腎細(xì)胞株系細(xì)胞或完整的流感病毒體(如R.Gluck,Vaccine,1992,10,915-920所述)或其純化或重組蛋白,如HA、NP、NA、或M蛋白、或其組合。優(yōu)選的RSV (呼吸道合胞病毒)抗原包括F糖蛋白、G糖蛋白、HN蛋白、M蛋白或其衍生物。本發(fā)明的免疫原性組合物可包括粘膜炎莫拉氏菌蛋白,包括TbpA(W097/13785 ;W099/52947)、TbpB(W097/13785 ;W099/52947 ;Mathers 等人,F(xiàn)EMS Immunol Med Microbiol1997 19 ;231-236 ;Myers 等人 Infect Immun 1998 66 ;4183_4192)、LbpA、LbpB (Du 等人,Infect Tmmun 1998 66 ;3656_3665)、UspAl、UspA2 (Aebi 等人,Infect TmMin. 1997 65;4367-4377)、OMP106 (US6214981)、Ton-B 依賴性受體(W000/78968)、CopB (Sethi 等人,Infect.1mmun. 199765 ;3666_3671)、和 HasR受體(W000/78968);流感嗜血桿菌的蛋白包括HMW(St Geme 等人,Infect Immunl99866 ;364_368)、Hia (St Geme 等人,J. Bacteriol. 2000182 ;6005-6013)、Tbpl(W096/40929 ;W095/13370)、Tbp2 (W096/40929 ;W095/13370 ;Gray-Owen 等人,Infect Tmmun 1995 63 ; 1201-1210)、LbpA、LbpB (Schryvers 等人,1989,29 :121-130) ,HasR, Ton B-依賴性受體(Fleishmann 等人,Science 1995 269 ;496_512)、血紅蛋白 _ 結(jié)合蛋白、HhuA (Cope 等人,Infect Tmmun 200068 ;4092-4101) > HgpA (Maciver等人,Infect Tmmun 199664 ;3703_3712)、HgbA、HgbB 和 HgbC(Jin 等人,Infect Tmmun199664 ;3134-3141)、HxuA(Cope 等人,Mol Microbiol 1994 13 ;863_873)、HxuC(Cope等人,Infect Immun 200169 ;2353-2363);來源于腦膜炎奈瑟氏球菌的蛋白,包括Tbpl、Tbp2、FbpA、FbpB、BfrA、BfrB (Tettelin 等人,Science 2000 287 ; 1809-1815)、LbpA、LbpB和 HmbR。疫苗制劑本發(fā)明的優(yōu)選實施方案是還可含有藥學(xué)上可接受賦形劑或載體的本發(fā)明免疫原性組合物的疫苗制劑。來源于上述任何一種修飾菌株的外膜小泡制品的制備可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟 知的任何一種方法實現(xiàn)。優(yōu)選使用EP 301992、US5,597,572、EP 11243或US 4,271,147中公開的方法。更優(yōu)選使用W001/09350中描述的方法。疫苗制品通常在疫苗設(shè)計中描述(“The subunit and adjuvant approach^(edsPowell M. F. & Newman M. J.) (1995) Plenum Press New York)。本發(fā)明的疫苗制劑中可向本發(fā)明的抗原性組合物施加佐劑。適宜的佐劑包括鋁鹽如氫氧化鋁凝膠(明礬)或磷酸鋁,但還可以是鈣鹽(特別是碳酸鈣)、鐵鹽或鋅鹽,或可以是酰化酪氨酸或?;牵栯x子或陰離子衍生的多糖或聚磷腈的不溶性懸浮液。可使用的適宜Thl佐劑系統(tǒng)包括單磷?;怉,特別是3-脫-O-?;瘑瘟柞;怉和單磷?;怉、優(yōu)選3-脫-O-酰化單磷?;怉 (3D-MPL)與鋁鹽(優(yōu)選磷酸鋁)的組合。增強的系統(tǒng)包括單磷?;怉和皂苷衍生物的組合,特別是WO 94/00153中公開的QS21與3D-MPL的組合,或如WO 96/33739中公開的反應(yīng)原性較低的組合物,其中用膽固醇猝滅QS21。WO 95/17210中描述了特別有效的、包含QS21 3D-MPL和生育酚的水包油乳液的佐劑,且其是優(yōu)選的制劑。所述疫苗可包括皂苷,更優(yōu)選QS21。它還可包括水包油乳液和生育酚。含有寡核苷酸的未甲基化的CpG(W0 96/02555)是THl反應(yīng)的優(yōu)選誘導(dǎo)劑,且適用于本發(fā)明。本發(fā)明的疫苗制品可用于保護或治療易感染的哺乳動物,其中經(jīng)由全身或粘膜途徑給予所述疫苗。這些給藥可包括經(jīng)由肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮內(nèi)或皮下途徑注射;或經(jīng)由粘膜給予口腔/消化、呼吸、泌尿生殖道。因此本發(fā)明其中一個方面是使人類宿主免疫而抗革蘭氏陰性菌感染所引起的疾病的方法,該方法包括給予所述宿主免疫保護劑量的本發(fā)明OMV制品O選擇每個疫苗劑型中的抗原量,其可誘導(dǎo)免疫保護反應(yīng)且沒有一般疫苗的明顯的副作用。這種量可根據(jù)所用的特定免疫原以及如何提供而變化。通常預(yù)期每個劑型包含1-100 μ g蛋白抗原或OMV制品,優(yōu)選5-50 μ g,且最一般5-25 μ g。特定疫苗的最佳用量可通過標(biāo)準(zhǔn)研究確定,該標(biāo)準(zhǔn)研究包括觀察受試者中的適宜免疫反應(yīng)。初次接種后,受試者可接受一次或若干次適當(dāng)間隔的加強免疫。本發(fā)明的疫苗優(yōu)選是免疫保護性且無毒的,并適于兒童和青少年使用。給兒科使用時,它是指小于4歲的兒童。免疫保護性是指令人滿意地滿足上述SBA和/或動物保護模型和/或粘附阻斷測定法。無毒是指通過熟知的LAL和熱原性測定法測量,疫苗中的內(nèi)毒素活性水平不大于令人滿意的水平。本發(fā)明的多核苷酸“多核苷酸”通常是指任何多核糖核苷酸或多脫氧核糖核苷酸,其可以是未修飾的RNA或DNA或修飾的RNA或DNA。“多核苷酸”包括但不限于單鏈和雙鏈的DNA,單鏈和雙鏈區(qū)混合的DNA,單鏈和雙鏈的RNA,單鏈和雙鏈區(qū)混合的RNA,包含單鏈或,更通常雙鏈或單鏈與雙鏈區(qū)混合的DNA和RNA的雜交分子。此外“多核苷酸”是指包含RNA或DNA或同時包含RNA與DNA的三鏈區(qū)。術(shù)語多核苷酸還包括含有一個或多個修飾堿基的DNA或RNA,和具有由于穩(wěn)定性或其它原因而被修飾的主鏈的DNA或RNA?!靶揎棥眽A基包括 ,例如,三苯甲基化的堿基和特殊堿基如肌苷。已經(jīng)對DNA和RNA進行了各種修飾;因此,“多核苷酸”包括一般天然存在的多核苷酸的化學(xué)、酶或代謝修飾形式,以及病毒和細(xì)胞特征性的DNA和RNA的化學(xué)形式?!岸嗪塑账帷边€包括相對較短的多核苷酸,通常被稱作寡核苷酸。