專利名稱：一種貓爪草提取物在制備抗肺癌的藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及ー種貓爪草提取物在制備抗肺癌的藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
肺癌是臨床上最常見的惡性腫瘤之一，我國(guó)肺癌發(fā)病率在城市中占常見惡性腫瘤的首位，在農(nóng)村占第三位。肺癌的惡性程度高，生物學(xué)特性復(fù)雜，且預(yù)后差，目前治療是以手術(shù)、化療、放療為主，西醫(yī)治療在縮小瘤體方面有一定的優(yōu)勢(shì)，而中醫(yī)治療除具有直接抗腫瘤的作用外，還可以配合放療和化療，起到增效減毒的作用，增強(qiáng)患者對(duì)放療和化療的耐受性，提高生存質(zhì)量，對(duì)某些晩期肺癌無(wú)法手術(shù)者，可服抗癌中藥延長(zhǎng)生存期，因此，綜合治療 是首選。中藥貓爪草(Radix Ranunculus ternati)系毛茛科植物小毛茛(Ranunculusternatus Thunb)的干燥塊根，別名三散草(浙江)、貓爪兒草(河南)、貓爪子(河南)、鴨腳板(安黴)、金花草(廣西)，是20世紀(jì)50年代河南信陽(yáng)地區(qū)新發(fā)現(xiàn)的一種草藥，我國(guó)各省區(qū)均有分布，文字記載首見于《中藥材手冊(cè)》，《中華人民共和國(guó)藥典》自1977年版開始收載。貓爪草性溫，味甘、辛，入肝、肺經(jīng)，具有清熱解毒、消腫散結(jié)、止咳祛痰等功效，臨床用于治療肺結(jié)核、淋巴結(jié)結(jié)核、咽喉炎、瘧疾等癥。如中國(guó)專利申請(qǐng)CN 200810121086. 8公開了一種運(yùn)用大孔樹脂制備貓爪草總苷提取物的方法及用途。它是在粉碎的貓爪草藥材或貓爪草飲片中，加入6 15倍體積百分比濃度為10% -80%的こ醇，加熱回流提取，過濾，合并提取液，減壓回收こ醇，提取液通過填充有大孔樹脂的層析柱，用水洗滌樹脂，水洗脫液棄去；用含體積百分比濃度為20 95%含水こ醇洗脫，流速為2 4BV/H，こ醇洗脫液減壓濃縮至相對(duì)密度為I. I I. 25，減壓或噴霧干燥，得貓爪草總苷。貓爪草總苷含量不低于20%、貓爪草苷D含量不低于1.0%重量的貓爪草總苷提取物，用于治療結(jié)核病。近年來(lái)，貓爪草多與其它多味中藥材一起使用，在中醫(yī)臨床上用于治療癌癥，對(duì)肺癌、淋巴癌、甲狀腺瘤、乳腺腫瘤等疾病已顯示出較好的治療效果。如中國(guó)專利ZL200810195060. 8公開了ー種抗肺癌A549細(xì)胞增殖的中藥提取物，它是由原料藥貓爪草、金蕎麥、魚腥草、仙鶴草、冬瓜子、山茨燕、蘇木、紅花、法半夏、膽南星、沙參、玉竹、麥冬按ー定重量配比制成；其制法是首先將上述13味原料藥加水煎煮，過濾收集提取液，濃縮得全方提取液I ;然后取提取液I用石油醚萃取，得精制提取液II ;最后將精制提取液II經(jīng)大孔樹脂柱富集、蒸餾水洗脫后用こ醇洗脫，收集洗脫液濃縮至IOg生藥/ml，即得中藥提取物，經(jīng)藥效學(xué)試驗(yàn)結(jié)果表明該中藥提取物對(duì)肺癌A549細(xì)胞的増殖有顯著的抑制作用。其僅是針對(duì)13味藥材復(fù)配對(duì)抑制肺癌A549細(xì)胞的増殖的作用的研究，沒有涉及單味貓爪草的藥理研究。目前，有關(guān)貓爪草的化學(xué)成分的研究報(bào)道不多，已有的研究資料表明，貓爪草主要含氨基酸、有機(jī)酸及糖類。近十年來(lái)，國(guó)內(nèi)許多學(xué)者對(duì)貓爪草脂溶性成分進(jìn)行了較深入的研究，分離到包括酯類、脂肪酸、留醇及苷類等的十多種單體成分。但單味貓爪草已有的藥理作用研究資料主要集中在抗結(jié)核菌及其它菌方面。有關(guān)單味貓爪草抗腫瘤方面的研究資料并不多，至今尚未見貓爪草有效成分抗肺癌作用的報(bào)道。貓爪草的藥用歷史較短，雖然近年來(lái)由干與其它多味中藥材復(fù)配具有較好的抗腫瘤活性倍受人們關(guān)注，但仍存在不少問題(I)貓爪草資源廣泛，但開發(fā)利用度不夠，制劑生產(chǎn)未成規(guī)模；(2)貓爪草的有效成分不明確，活性部位也不明確，故應(yīng)針對(duì)貓爪草藥理作用著重進(jìn)行其有效部位及有效成分的篩選，以期為貓爪草的進(jìn)ー步開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種貓爪草提取物在制備抗肺癌藥物中的應(yīng)用。