專利名稱：使用樹突細(xì)胞和由高靜水壓力殺死的腫瘤細(xì)胞對(duì)癌癥進(jìn)行主動(dòng)細(xì)胞免疫治療的手段和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于誘導(dǎo)針對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫應(yīng)答的藥物組合物以及制備此類組合物的方法，所述藥物組合物包含樹突細(xì)胞和用高靜水壓力處理造成凋亡的腫瘤細(xì)胞。
背景技術(shù)：
在醫(yī)學(xué)和人類健康中，由不同腫瘤導(dǎo)致的疾病仍然是一個(gè)主要的問(wèn)題。外科手術(shù)、化學(xué)療法和放射療法的聯(lián)合極大地改進(jìn)了癌癥患者的預(yù)后。盡管這些方法都能導(dǎo)致腫瘤大小的顯著減少，但是，常常會(huì)有一小群前體腫瘤細(xì)胞或癌癥干細(xì)胞存活下來(lái)，進(jìn)而會(huì)產(chǎn)生一群新的導(dǎo)致惡化的腫瘤細(xì)胞。甚至當(dāng)主要的腫瘤通過(guò)外科手術(shù)和/或其他治療方法移除之后，數(shù)量稀少的循環(huán)腫瘤細(xì)胞還是可以導(dǎo)致身體其他部分發(fā)生轉(zhuǎn)移性腫瘤。因此，一直存在著對(duì)于不同的藥物和治療方法的需求，這些治療方法既可以單獨(dú)使用，更優(yōu)選與其他腫瘤治療方法聯(lián)合使用?，F(xiàn)有技術(shù)WO 2006/095330描述了通過(guò)熱方法、機(jī)械性和/或化學(xué)性損傷含抗原細(xì)胞并誘導(dǎo)與抗原呈遞細(xì)胞共聚的所述細(xì)胞到患者體內(nèi)來(lái)抑制細(xì)胞群體增長(zhǎng)的方法。Frank et al. “Harnessing NaturelIy Occuring Tumor Immunity ；A Clinical Vaccine Trial in Prostate Cancer，，，PLOS ONE, vol. 5, no. 9, I January2010(2010-01-01), page E12367，描述了包含自體樹突細(xì)胞和凋亡的UV-輻射LNcap細(xì)胞的腫瘤疫苗。
Minarik et al. “Phase I/I I of Clinical Study of Prostate CancerImmunotherapy Using Dendritic Cell Vaccination Strategy-First Results”，European Urology Supplements, vol. 9, no. 6,1 September 2010, page629,披露了使用被UVA輻射殺死的凋亡LNCap細(xì)胞脈沖刺激的樹突細(xì)胞免疫治療前列腺癌的I/II期臨床研究的初步結(jié)果。Weiss et al.“Ex vivo-and in vivo-induced dead tumor cells as modulatorsof antitumor responses”，Annals of the New York Academy of Sciences, vol. 1209,no. I, I October 2010 (2010-10-01), pages 109-117，披露了高靜水壓力處理腫瘤細(xì)胞。這些死亡的腫瘤細(xì)胞作為癌癥疫苗直接用于動(dòng)物模型。Weiss et al. iiHigh hydrostatic pressure treatment generates inactivatedmammalian tumor cells with immunogeneic features，，， Journal of Immunotoxicology,vol. 7, no. 3, ISeptember 2010, pages 194-204,披露了高靜水壓力處理會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，其中腫瘤細(xì)胞是失活并且具有免疫原性的。在小鼠模型中生產(chǎn)和確認(rèn)了直接針對(duì)腫瘤細(xì)胞的抗體。US 2008/0286314披露了能夠用于治療癌癥患者的包含抗原呈遞細(xì)胞的癌癥疫苗，所述抗原呈遞細(xì)胞裝載有非凋亡的熱激癌細(xì)胞。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及一種用于誘導(dǎo)抗-腫瘤免疫應(yīng)答的藥物組合物，特別是一種引起機(jī)體針對(duì)腫瘤細(xì)胞發(fā)生免疫反應(yīng)的腫瘤疫苗。 由諸如放射性的標(biāo)準(zhǔn)模式所殺死的腫瘤細(xì)胞正常來(lái)說(shuō)是不具有免疫原性的。如果要用于生產(chǎn)癌癥免疫療法的產(chǎn)品，經(jīng)過(guò)放射的腫瘤細(xì)胞需要與有效的佐劑共同施用。當(dāng)用于脈沖刺激諸如樹突細(xì)胞(DCs或DC)的抗原呈遞細(xì)胞時(shí),放射性殺死的腫瘤細(xì)胞并不會(huì)提供激活信號(hào)。因此，樹突細(xì)胞需要用其他的物質(zhì)，例如病原體衍生分子來(lái)進(jìn)行激活。本發(fā)明披露了一種新的誘導(dǎo)人腫瘤細(xì)胞、尤其是卵巢和前列腺癌細(xì)胞和人源急性淋巴細(xì)胞性白血病細(xì)胞的免疫原性死亡的方法。由高靜水壓力(下面也稱為HHP)殺死的腫瘤細(xì)胞可以向樹突細(xì)胞、尤其是向未成熟的樹突細(xì)胞提供有效的活化刺激原，甚至在沒(méi)有額外的刺激原存在的情況下也如此。由該方法所殺死的腫瘤細(xì)胞表達(dá)高水平的免疫原性細(xì)胞死亡標(biāo)記，而裝載有這些免疫原性腫瘤細(xì)胞的樹突細(xì)胞誘導(dǎo)了大量的腫瘤特異性T淋巴細(xì)胞而沒(méi)有擴(kuò)大不期望的調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞的數(shù)量。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，使用高靜水壓力殺死的腫瘤細(xì)胞與樹突細(xì)胞的聯(lián)合使用導(dǎo)致吞噬作用以及腫瘤抗原的有效呈遞，從而誘導(dǎo)強(qiáng)烈的抗腫瘤免疫應(yīng)答。腫瘤細(xì)胞不具有或只是具有很小的免疫原性，如果在沒(méi)有強(qiáng)力佐劑的情況下使用，它們通常并不具有誘導(dǎo)腫瘤特異性免疫應(yīng)答的能力。近期的研究表明，由一些諸如硼替佐米(bortezomib)、奧沙利鉬和蒽環(huán)類抗生素(anthracyclines)的化療方法殺死的腫瘤細(xì)胞可以誘導(dǎo)腫瘤特異性免疫應(yīng)答。該免疫原性細(xì)胞死亡以所述的所有化療都具備的分子事件為特征。在免疫原性細(xì)胞死亡開始之后的幾個(gè)小時(shí)內(nèi)，凋亡前的腫瘤細(xì)胞將使鈣網(wǎng)絡(luò)蛋白和熱激蛋白與其他作為“吃我”信號(hào)的分子(磷脂酰絲氨酸)一起，從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上移動(dòng)到細(xì)胞表面。同時(shí)，經(jīng)歷免疫原性腫瘤細(xì)胞死亡的腫瘤細(xì)胞會(huì)下調(diào)‘別吃我’信號(hào)(例如表面CD47)的表達(dá)，以便樹突細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別和吞食。此外，在質(zhì)膜的通透化之后，細(xì)胞會(huì)向胞外環(huán)境釋放細(xì)胞凋亡后期的標(biāo)記高遷移率族蛋白I (HMGBl)。HMGBl能夠結(jié)合許多模式識(shí)別受體(PRRs)，例如Toll樣受體2(TLR2)，TLR4以及高級(jí)糖基化終產(chǎn)物(RAGE)的受體。該蛋白的釋放似乎是優(yōu)化呈遞來(lái)自樹突細(xì)胞引導(dǎo)的死亡腫瘤細(xì)胞、T細(xì)胞的抗原以及后續(xù)的T細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤清除所必需的。以讓腫瘤細(xì)胞具有免疫原性的方式殺死的腫瘤細(xì)胞的用途對(duì)于癌癥免疫治療方案的設(shè)計(jì)非常重要。施用免疫原性的腫瘤細(xì)胞能夠誘導(dǎo)腫瘤特異性的免疫應(yīng)答，這種應(yīng)答能夠控制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。這將會(huì)減慢甚至停止疾病的進(jìn)展并且改善癌癥患者的預(yù)后。同樣也認(rèn)為，在體內(nèi)循環(huán)的腫瘤細(xì)胞的分布以及轉(zhuǎn)移癌的形成至少也會(huì)被大量地減少。