本發(fā)明另一方面涉及免疫/疫苗制劑,其包含一種或多種多核苷酸。這種技術(shù)是本領(lǐng)域已知的,見,例如Wolff等人,Science (1990) 247 :1465-8。這種疫苗包含編碼與上述本發(fā)明蛋白組合相對應(yīng)的多種蛋白的一種或多種多核苷酸。來源于這種多核苷酸的蛋白的表達(dá)將受到真核啟動子的控制,該啟動子能夠驅(qū)動在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。此外所述多核苷酸可包含編碼其它抗原的序列??沈?qū)動表達(dá)的真核啟動子的例子包括來源于病毒的病毒啟動子,包括腺病毒啟動子、逆轉(zhuǎn)錄病毒啟動子。可選擇性地,哺乳動物啟動子可用于驅(qū)動表達(dá)。本發(fā)明其它方面本發(fā)明另一方面包括用于治療或預(yù)防奈瑟氏球菌病的方法,包括在宿主需要時,給予其保護劑量(或有效量)的本發(fā)明疫苗。腦膜炎奈瑟氏球菌血清組A、B、C、Y或W135和/或淋病奈瑟氏球菌感染可被有利地預(yù)防或治療。本發(fā)明還包括本發(fā)明疫苗在制備用于治療或預(yù)防奈瑟氏球菌感染的藥物中的用途。此外奈瑟氏球菌感染包括由腦膜炎奈瑟氏球菌血清組A、B、C、Y、W-135和/或淋病奈瑟氏球菌引起的感染。本發(fā)明另一方面是可衍生本發(fā)明外膜小泡(如上所述,具有本發(fā)明重組上調(diào)的至少兩種蛋白)的基因工程改造的奈瑟氏球菌菌株。這種奈瑟氏球菌菌株可以是腦膜炎奈瑟氏球菌或淋病奈瑟氏球菌。所述菌株還可被改造(如上所述)以下調(diào)其它奈瑟氏球菌蛋白的表達(dá),包括LgtB、LgtE、SiaD, OpC, OpA, PorA, FrpB, msbB 和 HtrB 中 1、2、3、4、5、6、7 或 8 個的表達(dá)。用于下調(diào)的優(yōu)選組合包括至少LgtB和SiaD的下調(diào)(優(yōu)選缺失)、至少PorA和OpC的下調(diào)、至少PorA和OpA的下調(diào)以及至少PorA、OpA和OpC的下調(diào)。本發(fā)明另一方面是制備本發(fā)明免疫原性組合物或疫苗的方法。這些方法包括將至少兩種來源于奈瑟氏球菌的分離抗原或蛋白混合在一起的步驟,其可以以來源于本發(fā)明奈瑟氏球菌菌株的皰形式存在,從而制備本發(fā)明的免疫原性組合物,另一制備本發(fā)明疫苗的方法包括將本發(fā)明的免疫原性組合物與藥學(xué)上可接受的載體組合的步驟。
也包括在本發(fā)明中的制備本發(fā)明免疫原性組合物的方法包括分離奈瑟氏球菌培養(yǎng)物中的外膜小泡的步驟。這種方法可包括將至少兩種外膜小泡制品混合的又一步驟,優(yōu)選其中至少一種外膜小泡制品包含免疫型L2的LPS且至少一種外膜小泡制品包含免疫型L3的LPS。本發(fā)明還包括這種方法,其中所述外膜小泡制品是通過用0-0. 5%濃度的DOC提取而分離的。O. 3%-O. 5%濃度的DOC用于將LPS含量減到最小。在OMV制品中,其中LPS作為抗原是保守的,0-0. 3%、優(yōu)選O. 05% -0.2%、最優(yōu)選約O.1 %濃度的DOC用于提取。血■影細(xì)胞或被殺死的全細(xì)胞疫苗本發(fā)明人預(yù)期對皰制品和疫苗的上述改進可很容易地擴展至血影細(xì)胞或被殺死的全細(xì)胞制品和疫苗(具有相同的優(yōu)點)??蓮钠渲苽浒捴破返谋景l(fā)明修飾的革蘭氏陰性菌菌株還可用于制備血影細(xì)胞和被殺死的全細(xì)胞制品。從革蘭氏陰性菌菌株制備血影制品(具有完整外膜的空細(xì)胞)是本領(lǐng)域熟知的(見例如WO 92/01791)。殺死全細(xì)胞以制備用于疫苗中的滅活細(xì)胞制品的方法也是熟知的。術(shù)語‘皰[或0MV]制品’和‘皰[或0MV]疫苗’以及本文獻所描述的方法因此,因本發(fā)明目的起見,可分別應(yīng)用于本發(fā)明的術(shù)語‘血影制品’和‘血影疫苗’和‘被殺死的全細(xì)胞制品’和‘被殺死的全細(xì)胞疫苗’?!た怪旰捅粍用庖弑景l(fā)明另一方面是制備用于預(yù)防或治療奈瑟氏球菌感染的免疫球蛋白的方法,包括用本發(fā)明疫苗使受體免疫并分離受體中免疫球蛋白的步驟。通過該方法制備的免疫球蛋白是本方面的另一方面。包含本發(fā)明免疫球蛋白以及藥學(xué)上可接受載體的藥物組合物是本發(fā)明的另一方面,其可制備用于治療或預(yù)防奈瑟氏球菌病的藥物。用于治療或預(yù)防奈瑟氏球菌感染的方法是本發(fā)明的另一方面,該方法包括給予患者有效量的本發(fā)明的藥物制品。用于多克隆抗體產(chǎn)生的接種物通常是通過將抗原性組合物分散在適于人類使用的生理學(xué)耐受的稀釋劑,如生理鹽水或其它佐劑中,從而形成含水組合物而制備的。將免疫刺激量的接種物給予哺乳動物,然后使接種的哺乳動物維持一段時間,這段時間足以使抗原性組合物誘導(dǎo)保護性抗體??赏ㄟ^熟知的技術(shù),如親和層析分離抗體至所需的程度(Harlow和LaneAntibodies ;a laboratory manual 1988)。抗體可包括來源于通常使用的各種動物,例如,山羊、靈長類動物、驢、豬、馬、豚鼠、大鼠或人的抗血清制品。給所述動物抽血并回收血清。按照本發(fā)明生產(chǎn)的免疫球蛋白可包括完整的抗體、抗體片段或亞片段??贵w可以是任何種類,例如IgG、IgM、IgA、IgD或IgE的完整免疫球蛋白,嵌合抗體或?qū)Ρ景l(fā)明兩種或多種抗原具有雙重特異性的雜交抗體。它們還可以是片段,例如F(ab' )2、Fab’、Fab、Fv等,包括雜交片段。免疫球蛋白還包括天然的、合成的或基因工程改造的蛋白,它們可通過與特異性抗原結(jié)合形成復(fù)合體而像抗體一樣發(fā)揮作用??蓪⒈景l(fā)明的疫苗給予受體,然后受體作為免疫球蛋白的來源發(fā)揮作用,該免疫球蛋白是在應(yīng)答特異性疫苗的攻擊時產(chǎn)生的。然后經(jīng)由常規(guī)的血漿分離方法從如此治療過的受試者所捐獻的血漿中獲得超免疫球蛋白。將所述超免疫球蛋白給予另一受試者,從而產(chǎn)生抗或治療奈瑟氏球菌感染的抗性。本發(fā)明的超免疫球蛋白特別用于治療或預(yù)防兒童、無免疫應(yīng)答個體或在需要治療對而個體在應(yīng)答接種免疫時沒時間產(chǎn)生抗體的奈瑟氏球菌病。本發(fā)明另一方面是一種藥物組合物,它包含對本發(fā)明免疫原性組合物至少兩種組分具有反應(yīng)性的兩種或多種單克隆抗體(或其片段;優(yōu)選人或人源化的),該藥物組合物可用于治療或預(yù)防革蘭氏陰性菌,優(yōu)選奈瑟氏球菌,更優(yōu)選腦膜炎奈瑟氏球菌或淋病奈瑟氏球菌,最優(yōu)選腦膜炎奈瑟氏球菌血清組B所引起的感染。這種藥物組合物包括單克隆抗體,它們可以是任何種類,例如IgG、IgM、IgA、IgD或IgE的完整免疫球蛋白,嵌合抗體或?qū)Ρ景l(fā)明兩種或多種抗原具有特異性的雜交抗體。它們還可以是片段,例如F(ab' )2、Fab'、Fab、Fv等,包括雜交片段。