該提取物的主要成份為總皂苷。一種貓爪草提取物在制備抗肺癌的藥物中的應(yīng)用。所述的抗肺癌的藥物包括用于 預(yù)防和/或治療肺癌的藥物。所述的貓爪草提取物中含總皂苷以人參皂苷Rgl計(jì)，重量百分含量為20% 80%。所述的貓爪草提取物的制備方法，包括將干燥的貓爪草粉碎，用乙醇水溶液加熱回流提取，醇提液回收こ醇后用石油醚萃取，水層以水飽和的正丁醇萃取，正丁醇萃取液再用氫氧化鈉水溶液萃取，正丁醇層濃縮至浸膏，干燥至無(wú)溶劑殘留，得貓爪草提取物。為了更好的提取貓爪草中的人參皂苷Rgl等皂苷及其它抗癌成分，優(yōu)選所述的こ醇水溶液中こ醇的體積百分濃度為50 % 95 %，進(jìn)ー步優(yōu)選こ醇的體積百分濃度為95%。用こ醇水溶液加熱回流提取的次數(shù)為至少3次，毎次こ醇水溶液的用量為貓爪草重量的4倍量 10倍量(進(jìn)ー步優(yōu)選為5倍量 8倍量)，每次提取時(shí)間為I小吋 4小時(shí)。石油醚萃取的條件為在50°C 100°C至少萃取3次，每次萃取時(shí)間為I小吋 4小吋。以水飽和的正丁醇萃取的次數(shù)為4次 8次。所述的氫氧化鈉水溶液的濃度為0. lmol/L lmol/L。用氫氧化鈉水溶液萃取的次數(shù)為2次 5次。所述的貓爪草提取物可制成片劑、膠囊劑、顆粒劑、ロ服液等中的任何ー種劑型。上述各種劑型的藥物均可以按照藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)方法制備。本發(fā)明制備貓爪草提取物，方法簡(jiǎn)單、成本低廉。實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明的貓爪草提取物能夠有效地抑制人肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，如人肺腺癌細(xì)胞A549、人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞NCI-H460等，對(duì)正常細(xì)胞毒性低，高效低毒，可用于制備治療抗肺癌藥物的用途。因此本發(fā)明所提供的貓爪草提取物對(duì)制備抗肺癌藥物具有重要意義。


圖I為RPMI1640培養(yǎng)液(陰性對(duì)照)對(duì)人肺腺癌細(xì)胞A549細(xì)胞體外增殖的影響的顯微鏡下圖片；圖2為100 ii g/ml貓爪草提取物對(duì)人肺腺癌細(xì)胞A549細(xì)胞體外增殖的影響的顯微鏡下圖片；圖3為RPMI1640培養(yǎng)液(陰性對(duì)照)對(duì)人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞NCI-H460細(xì)胞體外增殖的影響的顯微鏡下圖片；圖4為100 ii g/ml貓爪草提取物對(duì)人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞NCI-H460細(xì)胞體外增殖的影響的顯微鏡下圖片；圖5為RPMI1640培養(yǎng)液(陰性對(duì)照)對(duì)人肺腺癌細(xì)胞A549細(xì)胞凋亡的影響圖片;圖6為50 ii g/ml貓爪草提取物對(duì)人肺腺癌細(xì)胞A549細(xì)胞凋亡的影響圖片；
圖7為RPMI1640培養(yǎng)液(陰性對(duì)照)對(duì)人肺腺癌細(xì)胞A549細(xì)胞周期的影響圖片(橫坐標(biāo)代表DNA含量，縱坐標(biāo)代表計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)，C代表GcZG1期細(xì)胞數(shù)量，D代表G2/M期細(xì)胞數(shù)量，E代表S期細(xì)胞數(shù)量)；圖8為50 ii g/ml貓爪草提取物對(duì)人肺腺癌細(xì)胞A549細(xì)胞周期的影響圖片(橫坐標(biāo)代表DNA含量，縱坐標(biāo)代表計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)，C代表GcZG1期細(xì)胞數(shù)量，D代表G2/M期細(xì)胞數(shù)量，E代表S期細(xì)胞數(shù)量)。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說明，均為常規(guī)方法。