本發(fā)明和實(shí)驗(yàn)獲得的結(jié)果如圖所描述圖I該示意圖顯示了本發(fā)明的藥物組合物是如何獲得的。獲自患者或細(xì)胞系的腫瘤細(xì)胞用高壓處理，從而使細(xì)胞凋亡。
通過(guò)白血球分離術(shù)(Ieukapheresis)分離樹突細(xì)胞。將未成熟的樹突細(xì)胞和凋亡的腫瘤細(xì)胞合并，從而產(chǎn)生可用作疫苗的成熟的樹突細(xì)胞。圖2高靜水壓力在人腫瘤細(xì)胞中誘導(dǎo)熱激蛋白的表達(dá)。顯示了總共5個(gè)實(shí)驗(yàn)的總結(jié)。乍值是與經(jīng)輻射的腫瘤細(xì)胞的對(duì)比，P < O. 05。還顯示了在兩個(gè)腫瘤細(xì)胞系(0V90和LNcap)中由不同的處理所引起的標(biāo)記分子HSP70、HSP90和鈣網(wǎng)織蛋白的時(shí)間依賴性表達(dá)。圖3高靜水壓力誘導(dǎo)HMGBl (高遷移族蛋白BI)從經(jīng)處理的腫瘤細(xì)胞(0V90和LNcap)中釋放。HMGBl是一種炎癥的細(xì)胞因子調(diào)節(jié)子。顯示了總共5個(gè)實(shí)驗(yàn)的總結(jié)。乍值是與經(jīng)輻射的腫瘤細(xì)胞的對(duì)比，P < O. 05。圖3顯示了考慮到HMGBl的時(shí)間依賴性釋放，HHP處理比其他傳統(tǒng)處理更為有效。 圖4未成熟DCs對(duì)高靜水壓力處理的腫瘤細(xì)胞吞噬作用的動(dòng)力學(xué)。顯示了 5個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)和代表性數(shù)據(jù)的總結(jié)。在實(shí)驗(yàn)中，使用0V90或LNcap腫瘤細(xì)胞。HHP處理與UV處理在(TC和37 °C下進(jìn)行對(duì)比。圖5顯示了基于標(biāo)記⑶86和HLA-DR的樹突細(xì)胞在與高靜水壓力殺死的腫瘤細(xì)胞(0V90和LNcap)相互作用之后的表型。第5天的未成熟的DCs與經(jīng)HHP或輻射殺死的腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)。24小時(shí)之后，用流式細(xì)胞術(shù)分析成熟相關(guān)分子在DCs上的表達(dá)。使用LPS作為對(duì)照。顯示了平均熒光強(qiáng)度(MFI)。乍值是與經(jīng)輻射的腫瘤細(xì)胞的對(duì)比，P <0.05。圖6比較了裝載有被高靜水壓力殺死的腫瘤細(xì)胞(0V90和LNcap)的樹突細(xì)胞與裝載有UV輻射殺死的腫瘤細(xì)胞的樹突細(xì)胞對(duì)腫瘤特異性T細(xì)胞的誘導(dǎo)。數(shù)據(jù)顯示了 5個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的總結(jié)。 值是與經(jīng)輻射的腫瘤細(xì)胞的對(duì)比，P < O. 05。圖7圖7表明了用高靜水壓力(HHP)處理腫瘤細(xì)胞相比起用UV輻射(UV irr)殺死的腫瘤細(xì)胞的優(yōu)勢(shì)所在。檢測(cè)是在前列腺癌細(xì)胞系(LNCap)和卵巢腫瘤細(xì)胞系(0V90)中進(jìn)行的。對(duì)照是在單獨(dú)的樹突細(xì)胞以及被Poly I :C刺激的細(xì)胞中進(jìn)行的。總結(jié)在圖7的結(jié)果顯示了裝載有被高靜水壓力殺死的腫瘤細(xì)胞(分別是0V90和LNcap)的樹突細(xì)胞對(duì)前列腺特異性抗原(PSA)-特異性T細(xì)胞的誘導(dǎo)。在單獨(dú)的高靜水壓力殺死的腫瘤細(xì)胞和裝載有被UV輻射殺死的腫瘤細(xì)胞的樹突細(xì)胞之間進(jìn)行了對(duì)比。圖7所展示的數(shù)據(jù)中顯示了 5個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的總結(jié)。乍值是與經(jīng)輻射的腫瘤細(xì)胞的對(duì)比，P < O. 05。圖7總結(jié)了由示例7獲得的結(jié)果。圖8由高靜水壓力殺死的腫瘤細(xì)胞對(duì)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的誘導(dǎo)與經(jīng)UV輻射的腫瘤細(xì)胞對(duì)Tregs的誘導(dǎo)進(jìn)行對(duì)比。數(shù)據(jù)顯示了 5個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的總結(jié)。圖8中總結(jié)的實(shí)驗(yàn)顯示了本發(fā)明的教導(dǎo)可以應(yīng)用于不同種類的腫瘤。圖8的上部分顯示了在卵巢癌細(xì)胞(0V90)中的實(shí)驗(yàn)。下部分顯示了在前列腺癌細(xì)胞(LNCap)中的實(shí)驗(yàn)。在實(shí)驗(yàn)中，確定了 Fox P3 (Forkhead Box B3)的濃度以便能夠進(jìn)一步分化調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs)。這些實(shí)驗(yàn)顯示了根據(jù)本發(fā)明用HHP處理的腫瘤細(xì)胞的確比UV輻射的腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)了更少量的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。圖9顯示了體內(nèi)研究的結(jié)果 ，其中用本文所披露的腫瘤疫苗治療患者。所有的患者經(jīng)歷過(guò)根治(radical)的前列腺切除或放射療法。作為相關(guān)參數(shù)，確定了 PSA加倍時(shí)間。根據(jù) Antonarakis et al.，BJU Int. 2011，108 (3)，p. 378-385，PSA 加倍時(shí)間是患有前列腺特異抗原(PSA)-復(fù)發(fā)性前列腺腫瘤患者的無(wú)轉(zhuǎn)移存活時(shí)間和總體存活時(shí)間的最強(qiáng)的決定因素。PSA加倍時(shí)間是指PSA值加倍時(shí)的時(shí)間差異。PSA加倍時(shí)間越高，治療患者的存活預(yù)期也就越好。通過(guò)施用本發(fā)明的腫瘤疫苗，PSA加倍時(shí)間被顯著地延長(zhǎng)。*P值是與經(jīng)輻射的腫瘤細(xì)胞的對(duì)比，P < O. 05。圖10圖10是本發(fā)明方法治療的處于前列腺晚期的患者的Kaplan-Meier存活曲線。在Kaplan-Meier存活曲線中，每個(gè)患者的死亡導(dǎo)致存活百分?jǐn)?shù)從100%到低值的降低。Halabi列線圖是存活者的正常的預(yù)期減少，其中中4位存-活時(shí)間是12個(gè)月。本文所描述的使用癌癥疫苗的主動(dòng)癌癥免疫療法導(dǎo)致中位存活時(shí)間延長(zhǎng)至23個(gè)月。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明披露了一種新的能夠比最近描述的化療方法在更大程度上誘導(dǎo)人腫瘤、特別是卵巢癌細(xì)胞和前列腺癌細(xì)胞和急性淋巴細(xì)胞性白血病細(xì)胞的免疫原性細(xì)胞死亡的方法和組合物。