制備單克隆抗體的方法是本領(lǐng)域熟知的,且包括脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的融合體(Kohler 和 Milstein 1975 Nature 256 ;495 ;Antibodies-a laboratory manual Harlowand Lane 1988)??蛇x擇性地,單克隆Fv片段可通過篩選適宜的噬菌體展示庫而獲得(Vaughan TJ 等人,1998 Nature Biotechnology 16 ;535)。利用已知方法,單克隆抗體可以是人源化的或部分人源化的。本專利說明書中引證的所有參考文獻或?qū)@暾埦璉入此處作為參考。 本發(fā)明人指出此處每個例子中的術(shù)語“包括(comprising) ”、“包括(comprise)”和“包括(comprises) ”可分別任選用“由的組成(consisting of)”、“由的組成(consistof)”和“由的組成(consists of)”替代。本發(fā)明的工業(yè)應(yīng)用方法除非另有詳細(xì)描述,下面的實施例是使用本領(lǐng)域那些技術(shù)人員熟知且常規(guī)的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進行的。實施例僅是舉例說明,而不是對本發(fā)明的限制。實施例1 :構(gòu)建用于外膜小泡制品中的腦膜炎奈瑟氏球菌血■清組B的方法W001/09350提供用于制備外膜小泡并處理衍生外膜小泡的細(xì)菌菌株的詳細(xì)方法。當(dāng)外膜小泡保留有脂蛋白如TbpB或脂多糖時,優(yōu)選使用低水平或不使用脫氧膽酸鹽的分離方法。實施例2 =Hsf蛋白抗原在缺少功能性cps基因但表達(dá)PorA的重組腦膜類奈瑟氏球菌血清組B菌株中的上調(diào)如W001/09350實施例中所述,在某些國家,PorA在外膜小泡中的存在可能是有利的,且可增強重組改良泡的疫苗功效。在下列實施例中,我們使用修飾的PCMK⑴載體上調(diào)Hsf蛋白抗原在缺少功能性cps基因但表達(dá)PorA的菌株中的表達(dá)。原始的pCMK(+)載體包括在表達(dá)Iacltl的大腸桿菌宿主中被抑制,但在腦膜炎奈瑟氏球菌中是轉(zhuǎn)錄活性的嵌合porA/lacO啟動子。在修飾的pCMK(+)中,天然的porA啟動子用于驅(qū)動hsf基因的轉(zhuǎn)錄。編碼Hsf的基因是使用下表中提供的HSRU-Ndel和HSF 02_NheI寡核苷酸引物進行PCR擴增的。由于HSRU-Ndel引物的序列,所表達(dá)Hsf蛋白的5’末端包括兩個甲硫氨酸殘基。PCR擴增所用的條件是由供應(yīng)商描述的那些(HiFi DNA聚合酶,Boehringer Mannheim, GmbH)。熱循環(huán)如下25次(940C I分鐘,48°C I分鐘,72°C 3分鐘)和I次(72°C 10分鐘,4°C直到回收)。隨后在pCMK(+)送遞載體相應(yīng)限制位點中克隆相應(yīng)的擴增子。在該重組質(zhì)粒中,即所設(shè)計的pCMK(+)-Hsf中,我們通過重組PCR策略使存在于嵌合porA/lacO啟動子中的IacO缺失。pCMK(+) -Hsf質(zhì)粒被用作模板以使下列2個單獨的DNA片段PCR擴增-片段I包括porA5’誘重組區(qū),卡那霉素抗性基因和porA啟動子。所用的寡核苷酸引物RPl (SacII)和RP2在下表中提供。RPl引物與緊在Iac操縱子上游的序列同源。-片段2包括來源于porA基因的Shine-DalRarno序列、hsf基因和porA3’重組區(qū)。所用的寡核苷酸引物RP3和RP4(ApaI)在下表中提供。RP 3引物與緊在Iac操縱子下游的序列同源。片段I的3’末端和片段2的5’末端具有48個堿基重疊。將各500ngPCR(1和2)用于使用引物RPl和RP4進行的終PCR反應(yīng)。將所得的終擴增子亞克隆到用SacII和ApaI限制酶切的pSL1180載體中。使用QIAGEN maxiprep試劑盒大規(guī)模純化修飾質(zhì)粒pCMK(+)-Hsf,并將2 μ g該材料用于轉(zhuǎn)化缺少功能性cps基因的腦膜炎奈瑟氏球菌血清組B菌株。為了維持porA的表達(dá),通過PCR和蛋白質(zhì)印跡篩選方法的組合來選擇單一交換產(chǎn)生的整合。將通過porA-特異性PCR和蛋白質(zhì)印跡被證實為陽性的卡那霉素抗性克隆在-70°C以甘油原液貯存用于進一步的研究。將細(xì)菌(相當(dāng)于約5.1O8個細(xì)菌)重懸浮于50 μ I PAGE-SDS緩沖液中,冷凍(_20°C ) /沸騰(100°C ) 3次,然后通過PAGE-SDS電泳在12. 5%凝膠上分離。Hsf 的表達(dá)是在來源于 NmB[Cps-, PorA+]或 NmB[Cps_, PorA+, Hsf+]的全細(xì)胞細(xì)菌溶菌產(chǎn)物(WCBL)中檢測的??捡R斯染色可檢測出Hsf表達(dá)的顯著增加(相當(dāng)于內(nèi)源性Hsf水平)。該結(jié)果證實修飾pCMK(+)-Hsf載體是功能性的且可成功用于上調(diào)外膜蛋白的表達(dá),不會消除主要PorA外膜蛋白抗原的產(chǎn)生。這項工作中使用的寡核苷酸
權(quán)利要求
1.一種包括兩種或多種不同抗原的免疫原性組合物,其中所述抗原選自下列種類中的至少兩個a)至少一種奈瑟氏球菌粘附素;b)至少一種奈瑟氏球菌自體轉(zhuǎn)運蛋白;c)至少一種奈瑟氏球菌毒素;d)至少一種奈瑟氏球菌Fe獲得蛋白;或e)至少一種奈瑟氏球菌膜相關(guān)蛋白,優(yōu)選整合外膜蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫原性組合物,其中所述抗原選自下列種類中的至少兩個a)選自FhaB、NspA、PilC、Hsf、Hap、MafA、MafB、0mp26、NMB0315、NMB 0995, NMB 1119 和NadA的至少一種奈瑟氏球菌粘附素;b)選自Hsf、Hap、IgA蛋白酶、AspA和NadA的至少一種奈瑟氏球菌自體轉(zhuǎn)運蛋白;c)選自FrpA、FrpC、FrpA/C、VapD、NM-ADPRT、以及 LPS 免疫型 L2 和 LPS 免疫型 L3 之一或兩者的至少一種奈瑟氏球菌毒素;d)選自TbpA 高、TbpA 低、TbpB 高、TbpB 低、LbpA> LbpB> P2086、HpuA> HpuB> Lipo28、 Sibp, FbpA, BfrA, BfrB, Bcp, NMB 0964和NMB 0293的至少一種奈瑟氏球菌Fe獲得蛋白; 或e)選自PilQ、OMP 85、FhaC, NspA, TbpA(高)、TbpA(低)、LbpA, HpuB, TspA, TspB, TdfH, PorB, HimD, HisD, GNA 1870、OstA、HlpA、MltA、NMB 1124、NMB 1162、NMB 1220、NMB 1313、NMB 1953、HtrA和PldA的至少一種奈瑟氏球菌膜相關(guān)蛋白,優(yōu)選整合外膜蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的免疫原性組合物,其是亞單位組合物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的免疫原性組合物,它包括選自FhaB、NspA、Hsf的過客結(jié)構(gòu)域、 Hap 的過客結(jié)構(gòu)域、OMP 85 的表面外露結(jié)構(gòu)域、FrpA、FrpC、TbpB、LbpB、PldA、PilC、Lipo28 以及LPS免疫型L2和LPS免疫型L 3之一或兩者的至少2種抗原。