水飽和的正丁醇將正丁醇和蒸餾水混合(混合比例為I : 1，體積比)，振搖，混勻，放置過夜(或利用超聲，超聲時(shí)間為lOmin，這樣不必過夜)。得到的混合液分層，上層為水飽和的正丁醇，下層為正丁醇的飽和水溶液。實(shí)施例I、貓爪草提取物的制備精密稱取干燥的貓爪草5000g，粉碎成粗顆粒(粒徑200目)，用體積百分濃度為95%こ醇水溶液加熱回流提取4次，每次こ醇水溶液的用量為貓爪草重量的8倍量，每次提取2h，濾過，醇提液回收こ醇后得到提取物，提取物加溫水至Ig生藥/ml，加入石油醚在50°C萃取4次，毎次石油醚的體積與加溫水后提取物的體積比為I : 1，每次萃取4小吋，石油醚萃取液回收石油醚，得石油醚提取物。剰余水層用水飽和的正丁醇萃取5次，正丁醇萃取液用0. lmol/L NaOH水溶液萃取2次，正丁醇層濃縮至浸膏，置真空干燥箱干燥至無(wú)溶劑殘留，得貓爪草提取物。該貓爪草提取物含總皂苷以人參皂苷Rgl計(jì)，重量百分含量在80%。實(shí)施例2、3H_TdR摻入法觀察貓爪草提取物對(duì)A549、NCI-H460細(xì)胞增殖的影響I、實(shí)驗(yàn)材料(I) RPMI1640培養(yǎng)液250ml/瓶，吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)20110720。(2)0. 25% (質(zhì)量百分比)胰蛋白酶(Trypsin):含0.02% (質(zhì)量百分比)こニ胺四こ酸(EDTA)，IOOml/瓶，吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)11090901。(3)超級(jí)新生牛血清(即胎牛血清，F(xiàn)CS) :200ml/瓶，杭州四季青生物工程材料有限公司生產(chǎn)，批號(hào)080304。
(4)氚-胸腺嘧啶核苷(3H-TdR):中國(guó)科學(xué)院上海應(yīng)用物理研究所生產(chǎn)，濃度lmci/ml,比度 4ci/mM,批號(hào) 100430,使用前用 Hank' s 液配成 20 u ci/ml。(5)96孔平底培養(yǎng)板美國(guó)Costar公司生產(chǎn)；(6)A549細(xì)胞株(人肺腺癌細(xì)胞)浙江省腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所提供，液氮保存。NCI-H460細(xì)胞株(人大細(xì)胞肺癌)浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物所提供，液氮保存。2、實(shí)驗(yàn)儀器(I) ニ氧化碳培養(yǎng)箱3165型,美國(guó)Forma公司生產(chǎn)。(2)液閃儀2050型，PACKARD公司生產(chǎn)。
(3)XS-24細(xì)胞收集儀浙江紹興坡壙醫(yī)療器械廠生產(chǎn)。(4)GS_6R 離心機(jī)Beckman 公司生產(chǎn)。(5)HR40-II-A2醫(yī)用凈化工作臺(tái)A2型，30%外排，70循環(huán)，青島海爾特種電器有
限公司生產(chǎn)。(6)BS210S 電子天平Sartorius 公司生產(chǎn)。(7) CK40-F200倒置顯微鏡日本OLYMPUS公司生產(chǎn)。(8)YXQ-208SD電熱蒸汽滅菌器嘉興市中新醫(yī)療儀器有限公司生產(chǎn)。3、實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果取2種對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期人肺癌細(xì)胞株(A549、NCI-H460)，按腫瘤藥敏試驗(yàn)方法制成5X IO4個(gè)細(xì)胞/ml濃度單細(xì)胞懸液(貼壁細(xì)胞株用質(zhì)量百分比0. 1%胰蛋白酶消化后配置)，取IOOiU分別加至96孔平底培養(yǎng)板中，37°C、5% (體積分?jǐn)?shù))CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h后分別加入不同濃度(6. 25 200 u g/ml)的實(shí)施例I中的貓爪草提取物100 yl (溶劑為含10% FCS的RPMI1640培養(yǎng)液)，每ー藥物濃度做3個(gè)復(fù)孔，同時(shí)作含10% (質(zhì)量百分比)FCS (胎牛血清)的培養(yǎng)液對(duì)照，37°C、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h后分別加入含0. 