通過(guò)這種方法殺死的并被樹突細(xì)胞捕獲的腫瘤細(xì)胞表達(dá)高水平的免疫原性細(xì)胞死亡標(biāo)記，在不誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的情況下能誘導(dǎo)大量地腫瘤特異性T淋巴細(xì)胞，而所述調(diào)節(jié)性T細(xì)胞會(huì)抑制抗腫瘤免疫應(yīng)答。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)通過(guò)本發(fā)明處理的腫瘤細(xì)胞聯(lián)合樹突細(xì)胞所獲得的抗腫瘤免疫應(yīng)答的程度是單獨(dú)使用免疫原性腫瘤細(xì)胞所誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答的約10倍。圖I顯示了基于施用裝載被殺死腫瘤細(xì)胞的成熟樹突細(xì)胞的優(yōu)選癌癥免疫治療方法的大致流程。生產(chǎn)出最終藥物組合物的所有步驟是在GMP設(shè)備中在良好作業(yè)規(guī)范條件下進(jìn)行的。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，生產(chǎn)針對(duì)每個(gè)患者的藥物組合物過(guò)程中的第一個(gè)步驟是白細(xì)胞分離術(shù)，其目的是從外周血中收集大量單核細(xì)胞。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，白細(xì)胞分離術(shù)的產(chǎn)物溶解于合適的緩沖液如PBS+lmM EDTA(Lonza, Vierviers, Belgium)中，使用 Premium Ficoll Paque (GE Healthcare, Little Chalfont, UK)梯度離心來(lái)分離單核細(xì)胞。然后對(duì)收集的單核細(xì)胞(PBMC)進(jìn)行洗滌[例如，在PBS+lmMEDTA (Lonza)中]，并在Cell Gro培養(yǎng)基中重懸，以每cm2表面積I X IO6個(gè)細(xì)胞鋪板于三個(gè)培養(yǎng)瓶中(例如，NUNC，Roskilde, Denmark)。兩個(gè)小時(shí)后,未附著的細(xì)胞用PBS(Lonza)洗去。附著的單核細(xì)胞在含有 20ng/ml IL-4 (Gentaur)和 500U/mlGM_CSF (Gentaur)的 Cell Gro 培養(yǎng)基中培養(yǎng)6 天，在第三天加入新鮮的細(xì)胞因子。于第6天收集未成熟的DCs，用被殺死的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行裝載(例如，前列腺癌細(xì)胞系，卵巢癌細(xì)胞系，急性淋巴細(xì)胞性白血病細(xì)胞系)。將新鮮解凍的未成熟DCs (3-6天)與腫瘤細(xì)胞以5 I的固定DC :腫瘤細(xì)胞比例培養(yǎng)4個(gè)小時(shí)。樹突細(xì)胞和處理的腫瘤細(xì)胞的比例優(yōu)選在I : I至10 I之間的范圍內(nèi)，更優(yōu)選在約4 I和6 I之間。根據(jù)本發(fā)明，處于不同分化、成熟和/或激活階段的樹突細(xì)胞均能被使用。樹突細(xì)胞的成熟階段會(huì)受到成熟因子的影響。腫瘤細(xì)胞脈沖的DCs隨后優(yōu)選通過(guò)25 μ g/ml的Poly I C在過(guò)夜孵育時(shí)被成熟化，并被冷藏保存和儲(chǔ)藏在液氮中。施用前，用腫瘤細(xì)胞脈沖的I X IO7個(gè)成熟DCs重懸于O. 9% NaCl (Baxter)中，在12小時(shí)內(nèi)，優(yōu)選30分鐘至12小時(shí)內(nèi)皮下注射進(jìn)腹股溝和臂區(qū)域。這種形式的癌癥免疫治療的施用優(yōu)選規(guī)律的2-6周間隔重復(fù)，以便持續(xù)地促進(jìn)免疫應(yīng)答。認(rèn)為這里所披露的方法能夠阻止腫瘤誘導(dǎo)的免疫耐受的重新建立。這種形式的免疫治療的治療效果已經(jīng)在患者中所證實(shí)，這些患者處于不同臨床階段，前列腺癌癥的生化復(fù)發(fā)階段，去雄抗性轉(zhuǎn)移性前列腺癌癥階段，推測(cè)還有轉(zhuǎn)移性激素敏感階段的前列腺癌。盡管如此，上述優(yōu)選實(shí)施方案并不是限制性的。本發(fā)明是在最大范圍內(nèi)，根據(jù)腫瘤 治療的特定需求以不同的方法來(lái)實(shí)施。上述確定的優(yōu)選實(shí)施方式描述了本發(fā)明，其中腫瘤細(xì)胞既可以從待治療的患者中獲得，也可以從腫瘤細(xì)胞系或腫瘤細(xì)胞系庫(kù)中獲得。樹突細(xì)胞同樣優(yōu)選從待治療的患者中獲得。盡管如此，在一個(gè)更一般性的方式中，本發(fā)明涉及誘導(dǎo)針對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫應(yīng)答的藥物組合物，其包括a)凋亡的腫瘤細(xì)胞，其中細(xì)胞凋亡是由靜水壓力處理所引起的，以及b)樹突細(xì)胞。這是本發(fā)明一個(gè)重要的方面，即在藥物組合物中使用的腫瘤細(xì)胞是凋亡細(xì)胞而不是壞死細(xì)胞。本領(lǐng)域技術(shù)人員明了凋亡(apoptosis)和壞死(necrosis)之間的差別。細(xì)胞死亡以及后續(xù)的死后變化，即壞死，是正常發(fā)育和成熟循環(huán)中必需的組成部分。雖然這個(gè)過(guò)程很重要，但關(guān)于細(xì)胞死亡的機(jī)制現(xiàn)在仍不清楚，盡管已經(jīng)有很多公開文獻(xiàn)涉及到細(xì)胞死亡時(shí)所發(fā)生的機(jī)制。本發(fā)明的(細(xì)胞)凋亡理解為程序性的、調(diào)控形式的細(xì)胞死亡，而細(xì)胞壞死則是無(wú)序的，是細(xì)胞死亡的偶然形式。在本發(fā)明中，凋亡可以理解為細(xì)胞死亡的這樣一種形式它發(fā)生于正常的生理?xiàng)l件下，并且細(xì)胞是其自身死亡的主動(dòng)參與者。發(fā)生凋亡的細(xì)胞會(huì)表現(xiàn)出特征性形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)特征。這些特征包括染色質(zhì)聚集，核和胞質(zhì)濃縮，胞質(zhì)和核的間隔化進(jìn)入膜結(jié)合的囊泡中(凋亡小體)，所述囊泡含有核糖體，形態(tài)完整的線粒體和核物質(zhì)。因?yàn)檫@些凋亡小體在體內(nèi)是能夠被正常識(shí)別并且能夠被巨噬細(xì)胞或附近的上皮細(xì)胞所吞噬，因此本方法所使用的腫瘤細(xì)胞盡可能地類似凋亡的腫瘤細(xì)胞是非常重要的。(細(xì)胞)凋亡通常只限于單個(gè)細(xì)胞中，而不會(huì)引起炎癥反應(yīng)。另一方面，(細(xì)胞)壞死發(fā)生于細(xì)胞暴露在極端的生理?xiàng)l件下，這些生理?xiàng)l件可能導(dǎo)致質(zhì)膜的損壞。當(dāng)細(xì)胞維持止血(hemostasis)的能力受到破壞時(shí),壞死就開始了，這將導(dǎo)致水和胞外離子的流入。細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞器，尤其是線粒體和整個(gè)細(xì)胞膨脹，破裂。由于質(zhì)膜最終被破壞，胞質(zhì)內(nèi)容物，包括溶酶，將會(huì)釋放到胞外液體中。因此，體內(nèi)壞死細(xì)胞的死亡通常會(huì)伴有大量的組織損傷，進(jìn)而引起嚴(yán)重的炎癥響應(yīng)。用于藥物組合物中的腫瘤細(xì)胞是凋亡的而不是壞死的，這非常重要。依據(jù)本發(fā)明，通過(guò)高靜水壓力處理來(lái)生產(chǎn)凋亡細(xì)胞。