專利名稱：siRNA綴合物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種綴合物、制備該綴合物的方法以及利用該綴合物傳遞SiRNA的方法，其中，在癌癥和其它傳染性疾病的基因療法中用于促進(jìn)siRNA傳遞的聚合物通過可降解鍵(degradable bond)或不可降解鍵綴合到siRNA。
背景技術(shù)：
RNA干擾是指這樣一種機(jī)制，其為在基因表達(dá)過程中，雙鏈RNA(dsRNA)通過核苷酸序列特異性方式啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄后沉默，并且這種機(jī)制首先在線蟲(C.elegans)中被發(fā)現(xiàn)，并常見于植物、果蜆和脊椎動(dòng)物(Fire等，自然(Nature), 391:806-811, 1998 ； ；Novina&Sharp,自然(Nature) ,430:161-164，2004)。已知以如下方式發(fā)生RNA干擾進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)的19 25bp的dsRNA與RISC(RNA-誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物)結(jié)合，且僅反義(向?qū)?鏈與mRNA結(jié)合而與mRNA的核苷酸序列互補(bǔ)，從而通過存在于RISC的核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域降解IE mRNA(Rana, T. M. , Nat. Rev. Mo I. Cell Biol. , 8:23-36, 2007 ；Tomari, Y.和 Zamore, P.D., Genes Dev. , 19:517-529，2005)。當(dāng)dsRNA被傳遞到細(xì)胞中，它特異性地結(jié)合靶基因序列以降解mRNA，因此，它被認(rèn)為是一種可調(diào)控基因表達(dá)的新型工具。然而，對于人類來說，由于向人體細(xì)胞引入dsRNA會(huì)誘導(dǎo)抗病毒干擾素途徑，因此難以獲得RNAi效果。在2001年，Elbashir和Tuschl等發(fā)現(xiàn)向人體細(xì)胞導(dǎo)入21nt長度(核苷酸長度)的小dsRNA不會(huì)引起干擾素途徑，但特異性地降解革巴 mRNA (Elbashir, S. M. , Harborth, J.，Lendeckel, ff. , Yalcin, A. , Weber, K. , Tuschl,Τ·，自然(Nature)，411，494-498，2001 ； ；Elbashir, S. Μ.，Lendeckel, ff.，Tuschl, T.，基因(Genes) &Dev. , 15, 188-200，2001 ； ；Elbashir, S. M. , Martinez, J. , Patkaniowska, A. , Lendeckel, ff.，Tuschl, T.，EMBO J.，20，6877-6888，2001)。因此，21nt 長度的 dsRNA 已經(jīng)作為一種新型的功能基因組工具引起了公眾的注意，并命名為小干擾RNA(siRNA)。自從siRNA被報(bào)道在動(dòng)物細(xì)胞中抑制特定基因表達(dá)上具有極好的效果，siRNA作為一種基因治療的藥物引起了廣泛關(guān)注。實(shí)際上，由于它的高活性和精確的基因選擇性，根據(jù)20年的研究結(jié)果，siRNA有望成為一種目前用作治療藥物的反義寡核苷酸(ODN)的替代治療藥物(Dana J. Gary等，控釋雜志(Journal of ControlledRelease) 121:64-73，2007)。用于治療的siRNA技術(shù)具有顯著的優(yōu)勢，與其它藥物相比，它易于設(shè)計(jì)并具有高目標(biāo)選擇性和抑制特定基因表達(dá)的性能。此外，由于RNA干擾利用生命系統(tǒng)中天然存在的機(jī)制抑制基因表達(dá)，所以它毒性較低。目前0ΡΚ0 Inc.開發(fā)的濕性老年黃斑變性病的治療藥物“貝伐西尼(Bevasiranib) ”為一種siRNA，其可選擇性地作用于血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)，誘導(dǎo)新血管形成以抑制VEGF的表達(dá)，并通過了三期臨床試驗(yàn)(Dejneka NS等，Mol Vis.，28 (14) : 997-1005，2008)。此外，目前正在研發(fā)含有革巴向多種基因的 siRNA 的治療藥物(Ryan P. Million, Nature Reviews Drug Discovery7:115-116，2008)。盡管各種結(jié)果表明體內(nèi)通過RNA干擾誘導(dǎo)特異性的表達(dá)抑制，但siRNA在體內(nèi)的傳遞還有許多問題需要解決，如在血液中被酶降解、與血液中組分的相互作用以及非特異性地傳遞給細(xì)胞(Shigeru Kawakami 和 Mitsuru Hashida, Drug Metab. Pharmacokinet. 22