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的免疫原性組合物,它包括外膜小泡制品,其中所述抗原在外膜小泡中已被(優(yōu)選重組)上調(diào)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的免疫原性組合物,它包括在外膜小泡中已被上調(diào)的選自下列的至少兩種抗原:NspA、Hsf、Hap、OMP 85、AspA、HpuA、HpuB> TspA、TspB> FhaC、TbpA (高)、 TbpA (低)、LbpA, TbpB、LbpB、PilQ、NM-ADPRT, P2086、TdfH, PorB, MafA, MafB, HimD, HisD、 GNA 1870、0stA、HlpA、MltA和PldA ;且任選包括LPS免疫型L2和LPS免疫型L3之一或兩者。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的免疫原性組合物,它包括具有一種或多種抗原的亞單位組合物,和具有在外膜小泡中已被上調(diào)的至少一種抗原的外膜小泡制品。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的免疫原性組合物,它包括亞單位組合物和外膜小泡制品,其中所述亞單位組合物包括選自下列的至少一種抗原FhaB、NspA、Hsf的過客結(jié)構(gòu)域、Hap的過客結(jié)構(gòu)域、OMP 85的表面外露結(jié)構(gòu)域、FrpA、FrpC、TbpB、LbpB、PilC、Lipo28,且所述外膜小泡制品具有在外膜小泡中已被重組上調(diào)的選自下列的至少一種不同抗原NspA、Hsf, Hap、OMP 85、AspA、HpuA、HpuB、TspA、TspB、FhaC、TbpA(高)>TbpA(低)、LbpA、TbpB、LbpB、 PilQ、NM-ADPRT、P2086、TdfH,PorB、MafA、MafB、HimD、HisD、GNA 1870、OstA、HlpA、MltA 和PLdA ;且任選包括LPS免疫型L2和LPS免疫型L3之一或兩者,優(yōu)選在外膜小泡制品內(nèi)。
9.根據(jù)權(quán)利要求5-8所述的免疫原性組合物,它包括權(quán)利要求5或6的至少兩種不同的外膜小泡制品。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的免疫原性組合物,其中一種外膜小泡制品是免疫型L2且另一種外膜小泡制品是免疫型L3。
11.根據(jù)權(quán)利要求1、2、5、6、7、8、9或10所述的免疫原性組合物,其中選擇Hsf和 TbpA (高)。
12.根據(jù)權(quán)利要求1-2或5-11所述的免疫原性組合物,其中選擇Hsf和TbpA(低)。
13.根據(jù)權(quán)利要求11或12所述的免疫原性組合物,其中還選擇選自Hap、LbpB、0MP85 和FrpA的一種或多種的附加抗原。
14.根據(jù)權(quán)利要求11-13所述的免疫原性組合物,其中還選擇LPS免疫型L2。
15.根據(jù)權(quán)利要求11-14所述的免疫原性組合物,其中還選擇LPS免疫型L3。
16.根據(jù)權(quán)利要求1-15所述的免疫原性組合物,其中選擇FhaB,以及選自PilC、MafA、 MafB、0mp26、NMB 0995、FhaC、FbpA、Bcp、NMB 1124、NMB 1162、NMB 1220、NMB 1313、NMB 1953、HtrA、Hsf、LbpB、FrpA、FrpC、FrpA/C、NadA、0MP85、PldA、LbpA、TbpA({g )、TbpA(高)、 TbpB (低),TbpB (高)、HpuA、HpuB、Hap、IgA 蛋白酶、AspA、PilQ、MltA、HimD、HisD、GNA1870、 OstA、HlpA、NspA、TspA、TspB、P2086、Lipo28、Sibp、NMB 0964、NMB 0293、NMB 0315、NMB 1119、TdfH、PorB、NM-ADPRT、VapD以及LPS免疫型L2和LPS免疫型L3之一或兩者的至少一種其它抗原。
17.根據(jù)權(quán)利要求1-16所述的免疫原性組合物,其中選擇NspA,以及選自PilC、MafA、 MafB、0mp26、NMB0995、FhaC、FbpA、Bcp、NMB 1124、NMB 1162、NMB 1220、NMB 1313、NMB 1953、HtrA、Hsf、LbpB、FrpA、FrpC、FrpA/C、NadA、0MP85、PldA、LbpA、TbpA({g )、TbpA(高)、 TbpB (低),TbpB (高)、HpuA、HpuB、Hap、IgA 蛋白酶、AspA、PilQ、MltA、HimD、HisD、GNA1870、 0stA、HlpA、TspA、TspB、P2086、Lipo28、Sibp、NMB 0964、NMB 0293、NMB 0315、NMB 1119、 TdfH、PorB、NM-ADPRT、VapD以及LPS免疫型L2和LPS免疫型L 3之一或兩者的至少一種其它抗原。
18.根據(jù)權(quán)利要求1-17所述的免疫原性組合物,其中選擇NadA,以及選自PilC、MafA、 MafB、0mp26、NMB 0995、FhaC、FbpA、Bcp、NMB 1124、NMB 1162、NMB 1220、NMB 1313、NMB 1953、HtrA, Hsf、LbpB、FrpA、FrpC、FrpA/C、0MP85、PldA、LbpA, TbpA (低)、TbpA (高)、 TbpB (低)、TbpB (高)、HpuA、HpuB、Hap、IgA 蛋白酶、AspA、PilQ、MltA、HimD、HisD、GNA1870、 0stA、HlpA、TspA、TspB、P2086、Lipo28、Sibp、NMB 0964、NMB 0293、NMB 0315、NMB 1119、 TdfH、PorB、NM-ADPRT、VapD以及LPS免疫型L2和LPS免疫型L3之一或兩者的至少一種其它抗原。
19.根據(jù)權(quán)利要求1-18所述的免疫原性組合物,其中選擇TbpA(低),以及選自PilC、 MafA、MafB、0mp26、NMB 0995、FhaC、FbpA、Bcp、NMB 1124、NMB 1162、NMB 1220、NMB 1313、 NMB 1953、HtrA、Hsf、LbpB、FrpA、FrpC、FrpA/C、0MP85、PldA、LbpA, TbpA (高)、TbpB (低)、 TbpB( M )、HpuA、HpuB, Hap、IgA 蛋白酶、AspA、PilQ、MltA、HimD、HisD、GNA1870、OstA、 HlpA、TspA、TspB、P2086、Lipo28、Sibp、NMB 0964、NMB 0293、NMB 0315、NMB 1119、TdfH、 PorB、NM-ADPRT、VapD以及LPS免疫型L2和LPS免疫型L3之一或兩者的至少一種其它抗原。