本發(fā)明所理解的高靜水壓力被定義為等于或大于 IOOMPa[IMPa = 10 bar = 9. 86923atm = 145. 0377psi]的壓力。高靜水壓力可以通過(guò)儀器來(lái)產(chǎn)生，例如Weiss et al. , journal of Immunotoxicology, 2010,PP 194-209中，尤其是在圖I中描述的儀器。高靜水壓力處理腫瘤細(xì)胞優(yōu)選在壓力容器中進(jìn)行。腫瘤細(xì)胞置于合適的低溫瓶中，所述瓶子裝滿細(xì)胞懸液，緊密封閉以避免空氣泡出現(xiàn)。之后，用韌性薄膜(例如，parafilm )密封瓶子，將準(zhǔn)備好的瓶子放入充滿壓力傳送介質(zhì)的壓力腔中。之后，使用合適的儀器產(chǎn)生高壓，讓細(xì)胞在該高壓下維持足夠的時(shí)間。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，高靜水壓力以至少200MPa下維持至少10分鐘。在一個(gè)更加優(yōu)選的實(shí)施方式中，腫瘤細(xì)胞在200-300MPa，優(yōu)選200_250MPa范圍的壓力下維持10分鐘至12小時(shí)，優(yōu)選10分鐘至I小時(shí)，特別優(yōu)選10至30分鐘。藥物組合物中所使用]的腫瘤細(xì)胞可以來(lái)自于不同的來(lái)源。在一個(gè)特定實(shí)施方式中，腫瘤細(xì)胞可來(lái)自于待治療患者的原發(fā)性腫瘤或轉(zhuǎn)移性腫瘤?？梢酝ㄟ^(guò)活體解剖或外科手術(shù)獲得腫瘤細(xì)胞。將組織分解，分離和純化的腫瘤細(xì)胞就可以立即使用。同樣優(yōu)選建立 一個(gè)原發(fā)性腫瘤細(xì)胞系，和將這樣獲得的細(xì)胞用于腫瘤接種。或者，此類腫瘤細(xì)胞系可以用自體腫瘤來(lái)制備?；蛘?，也可以使用諸如ATCC的保藏機(jī)構(gòu)商業(yè)提供的腫瘤細(xì)胞。藥物組合物中的另一組分是樹突細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明，可以使用4各個(gè)階段的樹突細(xì)胞?？梢允褂猛ㄟ^(guò)從血液中分離樹突細(xì)胞直接從患者獲得的任何樹突細(xì)胞。盡管如此，還可進(jìn)一步根據(jù)樹突細(xì)胞所處的階段來(lái)對(duì)它們進(jìn)行分類。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式
中，從外周血單核細(xì)胞分化得到的樹突細(xì)胞用于制備腫瘤疫苗。已知在外周淋巴器官中有三種主要的能夠激活T細(xì)胞的抗原呈遞細(xì)胞，即樹突細(xì)胞，巨噬細(xì)胞和B細(xì)胞。其中最有影響的是樹突細(xì)胞，其已知的功能是向T細(xì)胞呈遞外源抗原。未成熟樹突細(xì)胞位于全身的組織中，包括皮膚，內(nèi)臟和呼吸道。樹突細(xì)胞存在兩種功能和形態(tài)不同的階段，即，未成熟和成熟的樹突細(xì)胞。未成熟樹突細(xì)胞具有很高的胞吞活性，其專門用于抗原捕獲和加工，且存在于體內(nèi)的外周組織。未成熟樹突細(xì)胞在外周耐受的誘導(dǎo)和維持中起著關(guān)鍵性作用。當(dāng)暴露于病原體衍生產(chǎn)物或先天前炎性信號(hào)下，樹突細(xì)胞會(huì)失去其吞噬活性，并且當(dāng)它們變?yōu)槌墒鞓渫患?xì)胞時(shí)會(huì)遷移到引流淋巴結(jié)中。由于表達(dá)高水平的抗原呈遞、附著和共刺激分子以及其他的諸如CD83和DC-LAMP的樹突細(xì)胞特異性標(biāo)記，成熟樹突細(xì)胞具有很高的抗原呈遞能力和T細(xì)胞激活能力。用于藥物組合物中的未成熟樹突細(xì)胞可以獲自不同的來(lái)源。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，未成熟的樹突細(xì)胞由待治療的患者的單核細(xì)胞中分化得到?；蛘撸M管如此，未成熟樹突細(xì)胞可以從其他來(lái)源獲得，例如從血液采集機(jī)構(gòu)獲得商業(yè)提供的血產(chǎn)品。為制備依據(jù)本發(fā)明的藥物組合物，要制備合適的未成熟樹突細(xì)胞?？梢岳貌煌姆椒ㄖ苽錁渫患?xì)胞(DCs)，這些細(xì)胞可能顯示出不同的特點(diǎn)。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，樹突細(xì)胞可以從通過(guò)白細(xì)胞分離術(shù)分離的單核細(xì)胞中獲得。在外周血中，DCs含有不到1%的單核細(xì)胞。白血球分離術(shù)可以用于分離大約IO6至IO7個(gè)樹突細(xì)胞，可以與陽(yáng)性選擇或陰性選擇技術(shù)聯(lián)合。雖然從外周血中直接分離樹突細(xì)胞允許快速制備樹突細(xì)胞，但是如果在實(shí)驗(yàn)中需要多重免疫的話，則需要重復(fù)進(jìn)行白血球分離術(shù)。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，通過(guò)在塑料材料上附著可通過(guò)白血球分離術(shù)來(lái)富集單核細(xì)胞。在細(xì)胞因子、優(yōu)選多種細(xì)胞因子的組合(cocktail)的存在下，樹突細(xì)胞被誘導(dǎo)分化，其中優(yōu)選粒細(xì)胞-巨噬集落刺激因子(GM-CSF)與白介素4聯(lián)合使用。一個(gè)制備樹突細(xì)胞的特別優(yōu)選的方法是體外生產(chǎn)。單核細(xì)胞是樹突細(xì)胞的前體，它們可以通過(guò)很多技術(shù)從外周血中富集，例如白血球分離術(shù)、塑料附著、密度梯度離心，CD14+細(xì)胞陽(yáng)性選擇，B-細(xì)胞和T-細(xì)胞陰性選擇及其組合。可以用細(xì)胞因子，特別是粒細(xì)胞-巨噬集落刺激因子(GM-CSF)+白介素4或白介素13處理富集的前體細(xì)胞群體約3-7天、優(yōu)選7天，以此來(lái)培養(yǎng)和分化DC。該實(shí)施方式的一個(gè)優(yōu)勢(shì)是超過(guò)IO9個(gè)DC可以從單個(gè)白血球分離術(shù)產(chǎn)物中制備出來(lái)，通過(guò)低溫儲(chǔ)藏DC制劑，優(yōu)選在液氮中，可以將此類制劑用于多次進(jìn)一步接種中。而DCs可以在很多培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，優(yōu)選使用無(wú)血清培養(yǎng)基或包含自體血清的培養(yǎng)基。對(duì)于藥物組合物的工業(yè)制備，特別優(yōu)選以避免(例如由于胎牛血清)發(fā)生過(guò)敏反應(yīng)或病毒污染的方式大規(guī)族制備未成熟的樹突細(xì)胞。在藥物組合物制備的下一步，用凋亡的腫瘤細(xì)胞裝載未成熟的樹突細(xì)胞，所述腫瘤細(xì)胞通過(guò)用高靜水壓力處理來(lái)獲得。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，通過(guò)使用很多刺激因子，例如腫瘤壞死因子α (TNF-α)或者脂多糖或poly I :C，使與凋亡腫瘤細(xì)胞接觸的未 成熟樹突細(xì)胞成熟化。獲得的藥物組合物保藏待用，優(yōu)選通過(guò)低溫保藏。生物樣品的低溫保藏在臨床醫(yī)學(xué)和生物醫(yī)學(xué)研究中被廣泛使用。盡管如此，這種技術(shù)對(duì)于細(xì)胞活力和尤其是細(xì)胞功能的影響有時(shí)是被低估的。因此，應(yīng)當(dāng)仔細(xì)考慮所用的在用于癌癥疫苗前冷凍細(xì)胞制劑的方法。低溫冷藏的效果當(dāng)然也取決于所使用的特定的細(xì)胞，也應(yīng)當(dāng)檢測(cè)藥物組合物的生物學(xué)活性是否被低溫保藏所改變。還需要加入一些保護(hù)組分，如非免疫原性的多糖或DMS0。本發(fā)明的藥物組合物可以靜脈內(nèi)(IV)、皮內(nèi)、皮下或淋巴內(nèi)施用，其中特別優(yōu)選皮下施用。