3 u Ci3H-TdR的培養(yǎng)液50 u 1，繼續(xù)培養(yǎng)16h，常規(guī)收集細(xì)胞，測(cè)定每個(gè)樣品毎分鐘脈沖數(shù)(cpm)，用三孔的平均cpm計(jì)算出不同濃度貓爪草提取物對(duì)2種人肺癌細(xì)胞株的抑制率。按下列公式計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率=(I-實(shí)驗(yàn)組平均cpm值/對(duì)照組平均cpm值)X 100%。結(jié)果見表I 表2和圖I 圖4。表I :貓爪草提取物對(duì)A549細(xì)胞體外增殖的抑制率)
組另1j濃度((ig/ml)抑制率(％)
6.252.5 ±0.3
12.53.9+ 1.5^ ^^2513.0 ±0.6
貓爪草提取物--
_50__41.9 ±0.8_
10067.5 + 1.0
_[200I:99.3 ±0.3表2 :貓爪草提取物對(duì)NCI-H460細(xì)胞體外增殖的抑制率)
權(quán)利要求
1.一種貓爪草提取物的應(yīng)用，其特征在于，所述的貓爪草提取物在制備抗肺癌的藥物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的抗肺癌的藥物包括用于預(yù)防和/或治療肺癌的藥物。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的貓爪草提取物中人參皂苷Rgl的重量百分含量為20% 80%。
4.根據(jù)權(quán)利要求I或3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的貓爪草提取物的制備方法，包括 將干燥的貓爪草粉碎，用乙醇水溶液加熱回流提取，醇提液回收乙醇后用石油醚萃取，水層以水飽和的正丁醇萃取，正丁醇萃取液再用氫氧化鈉水溶液萃取，正丁醇層濃縮至浸膏，干燥至無(wú)溶劑殘留，得貓爪草提取物。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的乙醇水溶液的體積百分濃度為50% 95%。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，用乙醇水溶液加熱回流提取的次數(shù)為至少3次，每次乙醇水溶液的用量為貓爪草重量的4倍量 10倍量，每次提取時(shí)間為I小時(shí) 4小時(shí)。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，石油醚萃取的條件為在50°C 100°C至少萃取3次,每次萃取時(shí)間為I小時(shí) 4小時(shí)。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，以水飽和的正丁醇萃取的次數(shù)為4次 8次。
9.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的氫氧化鈉水溶液的濃度為O.Imol/L lmol/L0
10.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，用氫氧化鈉水溶液萃取的次數(shù)為2次 5次。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種貓爪草提取物在制備抗肺癌的藥物中的應(yīng)用，所述的抗肺癌藥物包括用于預(yù)防和/或治療肺癌的藥物。本發(fā)明證實(shí)貓爪草提取物具有較好的抗肺癌作用，能夠有效地抑制人肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，如人肺腺癌細(xì)胞A549、人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞NCI-H460等，對(duì)正常細(xì)胞毒性低，高效低毒，可用于制備治療抗肺癌藥物的用途。
文檔編號(hào)A61K36/71GK102805768SQ20121029997
公開日2012年12月5日 申請(qǐng)日期2012年8月22日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月22日
發(fā)明者童曄玲, 楊鋒, 戴關(guān)海, 任澤明 申請(qǐng)人:浙江省中醫(yī)藥研究院