20.根據(jù)權(quán)利要求1-19所述的免疫原性組合物,其中選擇TbpA(高),以及選自PilC、 MafA、MafB、0mp26、NMB 0995、FhaC、FbpA、Bcp、NMB 1124、NMB 1162、NMB 1220、NMB 1313、 NMB 1953、HtrA、Hsf、LbpB、FrpA、FrpC、FrpA/C、0MP85、PldA、LbpA、TbpB (低)、TbpB (高)、 HpuA、HpuB、Hap、IgA 蛋白酶、AspA、PilQ、MltA、HimD、HisD、GNA1870、0stA、HlpA、TspA、TspB、 P2086、Lipo28、Sibp、NMB 0964,NMB 0293,NMB 0315,NMB 1119、TdfH、PorB、NM_ADPRT、VapD 以及LPS免疫型L2和LPS免疫型L3之一或兩者的至少一種其它抗原。
21.根據(jù)權(quán)利要求1-20所述的免疫原性組合物,其中選擇LbpB,以及選自PilC、MafA、 MafB、0mp26、NMB 0995、FhaC、FbpA、Bcp、NMB 1124、NMB 1162、NMB 1220、NMB 1313、NMB 1953、HtrA、Hsf、FrpA、FrpC、FrpA/C、0MP85、PldA、LbpA、TbpB({g )、TbpB (高)、HpuA、HpuB、 Hap、IgA 蛋白酶、AspA、PilQ、MltA、HimD、HisD、GNA1870、OstA、HlpA、TspA、TspB、P2086、 Lipo28、Sibp、NMB 0964, NMB 0293, NMB 0315, NMB 1119、TdfH、PorB、NM-ADPRT、VapD 以及 LPS免疫型L2和LPS免疫型L3之一或兩者的至少一種其它抗原。
22.根據(jù)權(quán)利要求1-21所述的免疫原性組合物,其中選擇0MP85,以及選自PilC、MafA、 MafB、0mp26、NMB 0995、FhaC、FbpA、Bcp、NMB 1124、NMB 1162、NMB 1220、NMB 1313、NMB 1953、HtrA、Hsf、FrpA、FrpC、FrpA/C> PldA、LbpA、TbpB (低)、TbpB (高)、HpuA、HpuB> Hap、 IgA 蛋白酶、AspA、PilQ、MltA、HimD、HisD、GNA1870、0stA、HlpA、TspA、TspB、P2086、Lipo28、 Sibp, NMB 0964, NMB 0293, NMB 0315, NMB 1119, TdfH, PorB, NM-ADPRT, VapD 以及 LPS 免疫型L2和LPS免疫型L3之一或兩者的至少一種其它抗原。
23.根據(jù)權(quán)利要求1-22所述的免疫原性組合物,其中選擇Hap,以及選自PilC、MafA、 MafB、0mp26、NMB 0995、FhaC、FbpA、Bcp、NMB 1124、NMB 1162、NMB 1220、NMB 1313、NMB 1953、HtrA> Hsf、FrpA、FrpC、FrpA/C> PldA、LbpA、TbpB (低)、TbpB (高)、HpuA、HpuB> IgA 蛋白酶、AspA、PilQ、MltA、HimD、HisD、GNA1870、OstA、HlpA、TspA、TspB、P2086、Lipo28、 Sibp,NMB 0964,NMB 0293,NMB 0315,NMB 1119、TdfH、PorB、NM_ADPRT、VapD 以及 LPS 免疫型L2和LPS免疫型L3之一或兩者的至少一種其它抗原。
24.根據(jù)權(quán)利要求1-23所述的免疫原性組合物,其中選擇Hsf,以及選自PilC、MafA、 MafB、0mp26、NMB 0995、FhaC、FbpA、Bcp、NMB 1124、NMB 1162、NMB 1220、NMB 1313、NMB 1953、HtrA、FrpA、FrpC、FrpA/C、PldA、LbpA、TbpB (低)、TbpB (高)、HpuA、HpuB> IgA 蛋白酶、AspA、PilQ、MltA、HimD、HisD、GNA1870、OstA、HlpA、TspA、TspB、P2086、Lipo28、Sibp、 NMB 0964, NMB 0293, NMB 0315, NMB 1119、TdfH、PorB、NM-ADPRT、VapD 以及 LPS 免疫型 L2 和LPS免疫型L3之一或兩者的至少一種其它抗原。
25.根據(jù)權(quán)利要求1-24所述的免疫原性組合物,其中選擇FrpA,以及選自PilC、MafA、 MafB、0mp26、NMBO 995、FhaC、FbpA、Bcp、NMB 1124、NMB 1162、NMB 1220、NMB 1313、NMB 1953、HtrA、FrpC、FrpA/C、PldA、LbpA、TbpB (低)、TbpB(高)、HpuA、HpuB、IgA 蛋白酶、AspA、 PilQ、MltA、HimD、HisD、GNA1870、OstA、HlpA、TspA、TspB、P2086、Lipo28、Sibp、NMB 0964、 NMB 0293、NMB 0315、NMB 1119、TdfH、PorB、NM-ADPRT, VapD 以及 LPS 免疫型 L2 和 LPS 免疫型L3之一或兩者的至少一種其它抗原。
26.根據(jù)權(quán)利要求1-25所述的免疫原性組合物,其中選擇FrpC,以及選自PilC、MafA、 MafB、0mp26、NMB 0995、FhaC、FbpA、Bcp、NMB 1124、NMB 1162、NMB 1220、NMB 1313、NMB.1953、HtrA、PldA、LbpA、TbpB (低)、TbpB (高)、HpuA、HpuB, IgA 蛋白酶、AspA、PilQ、MltA、 HimD、HisD、GNA1870、OstA、HlpA、TspA、TspB、P2086、Lipo28、Sibp、NMB 0964、NMB 0293、 NMB 0315、NMB 1119、TdfH、PorB、NM-ADPRT, VapD 以及 LPS 免疫型 L2 和 LPS 免疫型 L3 之一或兩者的至少一種其它抗原。
27.根據(jù)權(quán)利要求1-26所述的免疫原性組合物,其中選擇LPS免疫型L2,以及選自 PilC、MafA、MafB、0mp26、NMB 0995、FhaC、FbpA、Bcp、NMB 1124、NMB 1162、NMB 1220、NMB 1313、NMB 1953、批^、卩1(^、1^ 八、1^^(低)、1^^(高)、肋1^、肋沾、IgA 蛋白酶、AspA、 PilQ、MltA、HimD、HisD、GNA1870、OstA、HlpA、TspA、TspB、P2086、Lipo28、Sibp、NMB 0964、 NMB 0293、NMB 0315、NMB 1119、TdfH、PorB、NM-ADPRT, VapD 以及 LPS 免疫型 L3 的至少一種其它抗原。