藥物組合物的免疫最優(yōu)劑量和頻率取決于腫瘤種類，患者的年齡和情況以及腫瘤疾病的進(jìn)展階段。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，第一次是以免疫劑量施用藥物組合物，然后在2-8周的間隔范圍內(nèi)應(yīng)用長(zhǎng)期加強(qiáng)注射施用。這里所描述的腫瘤疫苗接種可以成功應(yīng)用于所有形式的腫瘤。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，藥物組合物用于治療處于癌癥晚期以及處于癌癥早期的患者。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，腫瘤疫苗接種被應(yīng)用于處于前列腺癌癥晚期，并且是激素治療耐受的轉(zhuǎn)移性前列腺癌癥的患者中。“癌癥的早期階段”可以理解這些癌癥是可能診斷的。通?；颊卟⒉粫?huì)顯示出疾病的信號(hào)。在“癌癥的晚期階段”，患者常常遭受強(qiáng)烈的疾病后果，例如疼痛和虛尋層。盡管本領(lǐng)域已知在腫瘤治療疫苗接種中使用佐劑，但在本發(fā)明過(guò)程中優(yōu)選不使用任何進(jìn)一步的佐劑，例如脂多糖，弗氏不完全佐劑(incomplete Freund’ s adjuvant)或熱激蛋白。本發(fā)明很重要的一個(gè)方面，用高靜水壓力處理的腫瘤細(xì)胞處于這樣一個(gè)階段，SP當(dāng)施用給患者后，它們不能生長(zhǎng)和形成轉(zhuǎn)移性腫瘤。這已經(jīng)被很多實(shí)驗(yàn)方法所證實(shí)，包括克隆形成測(cè)定(clonogenic assay)。這里所描述的藥物組合物可以通過(guò)癌癥免疫療法(疫苗接種)用于治療人。衍生于待治療患者的腫瘤細(xì)胞通過(guò)上述的高靜水壓力處理被帶入凋亡的階段?？蛇x使用多種合適的腫瘤細(xì)胞系。未成熟樹突細(xì)胞優(yōu)選利用白血球分離術(shù)從同一個(gè)患者中獲得，并且用細(xì)胞因子進(jìn)行處理以在體外培養(yǎng)細(xì)胞。用凋亡的腫瘤細(xì)胞裝載合適數(shù)量(例如IO7-IO8個(gè)細(xì)胞)的此類未成熟樹突細(xì)胞，其中未成熟樹突細(xì)胞凋亡細(xì)胞的最優(yōu)比例范圍是10 I至
I 1，優(yōu)選 5 I 至 3 : I。在樹突細(xì)胞成熟后，藥物組合物可以被應(yīng)用于患者。捕獲了被高靜水壓力殺死的腫瘤細(xì)胞的樹突細(xì)胞可以直接用于腫瘤疫苗。盡管如此，在施用給患者前可以進(jìn)一步激活或使細(xì)胞成熟，例如通過(guò)細(xì)胞因子的處理。根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選使用下述材料和方法據(jù)顯示，用在高靜水壓力(200MPa)在約21°C下處理卵巢癌細(xì)胞和前列腺癌細(xì)胞以及急性淋巴細(xì)胞性白血病細(xì)胞10分鐘會(huì)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的免疫原性細(xì)胞死亡的誘導(dǎo)。被HHP(高靜水壓力)殺死的腫瘤細(xì)胞的免疫原性程度大大高過(guò)被蒽環(huán)類抗生素，已知的唯一誘導(dǎo)免疫原性細(xì)胞死亡的細(xì)胞抑制劑或UV放射殺死的腫瘤細(xì)胞。HH-殺死的腫瘤細(xì)胞被抗 原呈遞細(xì)胞瘋狂地吞噬，并在甚至沒(méi)有額外病原體衍生刺激物，例如LPS的情況下誘導(dǎo)它們的激活。裝載有HHP殺死的腫瘤細(xì)胞的抗原呈遞細(xì)胞誘導(dǎo)強(qiáng)烈的CD4和CD8介導(dǎo)的腫瘤特異性T細(xì)胞響應(yīng)，而不會(huì)誘導(dǎo)可能有害的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。因此，HHP殺死的腫瘤細(xì)胞成為臨床癌癥免疫治療方法中的一個(gè)有力的工具。盡管持續(xù)引入新的藥物和進(jìn)一步開發(fā)化療方法，但是似乎在一定程度上化療已經(jīng)達(dá)到了它的極限，其臨床效果也處于停滯水平。此外，盡管不能否認(rèn)一些惡性腫瘤治療方法所取得的成功，但在一些腫瘤中，尤其是實(shí)體瘤中，化療很少見效。治療方案的聯(lián)合應(yīng)用已經(jīng)成為癌癥治療的標(biāo)準(zhǔn)策略，典型的例子是外科手術(shù)和化療或放射性治療的聯(lián)合使用。應(yīng)該不僅僅致力于設(shè)計(jì)現(xiàn)代的免疫治療策略，還應(yīng)當(dāng)致力于將免疫治療方法整合到當(dāng)前化療方法之中。今后，化學(xué)療法和免疫療法不應(yīng)當(dāng)被認(rèn)為是兩種相互對(duì)抗的治療類型，更可信的是它們進(jìn)行適當(dāng)?shù)穆?lián)合，這將會(huì)大大促進(jìn)癌癥患者的疾病預(yù)后。優(yōu)選的細(xì)胞系使用急性淋巴細(xì)胞性白血病細(xì)胞系(REH，DSMZ, Braunschweig,Germany)，卵巢癌細(xì)胞(0V90, ATCC, Teddington, UK)，前列腺癌細(xì)胞(LNC 印，ATCC,Teddington, UK)。所有的細(xì)胞系均在RPMI1640培養(yǎng)基(Gibco)中培養(yǎng)。所有的培養(yǎng)基都補(bǔ)充以10%的熱失活胎牛血清(Lonza), 100U/ml盤尼西林和2mmol/L_谷氨酰胺。原發(fā)性腫瘤細(xì)胞的分離原發(fā)性卵巢癌細(xì)胞和前列腺癌細(xì)胞從t進(jìn)行手術(shù)的患者中獲得。通過(guò)Ficoll梯度梯度離心，患有急性淋巴細(xì)胞性白血瘋患者的未成熟淋巴細(xì)胞獲得自(所有)患者的骨髓。凋亡誘導(dǎo)和檢測(cè)用高靜水壓力處理10分鐘以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡。在對(duì)照實(shí)驗(yàn)中，用UV光照射誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡。在這種情況下施用7. 6J/Cm2能量10分鐘。通過(guò)annexinV異硫氰酸熒光素染色來(lái)評(píng)估細(xì)胞的死亡。簡(jiǎn)言之，每個(gè)樣品收集2X IO5個(gè)細(xì)胞，用PBS洗滌，沉淀(pellet)，在孵育緩沖液中重懸，所述緩沖液含有annexin V異硫氰酸熒光素抗體。在黑暗中保存樣品，在加入400 μ I的O. I %的碘化丙啶孵育緩沖液之前孵育15分鐘，之后用FlowJo軟件在Aria熒光-激活細(xì)胞分選器(BD Bioscience)中進(jìn)行后續(xù)的分析。流式細(xì)胞分析細(xì)胞表面的hsp70、hsp90和CRT(鈣網(wǎng)絡(luò)蛋白)總數(shù)IO5個(gè)細(xì)胞置于12孔板中，在接下來(lái)的一天中用所示試劑處理，或者是作為對(duì)照的UV-輻射(7. 6J/cm2)處理6、12或24小時(shí)，或者在21攝氏度下用高靜水壓力處理10分鐘。收集細(xì)胞，用PBS洗滌兩次。將細(xì)胞用稀釋于冷凍封閉緩沖液(含有2%胎牛血清的PBS)中的一抗(primary antibody)孵育30分鐘,然后洗漆并在封閉溶液中與Alexa648連接的單克隆二抗(secondary antibody)孵育。通過(guò)FACScan (BD Bioscience)分析每個(gè)樣品以確定細(xì)胞表面的 hsp70，hsp90 和 CRT。檢測(cè)HMGBl的釋放酶聯(lián)免疫吸附法II試劑盒獲自SHIN0-TESTCORPORATION (Tokyo, Japan)。REH細(xì)胞，0V90細(xì)胞，LNCap細(xì)胞，原發(fā)性卵巢癌細(xì)胞和白血病細(xì)胞(106)置于Iml適合細(xì)胞類型的全培養(yǎng)基中。