(3): 142-151，2007)。正在通過部分地利用抗核酸酶的核苷酸類似物或改良傳遞技術(shù)，嘗試克服這些問題。改良的傳遞技術(shù)的實(shí)例包括利用病毒如腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒等的基因傳遞技術(shù)，以及利用脂質(zhì)體、陽離子脂質(zhì)和陽離子聚合物的非病毒載體的基因傳遞技術(shù)。然而，由于傳遞的基因有可能整合到宿主的染色體中，從而誘導(dǎo)宿主基因的正常功能發(fā)生異常并激活致癌基因，因此病毒載體存在安全性方面的問題，此外，即使以較小的量連續(xù)表達(dá)病毒基因也可能引起自身免疫性疾病，或在由病毒載體誘導(dǎo)的修飾的病毒感染情況下，可能不會(huì)引起有效的保護(hù)性免疫。同時(shí)，非病毒載體的有效性低于病毒載體，但考慮到體內(nèi)安全性和經(jīng)濟(jì)可行性，其具有副作用低和生產(chǎn)成本低的優(yōu)勢(Lehrman S.，自然(Nature). 401 (6753) : 517-518，1999)。此外，非病毒傳遞方法要求有效地保護(hù)酶或非酶的降解，以便傳遞包括siRNA的RNA分子，其中一種方法為利用編碼短發(fā)夾RNA (shRNA)的DNA表達(dá)質(zhì)粒。通過DNA的系統(tǒng)的優(yōu)勢在于，僅當(dāng)表達(dá)載體存在時(shí)進(jìn)行siRNA表達(dá)。此外，目前siRNA化學(xué)修飾的研究提出一種用于改良針對核酸酶的穩(wěn)定性以及低胞內(nèi)攝取的方法(Shigery Kawakami和MitsuruHashida. Drug Metab. Parmacokinet. 22(3):142-151，2007)。
在一種siRNA的化學(xué)修飾中，作為被核酸酶降解部位的磷酸二酯鍵用硫代磷酸連接進(jìn)行修飾，或戊糖的2’位被2’ -0-meRNA、2’ -脫氧-2’ -氟尿嘧啶核苷或通過2’位和4’位連接形成的鎖核酸(LNA)修飾,結(jié)果提高了血清中的穩(wěn)定性((Braasch D. A.等,Bioorg.Med. Chem. Lett. 14:1139-1143，2003 ； ；Chiu Y. L.和 Rana T. Μ.，RNA, 9:1034-1048，2003 ；；Amarzguioui Μ.等,Nucleic Acid Res. 31:589-595，2003)。在另一種化學(xué)修飾中，官能團(tuán)連接到正義(反向?qū)?鏈的3’端區(qū)域，結(jié)果與對照相比，藥動(dòng)力學(xué)特性得到了改良，體內(nèi)通過siRNA的親水性和疏水性的平衡在施用時(shí)誘導(dǎo)出較高的效率(Soutschek J.等，Nature432:173-1782004)。然而，上述方法在保護(hù)SiRNA免于核酸酶的消化以及改良細(xì)胞膜透性效率上仍然有許多有待改進(jìn)之處?；谶@一原因，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了一種綴合物，其中親水性或疏水性聚合物通過可降解或不可降解鍵綴合到SiRNA，改良了 siRNA的體內(nèi)穩(wěn)定性，并基于此完成了本發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種綴合物，其中作為生物相容性聚合物的親水性或疏水性聚合物通過可降解或不可降解鍵綴合到siRNA的正義鏈或反義鏈的末端，以提高siRNA在細(xì)胞內(nèi)傳遞的效率。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種含有聚合物的固相支持物，具體地，施用到人體時(shí)穩(wěn)定性得到證實(shí)的聚合物，例如聚乙二醇(PEG)，以及提供一種有效地制備包括RNA、DNA,RNA-DNA嵌合體及其類似物的寡核苷酸的方法，其中，通過支持物將PEG結(jié)合到它的3’端。本發(fā)明又一目的在于提供制備siRNA綴合物的方法，以及利用siRNA綴合物傳遞siRNA的方法。技術(shù)方案為實(shí)現(xiàn)上述的目的，首先，本發(fā)明提供一種siRNA-聚合物綴合物，其結(jié)構(gòu)如下A-X-R-Y-B(其中，A和B獨(dú)立地為親水性聚合物或疏水性聚合物；X和Y獨(dú)立地為簡單的共價(jià)鍵或接頭介導(dǎo)的(linker-mediated)共價(jià)鍵；且R為siRNA)。