28.根據(jù)權(quán)利要求1-27所述的免疫原性組合物,其中選擇LPS免疫型L3,以及選自 PilC、MafA、MafB、0mp26、NMB0995、FhaC、FbpA、Bcp、NMB 1124、NMB 1162、NMB 1220、NMB 1313、NMB 1953、批^、卩1(^、1^ 八、1^^(低)、1^^(高)、肋1^、肋沾、IgA 蛋白酶、AspA、 PilQ、MltA、HimD、HisD、GNA1870、OstA、HlpA、TspA、TspB、P2086、Lipo28、Sibp、NMB 0964、 NMB 0293, NMB 0315, NMB 1119、TdfH、PorB、NM-ADPRT 以及 VapD 的至少一種其它抗原。
29.根據(jù)權(quán)利要求1-28所述的免疫原性組合物,其中選擇PilQ,以及選自PilC、MafA、 MafB、0mp26、NMB 0995、FhaC、FbpA、Bcp、NMB 1124、NMB 1162、NMB 1220、NMB 1313、NMB 1953、HtrA、PldA、LbpA、TbpB (低)、TbpB (高)、HpuA、HpuB> IgA 蛋白酶、AspA、MltA、HimD、 HisD、GNA1870、OstA、HlpA、TspA、TspB、P2086、Lipo28、Sibp、NMB 0964、NMB 0293、NMB 0315、NMB 1119、TdfH、PorB、NM-ADPRT 以及 VapD 的至少一種其它抗原。
30.根據(jù)權(quán)利要求1-29所述的免疫原性組合物,其中選擇HlpA,以及選自PilC、MafA、 MafB、0mp26、NMB 0995、FhaC、FbpA、Bcp、NMB 1124、NMB 1162、NMB 1220、NMB 1313、NMB 1953、HtrA、PldA、LbpA、TbpB (低)、TbpB (高)、HpuA、HpuB> IgA 蛋白酶、AspA、MltA、HimD、 HisD、GNA1870、0stA、TspA、TspB、P2086、Lipo28、Sibp、NMB 0964,NMB 0293,NMB 0315,NMB 1119、TdfH、PorB、NM-ADPRT以及VapD的至少一種其它抗原。
31.根據(jù)權(quán)利要求1-30所述的免疫原性組合物,其中選擇MltA,以及選自PilC、MafA、 MafB、0mp26、NMB 0995、FhaC、FbpA、Bcp、NMB 1124、NMB 1162、NMB 1220、NMB 1313、NMB 1953、HtrA、PldA、LbpA、TbpB (低)、TbpB (高)、HpuA、HpuB> IgA 蛋白酶、AspA、HimD、HisD、 GNA1870、0stA、TspA、TspB、P2086、Lipo28、Sibp、NMB 0964,NMB 0293,NMB 0315,NMB 1119、 TdfH、PorB、NM-ADPRT以及VapD的至少一種其它抗原。
32.根據(jù)權(quán)利要求1-31所述的免疫原性組合物,其中選擇GNA1870,以及選自PilC、 MafA、MafB、0mp26、NMB 0995、FhaC、FbpA、Bcp、NMB 1124、NMB 1162、NMB 1220、NMB 1313、 NMB 1953、批^、?1(^、1^^六、1^^(低)、1^^(高)、肋1^、肋沾、IgA 蛋白酶、AspA、HimD、 HisD、OstA、TspA、TspB、P2086、Lipo28、Sibp、NMB 0964、NMB 0293、NMB 0315、NMB 1119、 TdfH、PorB、NM-ADPRT及VapD的至少一種其它抗原。
33.根據(jù)權(quán)利要求1-32所述的免疫原性組合物,其中選擇NM-ADPRT,以及選自PilC、 MafA、MafB、0mp26、NMB 0995、FhaC、FbpA、Bcp、NMB1124、NMB 1162、NMB 1220、NMB 1313、 NMB 1953、HtrA、PldA、LbpA、TbpB (低)、TbpB (高)、HpuA、HpuB, IgA 蛋白酶、AspA、HimD、 HisD、OstA、TspA、TspB、P2086、Lipo28、Sibp、NMB 0964、NMB 0293、NMB 0315、NMB 1119、TdfH、PorB以及VapD的至少一種其它抗原。
34.根據(jù)權(quán)利要求1-33所述的免疫原性組合物,其中選擇MafA,以及選自PilC、MafB、 0mp26、NMB 0995、FhaC、FbpA、Bcp、NMB 1124、NMB 1162、NMB 1220、NMB 1313、NMB 1953、 HtrA、PldA、LbpA、TbpB (低)、TbpB (高)、HpuA、HpuB> IgA 蛋白酶、AspA、HimD、HisD、OstA、 TspA、TspB、P2086、Lipo28、Sibp、NMB 0964,NMB 0293,NMB 0315,NMB II19、TdfH、PorB 以及VapD的至少一種其它抗原。
35.根據(jù)權(quán)利要求1-34所述的免疫原性組合物,其中選擇MafB,以及選自PilC、MafB、 0mp26、NMB 0995、FhaC、FbpA、Bcp、NMB 1124、NMB 1162、NMB 1220、NMB 1313、NMB 1953、 HtrA> PldA、LbpA、TbpB (低)、TbpB (高)、HpuA、HpuB> IgA 蛋白酶、AspA、HimD、HisD、OstA、 TspA、TspB、P2086、Lipo28、Sibp、NMB 0964,NMB 0293,NMB 0315,NMB 1119、TdfH、PorB 以及VapD的至少一種其它抗原。
36.根據(jù)權(quán)利要求1-35所述的免疫原性組合物,其中選擇NMB0315,以及選自PilC、 MafB、0mp26、NMB 0995、FhaC、FbpA、Bcp、NMB 1124、NMB 1162、NMB 1220、NMB 1313、NMB 1953、HtrA、PldA、LbpA、TbpB (低)、TbpB (高)、HpuA、HpuB> IgA 蛋白酶、AspA、HimD、HisD、 OstA、TspA、TspB、P2086、Lipo28、Sibp、NMB 0964、NMB 0293、NMB 1119、TdfH、PorB 以及 VapD的至少一種其它抗原。
37.根據(jù)權(quán)利要求1-36所述的免疫原性組合物,其中選擇NMB1119,以及選自PilC、 MafB、0mp26、NMB 0995、FhaC、FbpA、Bcp、NMB 1124、NMB 1162、NMB 1220、NMB 1313、NMB 1953、HtrA、PldA、LbpA、TbpB (低)、TbpB (高)、HpuA、HpuB> IgA 蛋白酶、AspA、HimD、HisD、 OstA、TspA、TspB、P2086、Lipo28、Sibp、NMB 0964、NMB 0293、NMB 1119、TdfH、PorB 以及 VapD的至少一種其它抗原。