在不同的時(shí)間點(diǎn)收集上清液，通過(guò)離心去除死亡的腫瘤細(xì)胞，分離出上清液，立即凍住。上清液中HMGBl的定量根據(jù)操作手冊(cè)利用酶聯(lián)免疫吸附法進(jìn)行測(cè)定。熒光顯微鏡免疫熒光對(duì)于CRT的表面檢測(cè)，將細(xì)胞置于冰上，用PBS洗滌兩次，在O. 25%的多聚甲醛的PBS溶液中固定5分鐘。然后在PBS中洗滌細(xì)胞兩次，加入溶于冷凍封閉緩沖液中的一抗30分鐘。在用冷PBS洗滌兩次后，將細(xì)胞與合適的Alexa648連接的單克隆二抗孵育30分鐘。用4%的多聚甲醛固定細(xì)胞20分鐘，用PBS洗滌20分鐘，安裝于玻片上。 對(duì)于吞曬作用，將DCs用Vybrant Dio細(xì)胞標(biāo)記溶液(Invitrogen)進(jìn)行染色。用Vybrant Dil細(xì)胞標(biāo)記溶液(Invitrogen)對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行染色,并且在蒽環(huán)類抗生素存在的情況下培養(yǎng)，用UV光照射或在21攝氏度下高靜水壓力處理10分鐘。以DC/腫瘤細(xì)胞I : 5的比例，將腫瘤細(xì)胞提供(feed)給未成熟的DCs(第5天)。用4%的多聚甲醛固定細(xì)胞20分鐘,用PBS洗漆20分鐘,用ProLong Gold antifade試劑(Invitrogen)裝載于玻片上。裝載有腫瘤細(xì)胞的DCs的產(chǎn)生以及腫瘤細(xì)胞死亡的誘導(dǎo)通過(guò)培養(yǎng)純化的⑶14+細(xì)胞來(lái)產(chǎn)生DCs，所述⑶14+細(xì)胞是在粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF) (Gentaur,Brussels, Belgium)和白介素 4(IL_4, Gentaur, Brussels, Belgium)存在的情況下從掠黃層中分離出來(lái)的。在21攝氏度下高靜水壓力處理10分鐘以殺死腫瘤細(xì)胞，或者，用作對(duì)照的通過(guò)UV輻射或蒽環(huán)類抗生素殺死腫瘤細(xì)胞。用annexin V/PI染色來(lái)監(jiān)測(cè)細(xì)胞凋亡的程度。在提供DC前，全面洗滌細(xì)胞。以DC/腫瘤細(xì)胞I : 5的比例，將腫瘤細(xì)胞提供給未成熟的DCs (第5天)。在一些實(shí)驗(yàn)中，以100ng/ml的脂多糖(LPS) (Signma)處理12小時(shí)或用25 μ g/ml的Poly I : C(由Invitrigen獲得)以刺激脈沖的DCs。在與被殺死的腫瘤細(xì)胞相互作用后FACS分析DCs表型用流式細(xì)胞術(shù)來(lái)檢測(cè)用腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)的DCs的表型。利用選擇的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制劑或UV輻射(對(duì)照實(shí)驗(yàn))或21攝氏度高靜水壓力處理10分鐘(依據(jù)本發(fā)明)來(lái)殺死腫瘤細(xì)胞，將其與未成熟DCs共培養(yǎng)24小時(shí)。對(duì)于一些實(shí)驗(yàn)，在共培養(yǎng)以監(jiān)測(cè)細(xì)胞吞噬作用前，用染料標(biāo)記DC和腫瘤細(xì)胞。使用針對(duì)下述分子的單克隆抗體(mAbs) :CD80-FITC，CD83-FITC，CD86-PE，CD14-PE (Immunotech，Marseille, France), CDllc-PE, HLA-DR(BD Biosciences, San Jose, CA)。在4°C對(duì)DCs染色30分鐘，在磷酸鹽緩沖液(PBS)中洗滌兩次，用FlowJO軟件，F(xiàn)ACS Aria (BD Biosciences)進(jìn)行分析。根據(jù)FSC和SSC特征來(lái)截住(gate) DCs0其中包括了合適的同種型對(duì)照，每個(gè)實(shí)驗(yàn)都需要50000個(gè)活的DCs。IFN-Y誘導(dǎo)腫瘤特異性T細(xì)胞的評(píng)估在培養(yǎng)的第O天和第7天，以比例I : 10將未脈沖或腫瘤細(xì)胞裝載的DCs加入到自體T細(xì)胞中。在培養(yǎng)的第2天和第7天加入IL-2 (25-50國(guó)際單位/mL ；Peprotech)。在DCs最后一次刺激之后的7至9天，檢測(cè)培養(yǎng)物中是否存在腫瘤特異性T細(xì)胞。腫瘤裝載的DCs對(duì)前列腺特異性抗原(PSA)反應(yīng)性T細(xì)胞中的腫瘤-反應(yīng)性、產(chǎn)生干擾素(IFN)-Y的T細(xì)胞的誘導(dǎo)通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行確定。用抗-人⑶8/IFN Y對(duì)T細(xì)胞進(jìn)行染色。培養(yǎng)物中的調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞的頻率通過(guò)用⑶4/⑶25和FoxP3染色來(lái)進(jìn)行分析。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)確定為是⑶4陽(yáng)性、⑶25陽(yáng)性和FoxP3陽(yáng)性。本發(fā)明進(jìn)一步在下述實(shí)施例中被闡述，但不局限于下述實(shí)施例實(shí)施例I在用高靜水壓力處理后，人癌細(xì)胞系和人原發(fā)性腫瘤細(xì)胞中免疫原性細(xì)胞死亡標(biāo)記hsp70、hsp90和I丐網(wǎng)織蛋白的表達(dá)白血病、卵巢和前列腺癌細(xì)胞系和原發(fā)性中瘤細(xì)胞用高靜水壓力(HHP，200MPa)在21攝氏度下處理10分鐘，在6、12和24小時(shí)時(shí)監(jiān)控已知免疫原性細(xì)胞死亡標(biāo)記hsp70、 hsp90和鈣網(wǎng)織蛋白的表達(dá)。在所有待測(cè)腫瘤模型中，HHP處理后6、12和24小時(shí)后檢測(cè)到免疫原性細(xì)胞死亡標(biāo)記鈣網(wǎng)織蛋白、hsp70和hsp90的顯著表達(dá)。這些免疫原性分子的表達(dá)顯著高于由蒽環(huán)類抗生素(已知僅有的免疫原性細(xì)胞死亡的誘導(dǎo)子)所誘導(dǎo)的表達(dá)(圖2)。HHp處理后鈣網(wǎng)織蛋白和熱激蛋白的增高表達(dá)伴隨著它們?cè)诩?xì)胞表面上的易位。HHp處理還誘導(dǎo)了 HMGBl的快速和大量地釋放，其中HMGBl是免疫原性細(xì)胞死亡的可溶性標(biāo)記。HMGBl的釋放要比UV輻射或蒽環(huán)類抗生素處理時(shí)高得多(圖3)。在誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡的48小時(shí)后，檢測(cè)到了 HMGBl核蛋白的最大釋放。實(shí)施例2高靜水壓力處理腫瘤細(xì)胞提高了其被抗原呈遞細(xì)胞的吞噬考慮到鈣網(wǎng)織蛋白所建立起來(lái)的“吃我”信號(hào)的作用，研究了樹突細(xì)胞(DCs)對(duì)于被高靜水壓力殺死的腫瘤細(xì)胞的吞噬率，而樹突細(xì)胞是最有效的抗原呈遞細(xì)胞，它對(duì)于免疫應(yīng)答的引發(fā)是非常關(guān)鍵的。與其他方式例如蒽環(huán)類抗生素和UV輻射所殺死的腫瘤細(xì)胞相比，高靜水壓力處理的腫瘤細(xì)胞以更快的速率和更高的程度被吞噬。12小時(shí)后，用HHP處理的白細(xì)胞的吞噬程度是由UV輻射殺死的細(xì)胞的吞噬程度的4倍(圖4a和圖4b)。實(shí)施例3高靜水壓力處理的腫瘤細(xì)胞的吞噬誘導(dǎo)DCs的成熟。DCs激活免疫應(yīng)答的能力取決于它們的活化狀態(tài)以及協(xié)同刺激分子的表達(dá)。