其次，本發(fā)明提供一種siRNA-聚合物綴合物，其結(jié)構(gòu)如下A-X-R(其中，A為疏水性聚合物；X為簡單的共價(jià)鍵或接頭介導(dǎo)的共價(jià)鍵；R為siRNA)第三，本發(fā)明提供一種綴合物，其中SiRNA(R)的單鏈含有19 31個(gè)核苷酸。第四，本發(fā)明提供一種綴合物，其中疏水性聚合物(A)的分子量為25(Tl，000。第五，本發(fā)明提供一種綴合物，其中疏水性聚合物㈧為ClfTC5tl烴或膽固醇。第六，本發(fā)明提供一種綴合物，其中共價(jià)鍵(Χ，Υ)為不可降解鍵或可降解鍵。第七，本發(fā)明提供一種綴合物，其中不可降解鍵為酰胺鍵或磷酸鍵。第八，本發(fā)明提供一種綴合物，其中可降解鍵選自二硫鍵、酸裂解鍵、酯鍵、酸酐鍵、生物降解鍵和酶裂解鍵。第九，本發(fā)明提供一種綴合物，其中親水性聚合物(Α或B)為分子量為1，000^10, 000的非離子聚合物。第十，本發(fā)明提供一種綴合物，其中親水性聚合物選自下組聚乙二醇(PEG)、聚乙烯吡咯烷酮和聚噁唑啉。第十一，本發(fā)明提供一種結(jié)合聚乙二醇的固相支持物，其結(jié)構(gòu)如下
權(quán)利要求
1.存活素特異性SiRNA和聚合物的綴合物，其結(jié)構(gòu)如下A-X-R-Y-B 其中，A和B之一為親水性聚合物且其另一為疏水性聚合物；X和Y各自獨(dú)立地為簡單的共價(jià)鍵或接頭介導(dǎo)的共價(jià)鍵；且R為存活素特異性siRNA。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的綴合物，其中所述存活素特異性siRNA(R)的單鏈由19-31個(gè)核苷酸組成。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的綴合物，其中所述存活素特異性siRNA(R)的單鏈為核苷酸序列 SEQ ID No. Γ4 之一。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的綴合物，其中所述存活素特異性SiRNA(R)具有化學(xué)修飾。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的綴合物，其中所述化學(xué)修飾包括至少下述之一 將磷酸二酯鍵修飾為硫代磷酸酯連接； 將戊糖2’ -位上的-OH修飾為2’ -OCH3或2’ -脫氧-2’氟尿嘧啶核苷；和 通過連接戊糖的2’ -位和4’ -位而將戊糖2’ -位上的-OH修飾為鎖核酸型式。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的綴合物，其中所述疏水性聚合物的分子量為25(Tl，000;所述親水性聚合物為分子量為1，00(Γ10，000的非離子聚合物；且所述共價(jià)鍵為不可降解鍵或可降解鍵。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的綴合物，其中所述疏水性聚合物為ClfTC5tl飽和烴或膽固醇。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的綴合物，其中所述不可降解鍵為酰胺鍵或磷酸鍵；且所述可降解鍵選自二硫鍵、酸裂解鍵、酯鍵、酸酐鍵、生物降解鍵和酶裂解鍵。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的綴合物，其中所述親水性聚合物包括至少下述之一聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮和聚噁唑啉。
10.一種納米微粒，其包含權(quán)利要求I所述的綴合物。
11.一種組合物，其包含權(quán)利要求I所述的綴合物作為藥物有效成分。
12.—種組合物，其包含權(quán)利要求10所述的納米微粒作為藥物有效成分。
全文摘要
本發(fā)明提供一種siRNA-聚合物綴合物及其制備方法，更具體地，涉及一種通過siRNA和用于提高siRNA生物穩(wěn)定性的聚合物的共價(jià)結(jié)合而形成的雜合綴合物，以及制備該雜合綴合物的方法。本發(fā)明的綴合物能提高siRNA的生物穩(wěn)定性，從而實(shí)現(xiàn)治療性siRNA向細(xì)胞的有效傳遞，且即使相對低濃度的小劑量也具有siRNA的活性。因此，該綴合物不僅可有利地用作癌癥和其它傳染性疾病的siRNA治療工具，也可用作一種新型的siRNA傳遞系統(tǒng)。
文檔編號A61P35/00GK102888404SQ20121030155
公開日2013年1月23日 申請日期2010年5月13日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月14日
發(fā)明者韓寶藍(lán), 樸翰浯, 申美湜, 李三用 申請人:株式會(huì)社百奧尼