38.根據(jù)權(quán)利要求1-37所述的免疫原性組合物,其中選擇HisD,以及選自PilC、MafB、 0mp26、NMB 0995、FhaC、FbpA、Bcp、NMB 1124、NMB 1162、NMB 1220、NMB 1313、NMB 1953、 HtrA> PldA、LbpA、TbpB (低)、TbpB (高)、HpuA、HpuB> IgA 蛋白酶、AspA、HimD、OstA、TspA、 TspB、P2086、Lipo28、Sibp、NMB 0964, NMB 0293, NMB 1119、TdfH、PorB 以及 VapD 的至少一種其它抗原。
39.根據(jù)權(quán)利要求1-38所述的免疫原性組合物,其中選擇LbpA,以及選自PilC、MafB、 0mp26、NMB 0995、FhaC、FbpA、Bcp、NMB 1124、NMB 1162、NMB 1220、NMB 1313、NMB 1953、 HtrA> PldA、TbpB (低)、TbpB (高)、HpuA、HpuB> IgA 蛋白酶、AspA、HimD、OstA、TspA、TspB、 P2086、Lipo28、Sibp、NMB 0964、NMB 0293、NMB 1119、TdfH、PorB 以及 VapD 的至少一種其它抗原。
40.根據(jù)權(quán)利要求1-39所述的免疫原性組合物,其中選擇NMB0995,以及選自PilC、 MafB、0mp26、FhaC、FbpA、Bcp、NMB 1124、NMB 1162、NMB 1220、NMB 1313、NMB 1953、HtrA、 PldA、TbpB (低)、TbpB (高)、HpuA、HpuB, IgA 蛋白酶、AspA、HimD、OstA、TspA、TspB、P2086、 Lipo28、Sibp、NMB 0964, NMB 0293, NMB 1119、TdfH、PorB 以及 VapD 的至少一種其它抗原。
41.根據(jù)權(quán)利要求1-40所述的免疫原性組合物,其中選擇Lipo28,以及選自PilC、 MafB、0mp26、FhaC、FbpA、Bcp、NMB 1124、NMB 1162、NMB 1220、NMB 1313、NMB 1953、HtrA、 PldA、TbpB(低)、TbpB(高)、HpuA、HpuB、IgA 蛋白酶、AspA、HimD、0stA、TspA、TspB、P2086、 Sibp, NMB 0964, NMB 0293, NMB 1119、TdfH、PorB 以及 VapD 的至少一種其它抗原。
42.根據(jù)權(quán)利要求1-41所述的免疫原性組合物,其中選擇HimD,以及選自PilC、MafB、 0mp26、FhaC、FbpA、Bcp、NMB 1124、NMB 1162、NMB 1220、NMB 1313、NMB 1953、HtrA、PldA、 TbpB (低)、TbpB (高)、HpuA、HpuB, IgA 蛋白酶、AspA、OstA、TspA、TspB、P2086、Sibp、NMB 0964, NMB 0293, NMB 1119、TdfH、PorB 以及 VapD 的至少一種其它抗原。
43.根據(jù)權(quán)利要求1-42所述的免疫原性組合物,其中選擇NMB1313,以及選自PilC、 MafB、0mp26、FhaC、FbpA、Bcp、NMB 1124、NMB 1162、NMB 1220、NMB 1953、HtrA、PldA、 TbpB (低)、TbpB (高)、HpuA、HpuB, IgA 蛋白酶、AspA、OstA、TspA、TspB、P2086、Sibp、NMB 0964, NMB 0293, NMB 1119、TdfH、PorB 以及 VapD 的至少一種其它抗原。
44.根據(jù)權(quán)利要求1-43所述的免疫原性組合物,其中選擇NMB1953,以及選自PilC、 MafB、0mp26、FhaC、FbpA、Bcp、NMB 1124、NMB 1162、NMB 1220、HtrA、PldA、TbpB (低)、 TbpB( M )、HpuA、HpuB, IgA 蛋白酶、AspA、OstA、TspA、TspB、P2086、Sibp、NMB0964、NMB 0293、NMB 1119、TdfH、PorB以及VapD的至少一種其它抗原。
45.根據(jù)權(quán)利要求5-44所述的免疫原性組合物,其中衍生外膜小泡制品的宿主細(xì)胞已被工程改造以下調(diào)一種或多種IgtB或lgtE,優(yōu)選前者的表達(dá)。
46.根據(jù)權(quán)利要求5-45所述的免疫原性組合物,其中衍生外膜小泡制品的宿主細(xì)胞不能合成莢膜多糖且優(yōu)選已被工程改造以下調(diào)一種或多種siaD、ctrA、ctrB、ctrC、ctrD、 synA(相當(dāng)于synX和siaA)或synB(相當(dāng)于siaB)和synC(相當(dāng)于siaC),優(yōu)選siaD的表達(dá)。
47.根據(jù)權(quán)利要求5-46所述的免疫原性組合物,其中衍生外膜小泡制品的宿主細(xì)胞已被工程改造以下調(diào)一種或多種OpC、OpA或PorA,優(yōu)選PorA的表達(dá)。
48.根據(jù)權(quán)利要求5-47所述的免疫原性組合物,其中衍生外膜小泡制品的宿主細(xì)胞已被工程改造以下調(diào)FrpB的表達(dá)。
49.根據(jù)權(quán)利要求5-48所述的免疫原性組合物,其中衍生外膜小泡制品的宿主細(xì)胞已被工程改造以下調(diào)msbB和/或htrB,優(yōu)選msbB的表達(dá)。
50.根據(jù)權(quán)利要求5-49所述的免疫原性組合物,其中所述外膜小泡制品包括與外膜蛋白(OMP)綴合的LPS。
51.根據(jù)權(quán)利要求50所述的免疫原性組合物,其中LPS與OMP在外膜小泡制品中原位 (優(yōu)選泡內(nèi))綴合。
52.根據(jù)權(quán)利要求1-51所述的免疫原性組合物,它包括從腦膜炎奈瑟氏球菌 (Neisseria meningitidis)衍生的抗原,優(yōu)選血清組B。
53.根據(jù)權(quán)利要求1-52所述的免疫原性組合物,它包括從淋病奈瑟氏球菌衍生的抗原。
54.根據(jù)權(quán)利要求1-52所述的免疫原性組合物,其中所有奈瑟氏球菌抗原均來源于腦膜炎奈瑟氏球菌,優(yōu)選血清組B。
55.根據(jù)權(quán)利要求1-54所述的免疫原性組合物,它還包括一種或多種細(xì)菌莢膜多糖或低聚糖。
56.根據(jù)權(quán)利要求55所述的免疫原性組合物,其中所述莢膜多糖或低聚糖來源于選自腦膜炎奈瑟氏球菌血清組A、C、Y和W-135,流感嗜血桿菌b (Haemophilus influenzaeb),肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae), A組鏈球菌,B組鏈球菌,金黃色葡萄球菌(Staphylococcas aureus)和表皮葡萄球菌(Stapylocoaus epidermidis)的細(xì)菌。