在正常環(huán)境下，最有效的DCs的成熟是由衍生于病原體的分子所誘導(dǎo)的，例如革蘭氏陰性菌中的脂多糖(LPS)。只有激活的(成熟的)表達(dá)高水平協(xié)同刺激分子的DCs能夠引發(fā)免疫應(yīng)答。我們分析了吞噬被HHP殺死的腫瘤細(xì)胞的樹突細(xì)胞的表型。DCs與HHP-處理的腫瘤細(xì)胞的相互作用誘導(dǎo)了協(xié)同刺激因子(CD86，CD83)和成熟相關(guān)分子(HLA-DR)調(diào)到與被LPS激活類似的程度(圖5)。因此，被HHP殺死的腫瘤細(xì)胞能夠與病原體來(lái)源的LPS相當(dāng)?shù)卣T導(dǎo)DCs的成熟。實(shí)施例4呈遞高靜水壓力處理的腫瘤細(xì)胞的DCs誘導(dǎo)腫瘤特異性T細(xì)胞并且誘導(dǎo)低數(shù)量的抑制性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞為了研究HHP處理的且表達(dá)免疫原性細(xì)胞死亡標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞是否誘導(dǎo)抗-腫瘤免疫，我們?cè)u(píng)估了裝載腫瘤細(xì)胞的DCs激活腫瘤細(xì)胞特異性T細(xì)胞響應(yīng)的能力。HHP殺死的腫瘤細(xì)胞與未成熟DCs共培養(yǎng)，隨后使用或不使用LPS成熟化。這些DCs被用做自體T細(xì)胞的刺激物，在用腫瘤細(xì)胞裝載的DCs再刺激之后的一周，分析了產(chǎn)生IFN-Y的T細(xì)胞的頻率。與使用經(jīng)輻射細(xì)胞脈沖的DCs相比，即便是沒(méi)有加入成熟刺激物(LPS)的情況下，用HHP殺死的腫瘤細(xì)胞裝載的DCs也誘導(dǎo)了更多數(shù)量的腫瘤特異性的產(chǎn)生IFN- Y的T細(xì)胞。此外，在DC和T細(xì)胞共培養(yǎng)物中還檢測(cè)了調(diào)節(jié)型T細(xì)胞(Tregs)的頻率。在腫瘤免疫中，Tregs的誘導(dǎo)是不需要的，因?yàn)門regs會(huì)抑制靶向腫瘤的免疫應(yīng)答。與未成熟的DCs和LPS激活的DCs相比，用HHP殺死的腫瘤細(xì)胞脈沖的DCs具有更低的產(chǎn)生調(diào)節(jié)型T細(xì)胞的能力(圖8)。FoxP3表面標(biāo)記物對(duì)于調(diào)節(jié)型T細(xì)胞是特異性的。實(shí)施例5在通過(guò)手術(shù)或放射初步治療腫瘤后,主動(dòng)細(xì)胞免疫治療在治療最小殘余疾病的情況中可作為單獨(dú)治療模式來(lái)施用。在前列腺癌癥中，它可涉及具有生化復(fù)發(fā)信號(hào)的患者(通過(guò)超靈敏的方法，外周血中的前列腺特異性抗原PSA的水平增高)。 當(dāng)通過(guò)手術(shù)將原發(fā)性腫瘤從患者中移除后，本發(fā)明可獲得最好的效果。在本申請(qǐng)中所描述的藥物組合物可以從腫瘤細(xì)胞中生產(chǎn)，所述腫瘤細(xì)胞是從腫瘤組織或從腫瘤細(xì)胞系中分離得到。一名患有前列腺癌的患者(68歲)在腫瘤早期被診斷出來(lái)。腫瘤被切除，但是手術(shù)后幾個(gè)月又檢測(cè)到了 PSA水平的上升。因此，患者被進(jìn)行白血球分離術(shù)，以及從分離的單核細(xì)胞中分化了未成熟樹突細(xì)胞。對(duì)從前列腺癌細(xì)胞系中獲得的腫瘤細(xì)胞被進(jìn)行如本發(fā)明所述的高靜水壓力凋亡處理，將凋亡的腫瘤細(xì)胞與未成熟的樹突細(xì)胞接觸以制備疫苗組合物。藥物組合物被劃分成幾等份，凍在液氮中待用。第一次施用腫瘤疫苗接種是在檢測(cè)到前列腺癌癥的生化復(fù)發(fā)信號(hào)之后4周。接著在一年之內(nèi)每4周施用一次。疫苗誘導(dǎo)了針對(duì)少量存活腫瘤細(xì)胞的免疫應(yīng)答，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的顯著變慢以及導(dǎo)致了患者生存時(shí)間的延長(zhǎng)。實(shí)施例6在后期的癌癥患者中，根據(jù)化學(xué)-免疫治療概念，激活的細(xì)胞免疫治療應(yīng)當(dāng)與化療相結(jié)合(即，前列腺癌中的多西他奇)。一名患有后期前列腺癌的患者(76歲)用本發(fā)明的方法治療。這里披露了常用的化療方法與激活的細(xì)胞免疫治療相結(jié)合。該患者在65歲時(shí)就進(jìn)行前列腺腫瘤治療。在手術(shù)切除腫瘤和激素治療之后，PSA(前列腺特異性抗原)水平保持在一個(gè)較低的水平，這表明前列腺癌細(xì)胞并沒(méi)有生長(zhǎng)。在激素治療后12個(gè)月后，轉(zhuǎn)移性前列腺癌癥在身體的不同部位(尤其是骨頭中)發(fā)展，腫瘤變?yōu)榧に乜剐浴Ｔ摶颊弑猾@準(zhǔn)用多西他奇與基于樹突細(xì)胞的主動(dòng)細(xì)胞免疫療法聯(lián)合治療激素抗性(hormone refractory)前列腺癌。在化療開始之前，從在白血球分離術(shù)時(shí)獲得的單核細(xì)胞中產(chǎn)生未成熟的樹突細(xì)胞。從前列腺癌細(xì)胞系中獲得的腫瘤細(xì)胞在21攝氏度下，用210MPa的高靜水壓力處理30分鐘。根據(jù)本發(fā)明所處理的IO9個(gè)腫瘤細(xì)胞被用于脈沖IO9個(gè)未成熟樹突細(xì)胞，之前已被這些腫瘤細(xì)胞脈沖的成熟樹突細(xì)胞等份被深度凍存于液氮中，以便后續(xù)的使用。主動(dòng)癌癥免疫療法每4-6周與標(biāo)準(zhǔn)的多西他奇化療交替循環(huán)施用或單獨(dú)使用(多西他奇治療結(jié)束之后)一年。聯(lián)合的化學(xué)免疫療法使疾病穩(wěn)定，骨髓轉(zhuǎn)移密度降低以及存活時(shí)間超出預(yù)期?；颊攥F(xiàn)在已經(jīng)存活超過(guò)3年，超出了在治療初期所預(yù)期的6個(gè)月存活時(shí)間。實(shí)施例7體外實(shí)驗(yàn)顯示了 HHP殺死的腫瘤細(xì)胞相對(duì)于UV殺死的腫瘤細(xì)胞的優(yōu)勢(shì)在體外實(shí)驗(yàn)中，檢測(cè)了未成熟樹突細(xì)胞，poly I C激活的成熟樹突細(xì)胞、裝載有被HHP處理的腫瘤細(xì)胞和UV輻射的腫瘤細(xì)胞的樹突細(xì)胞誘導(dǎo)腫瘤特異性免疫的能力。腫瘤特異性免疫通過(guò)腫瘤特異性T淋巴細(xì)胞百分比來(lái)測(cè)量。含有HHP殺死的腫瘤細(xì)胞的樹突細(xì)胞與單獨(dú)的HHP殺死的腫瘤細(xì)胞和裝載有UV輻射殺死的腫瘤細(xì)胞的樹突細(xì)胞進(jìn)行比較。這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示在圖7中。為了檢測(cè)未脈沖的或裝載有腫瘤細(xì)胞的樹突細(xì)胞誘導(dǎo)腫瘤特異性T細(xì)胞的能力， 在培養(yǎng)的第O天和7天以I : 10的比例向細(xì)胞中加入自體T細(xì)胞。在第2天和7天向培養(yǎng)物中加入25-50國(guó)際單位/ml的IL-2 (PeproTech)。在最后一次對(duì)DCs的刺激后7-9天，檢測(cè)培養(yǎng)物中是否存在腫瘤特異性T細(xì)胞。腫瘤裝載的DCs對(duì)前列腺特異性抗原(PSA)反應(yīng)性T細(xì)胞的腫瘤反應(yīng)性、產(chǎn)生干擾素-Y的T細(xì)胞的誘導(dǎo)由流式細(xì)胞術(shù)所確定。用抗人-⑶8/干擾素-Y對(duì)T細(xì)胞染色。將裝載有高靜水壓力殺死的腫瘤細(xì)胞(LNCap)的樹突細(xì)胞對(duì)前列腺特異性抗原(PSA)特異性T細(xì)胞的誘導(dǎo)與單獨(dú)的高靜水壓力殺死的腫瘤細(xì)胞以及裝載有UV輻射殺死的腫瘤細(xì)胞的樹突細(xì)胞進(jìn)行比較。這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示于圖7中。