57.根據(jù)權(quán)利要求55-56所述的免疫原性組合物,其中所述莢膜多糖或低聚糖與蛋白£雙口 ο
58.根據(jù)權(quán)利要求1-57所述的免疫原性組合物,它包括佐劑。
59.根據(jù)權(quán)利要求58所述的免疫原性組合物,它包括鋁鹽,優(yōu)選磷酸鋁。
60.根據(jù)權(quán)利要求58或59所述的免疫原性組合物,它包括3D-MPL。
61.一種包括權(quán)利要求1-60的免疫原性組合物以及藥學(xué)上可接受載體的疫苗。
62.—種包括一個或多個多核苷酸的疫苗,所述多核苷酸編碼兩種或多種不同的蛋白, 它的表達(dá)由真核啟動子驅(qū)動,其中所述蛋白選自下列種類中的至少兩個a)選自FhaB、NspA、PilC、Hsf、Hap、MafA、MafB、0mp26、NMB 0315,NMB 0995,NMB 1119 和NadA的至少一種奈瑟氏球菌粘附素;b)選自Hsf、Hap、IgA蛋白酶、AspA和NadA的至少一種奈瑟氏球菌自體轉(zhuǎn)運蛋白;c)選自FrpA、FrpC、FrpA/C、VapD和NM-ADPRT的至少一種奈瑟氏球菌毒素;d)選自TbpA 高、TbpA 低、TbpB 高、TbpB 低、LbpA> LbpB> P2086、HpuA> HpuB> Lipo28、 Sibp、FbpA、BfrA、BfrB、Bcp、NMB0964和NMB0293的至少一種奈瑟氏球菌Fe獲得蛋白;或e)選自PilQ、0MP85、FhaC、NspA、TbpA (高)、TbpA (低)、LbpA、HpuB、TspA、TspB、TdfH、 PorB、HimD、HisD、GNA1870、OstA、HlpA、MltA、NMB 1124、NMB 1162、NMB 1220、NMB 1313、 NMB 1953、HtrA和PldA的至少一種奈瑟氏球菌膜相關(guān)蛋白,優(yōu)選整合外膜蛋白。
63.一種用于治療或預(yù)防奈瑟氏球菌病的方法,包括在宿主需要時給予其保護劑量的權(quán)利要求61-62的疫苗。
64.根據(jù)權(quán)利要求63所述的方法,其中腦膜炎奈瑟氏球菌感染被預(yù)防或治療。
65.根據(jù)權(quán)利要求63所述的方法,其中淋病奈瑟氏球菌感染被預(yù)防或治療。
66.權(quán)利要求61-62的疫苗制備用于治療或預(yù)防奈瑟氏球菌感染的藥物的用途。
67.根據(jù)權(quán)利要求66所述的用途,其中腦膜炎奈瑟氏球菌感染被預(yù)防或治療。
68.根據(jù)權(quán)利要求66所述的用途,其中淋病奈瑟氏球菌感染被預(yù)防或治療。
69.一種衍生權(quán)利要求5-60的外膜小泡制品的基因工程改造的奈瑟氏球菌菌株。
70.一種制備權(quán)利要求1-60的免疫原性組合物的方法,包括將至少兩種來源于奈瑟氏球菌的抗原混合在一起的步驟。
71.—種制備權(quán)利要求5-60的免疫原性組合物的方法,包括分離奈瑟氏球菌培養(yǎng)物中的外膜小泡的步驟。
72.根據(jù)權(quán)利要求71所述的方法,還包括將至少兩種外膜小泡制品混合的步驟。
73.根據(jù)權(quán)利要求72所述的方法,其中至少一種外膜小泡制品包括免疫型L2的LPS, 以及至少一種外膜小泡制品包括免疫型L3的LPS。
74.根據(jù)權(quán)利要求71-73所述的方法,其中所述外膜小泡是通過用0-0.5%濃度的DOC 提取而分離的。
75.根據(jù)權(quán)利要求74所述的方法,其中所述外膜小泡是通過用0.02%-0.4%、O.04% -O. 3%,O. 06% -O. 2%,O. 08% -O. 15%或優(yōu)選大約或準(zhǔn)確的O.1 %濃度的DOC提取而分離的。
76.—種制備權(quán)利要求61的疫苗的方法,包括將權(quán)利要求1-60的免疫原性組合物與藥學(xué)上可接受的載體混合的步驟。
77.一種制備用于預(yù)防或治療奈瑟氏球菌感染的免疫球蛋白的方法,包括用權(quán)利要求 61的疫苗使受體免疫,以及從受體中分離免疫球蛋白的步驟。
78.—種通過權(quán)利要求77的方法制備的免疫球蛋白。
79.—種藥物組合物,其包括權(quán)利要求78的免疫球蛋白和藥學(xué)上可接受載體。
80.一種用于治療或預(yù)防奈瑟氏球菌感染的方法,包括給予患者有效量的權(quán)利要求79 的藥物制品的步驟。
81.權(quán)利要求79的藥物制品在制備用于治療或預(yù)防奈瑟氏球菌病的藥物的用途。
82.根據(jù)權(quán)利要求5-60所述的免疫原性組合物,它包括免疫型L2的腦膜炎球菌泡和免疫型L3的腦膜炎球菌泡。
83.根據(jù)權(quán)利要求82所述的免疫原性組合物,其中TbpA(高)在其中一個泡中被上調(diào)。
84.根據(jù)權(quán)利要求82或83所述的免疫原性組合物,其中TbpA(低)在其中一個泡中被上調(diào)。
85.根據(jù)權(quán)利要求82-84所述的免疫原性組合物,其中Hsf在其中一個泡中被上調(diào)。
86.根據(jù)權(quán)利要求82-85所述的免疫原性組合物,其中0MP85在其中一個泡中被上調(diào)。
87.根據(jù)權(quán)利要求82-86所述的免疫原性組合物,其中所述泡是從不能產(chǎn)生莢膜多糖, 優(yōu)選siaD—的腦膜炎球菌菌株中分離的。
88.根據(jù)權(quán)利要求82-87所述的免疫原性組合物,其中L2和/或L3LPS低聚糖結(jié)構(gòu)被截短成與已經(jīng)從lgtB_腦膜炎球菌菌株中分離出來的泡一致。
89.根據(jù)權(quán)利要求82-88所述的免疫原性組合物,其中所述泡是從下調(diào)msbB表達(dá)的腦膜炎球菌菌株中分離出來的。
90.根據(jù)權(quán)利要求82-89所述的免疫原性組合物,其中L2和/或L3LPS低聚糖部分與泡整合外膜蛋白泡內(nèi)綴合。
91.根據(jù)權(quán)利要求82-89所述的免疫原性組合物,其中所述泡來源于下調(diào)一種或多種 FrpB, PorA, Opa或Opc表達(dá)的腦膜炎球菌菌株。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于治療和預(yù)防奈瑟氏球菌病的免疫原性組合物和疫苗。本發(fā)明的免疫原性組合物含有選自包括粘附素、自體轉(zhuǎn)運蛋白、毒素、鐵獲得蛋白和膜相關(guān)蛋白(優(yōu)選整合外膜蛋白)在內(nèi)的至少兩個不同種類抗原的抗原組合。這種抗原組合能以抗奈瑟氏球菌生活周期不同方面的免疫反應(yīng)為目標(biāo),產(chǎn)生更有效的免疫反應(yīng)。
文檔編號A61K39/102GK103007263SQ20121028054
公開日2013年4月3日 申請日期2003年7月31日 優(yōu)先權(quán)日2002年8月2日
發(fā)明者F.-X.J.貝爾泰, R.比曼斯, P.德諾埃, C.費龍, C.戈拉, J.普爾曼, V.魏南茨 申請人:葛蘭素史密絲克萊恩生物有限公司
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