圖7的上部顯示了甚至在沒(méi)有成熟信號(hào)的情況下，裝載有HHP殺死的腫瘤細(xì)胞的DC能夠誘導(dǎo)腫瘤特異性T細(xì)胞。裝載有UV處理殺死的腫瘤細(xì)胞和單獨(dú)的HHP殺死的腫瘤細(xì)胞的樹突細(xì)胞并不能誘導(dǎo)腫瘤免疫。驚奇的是,只有HHP處理的腫瘤細(xì)胞(根據(jù)本發(fā)明)和成熟的樹突細(xì)胞能夠誘導(dǎo)腫瘤特異性免疫應(yīng)答，然而UV處理的腫瘤細(xì)胞和未成熟的樹突細(xì)胞并不能獲得該結(jié)果。不期望受到理論的束縛，似乎只有HHP處理的腫瘤細(xì)胞與未成熟的樹突細(xì)胞一起才能誘導(dǎo)腫瘤特異性T細(xì)胞免疫應(yīng)答。HHP處理的腫瘤細(xì)胞似乎是作為未成熟樹突細(xì)胞的一種激活物，而UV處理的腫瘤細(xì)胞并不具有這種效果。圖7的下部顯示當(dāng)應(yīng)用poly I C處理的時(shí)候，相比起用UV輻射的腫瘤細(xì)胞，HHP腫瘤細(xì)胞能夠更好地誘導(dǎo)特異性T淋巴細(xì)胞。實(shí)施例8以根據(jù)本發(fā)明的腫瘤疫苗接種獲得的體內(nèi)數(shù)據(jù)樹突細(xì)胞從和上述相似的患者群中得到。用上述殺死的腫瘤細(xì)胞對(duì)樹突細(xì)胞進(jìn)行脈沖，以4-6周的間隔向患者重復(fù)施用最高達(dá)12劑的腫瘤疫苗接種，所述患者在根治的前列腺切除或放射治療之后出現(xiàn)了前列腺癌癥的生化復(fù)發(fā)。每個(gè)患者的疾病進(jìn)展通過(guò)PSA加倍時(shí)間來(lái)進(jìn)行評(píng)估。在PSA加倍時(shí)間中，該時(shí)間被理解為使PSA值加倍的時(shí)間。PSA加倍時(shí)間顯示為患有前列腺癌男性總體存活和無(wú)轉(zhuǎn)移存活的最強(qiáng)和最可靠決定因素。短的PSA加倍時(shí)間與縮短的生存時(shí)間和轉(zhuǎn)移性腫瘤出現(xiàn)時(shí)間相關(guān)(Antonarakis et al. ,BJU Int.,2012，108(3) ；pp378-385o正如圖9中所顯示的，向根治前列腺切除或放射性治療之后患有前列腺癌生化復(fù)發(fā)的患者中持續(xù)地施用本發(fā)明的腫瘤疫苗接種導(dǎo)致了 PSA加倍時(shí)間顯著加長(zhǎng)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)通過(guò)使用這里所披露的腫瘤疫苗接種后，平均PSA加倍時(shí)間從癌癥免疫治療前的5個(gè)月提高到12個(gè)月免疫治療后的30個(gè)月。這代表著患有前列腺癌癥生化復(fù)發(fā)的患者一個(gè)顯著的益處。實(shí)施例9處于前列腺癌癥晚期的患者的臨床實(shí)驗(yàn)在這個(gè)臨床實(shí)驗(yàn)中，如這里所描述的，用被殺死的腫瘤細(xì)胞對(duì)樹突細(xì)胞進(jìn)行脈沖。向處于前列腺癌癥晚期的患者重復(fù)施用腫瘤疫苗。所述患者患有去雄抗性轉(zhuǎn)移性前列腺癌。在這些患者中，與多西他奇化學(xué)療法一起，以不同的劑量計(jì)劃施用免疫治療方法。治療后的群體的存活與歷史性定群或Halabi列線表所評(píng)估的存活相比較。據(jù)顯示，與基于Halabi列線表所計(jì)算的預(yù)期存活時(shí)間(13個(gè)月)的歷史性對(duì)照定群相比，主動(dòng)腫瘤免疫療法的持續(xù)性施用顯著地延長(zhǎng)了被治療患者的存活時(shí)間(中位存活23個(gè)月)。 該實(shí)驗(yàn)證實(shí)了本發(fā)明的腫瘤疫苗接種大大地延長(zhǎng)了處于前列腺癌癥晚期的患者的存活時(shí)間。這樣的患者的平均預(yù)期存活時(shí)間沒(méi)有經(jīng)歷過(guò)治療是13個(gè)月，相比之下，以本發(fā)明的腫瘤疫苗接種治療后是23個(gè)月。對(duì)于極其難以用藥物治療成功的患者而言，這代表著顯著的進(jìn)步。
權(quán)利要求
1.用于誘導(dǎo)針對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫應(yīng)答的藥物組合物，包含 a)由高靜水壓力處理造成凋亡的腫瘤細(xì)胞，和 b)樹突細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的藥物組合物，其特征在于用靜水壓力在至少200MPa的壓力下處理所述腫瘤細(xì)胞至少10分鐘。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的藥物組合物，其特征在于用靜水壓力在200 250MPa壓力下處理所述腫瘤細(xì)胞10分鐘至2小時(shí)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其特征在于所述凋亡的腫瘤細(xì)胞不是壞死的。
5.根據(jù)前面權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其特征在于所述腫瘤細(xì)胞衍生自腫瘤細(xì)胞系。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其特征在于所述腫瘤細(xì)胞衍生自從待治療患者中分離出來(lái)的腫瘤。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其特征在于未成熟的樹突細(xì)胞裝載有用高靜水壓力處理過(guò)的凋亡腫瘤細(xì)胞。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的藥物組合物，其特征在于未成熟的樹突細(xì)胞通過(guò)白血球分離術(shù)獲得。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的藥物組合物，其特征在于未成熟的樹突細(xì)胞通過(guò)白血球分離術(shù)并在細(xì)胞因子存在的情況下體外培養(yǎng)而獲得。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其用于患有早期癌癥或晚期癌癥的患者。
11.根據(jù)權(quán)利要求10中的藥物組合物，其中所述晚期癌癥是激素治療抗性轉(zhuǎn)移性前列腺癌。
12.如權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)所述的藥物組合物的制備方法，其特征在于將未成熟的樹突細(xì)胞裝載由高靜水壓力處理過(guò)的凋亡腫瘤細(xì)胞，然后使該樹突細(xì)胞成熟化。
13.用癌癥疫苗治療人的方法，包括從患者分離未成熟的樹突細(xì)胞和從患者分離腫瘤細(xì)胞，其中所述腫瘤細(xì)胞可通過(guò)用高靜水壓力處理使其轉(zhuǎn)向凋亡階段、裝載至未成熟的樹突細(xì)胞上，以及使所述樹突細(xì)胞成熟化，然后將藥物組合物施用給患者。
14.用癌癥疫苗治療人的方法，包括從患者體內(nèi)分離未成熟的樹突細(xì)胞和將獲自腫瘤細(xì)胞系的腫瘤細(xì)胞裝載到所述樹突細(xì)胞中，其中所述中瘤細(xì)胞可通過(guò)用高靜水壓力處理使其轉(zhuǎn)向凋亡階段，其中任選使所述樹突細(xì)胞成熟化，然后將藥物組合物施用給患者。
全文摘要
本發(fā)明披露了一種用于誘導(dǎo)針對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫應(yīng)答的藥物組合物以及制備此類組合物的方法，所述藥物組合物包含樹突細(xì)胞和用高靜水壓力處理造成凋亡的腫瘤細(xì)胞。
文檔編號(hào)A61K35/12GK102861103SQ201210292499
公開日2013年1月9日 申請(qǐng)日期2012年7月4日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月5日
發(fā)明者J·巴圖恩科娃, R·斯皮塞克 申請(qǐng)人:索蒂奧公司