專(zhuān)利名稱(chēng)：一種新型促進(jìn)骨生長(zhǎng)發(fā)育、靶向骨發(fā)育異常的雙功能酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明發(fā)明涉及ー種新型的促進(jìn)骨生長(zhǎng)發(fā)育、靶向骨發(fā)育異常的雙功能酶IREla (inositol requiring enzyme I a ),此發(fā)明屬于醫(yī)藥衛(wèi)生領(lǐng)域,可以直接應(yīng)用于骨外科或創(chuàng)傷修復(fù)等臨床和基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。
人類(lèi)肌醇需酶IREl a由ERNl基因編碼、位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)上的跨膜蛋白，是ー種同時(shí)具有絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性和核糖核酸內(nèi)切酶活性的雙功能酶。細(xì)胞處于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(Endoplasmic reticulum stress , ERS)時(shí),可誘導(dǎo)IREl a的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔的結(jié)構(gòu)域發(fā)生ニ聚化，激活胞質(zhì)的蛋白激酶域(Kinase domain),進(jìn)而發(fā)生自身磷酸化作用，進(jìn)ー步激活特定位點(diǎn)羧基末端具有核糖核酸內(nèi)切酶活性的RNase結(jié)構(gòu)域，從而剪切ー種重要的轉(zhuǎn)錄因子X(jué)BPl。這種非經(jīng)典的mRNA剪接方式會(huì)引起未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response,UPR)的轉(zhuǎn)錄過(guò)程，該過(guò)程可以緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激壓力。ERS介導(dǎo)的未折疊蛋白反應(yīng)直接指導(dǎo)和參與ERS狀態(tài)下內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中異常蛋白質(zhì)的降解和再折疊，維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞的保護(hù)。其中IREl a-XBPl是決定細(xì)胞最終命運(yùn)的關(guān)鍵通路，也是促進(jìn)細(xì)胞分化的關(guān)鍵途徑。我們首先在軟骨細(xì)胞分化的不同時(shí)相檢測(cè)了 IREla的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，同時(shí)運(yùn)用免疫組織化學(xué)技術(shù)在不同胎齡小鼠骨生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)了 IREla的表達(dá)，我們發(fā)現(xiàn)IREl a在軟骨細(xì)胞分化各個(gè)時(shí)期均有表達(dá)。同時(shí)，我們構(gòu)建IREl a的腺病毒載體Ad-IREl a，分別處理微團(tuán)培養(yǎng)的ATDC5和C3H10T1/2細(xì)胞，利用realtime PCR和免疫印跡等研究方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)IREl a在軟骨細(xì)胞中可以明顯上調(diào)軟骨細(xì)胞分化各標(biāo)志基因Colli、ColX及COMP的表達(dá)；而運(yùn)用RNAi技術(shù)抑制IREl a的表達(dá)可以顯著抑制BMP2誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞分化，因此，IREla是ー種可以促進(jìn)軟骨細(xì)胞分化的雙功能酶。這ー發(fā)明可以直接應(yīng)用于骨外科或創(chuàng)傷修復(fù)等臨床和基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，有助于探索與解析軟骨發(fā)育新的調(diào)控機(jī)制、為開(kāi)發(fā)參與軟骨生成與修復(fù)的生物制劑和藥品提供靶分子。
背景技術(shù)：
目前，臨床使用的大多數(shù)藥物治療不能有效促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨缺損的愈合；自體軟骨來(lái)源又非常有限，軟骨移植手術(shù)也相應(yīng)受到限制。因此，研發(fā)促進(jìn)軟骨修復(fù)的生物制劑是非常有意義的。我們?cè)谇捌谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)IREl a可以誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞的分化，促進(jìn)軟骨生長(zhǎng)和發(fā)育。
相關(guān)背景技術(shù)如下
首先，進(jìn)入互聯(lián)網(wǎng)美國(guó)國(guó)家圖書(shū)館網(wǎng)站http://www. ncbi. nlm. nih. gov,根據(jù)GenBank提供的IREl a基因序列IREla (NM_001433. 3)，用引物設(shè)計(jì)軟件NTI vector設(shè)計(jì)引物，上游引物加入通W I酶切位點(diǎn)，下游引物加入沿/^III酶切位點(diǎn)，目的基因擴(kuò)增長(zhǎng)度2934bp，構(gòu)建IREla腺病毒載體Ad-IREl a。同樣的方法設(shè)計(jì)內(nèi)參GAPDH引物，擴(kuò)增長(zhǎng)度542bp。酶切電泳與測(cè)序結(jié)果顯示構(gòu)建正確，免疫印跡檢測(cè)所構(gòu)建病毒可以正確表達(dá)。其次，我們運(yùn)用不同類(lèi)型干細(xì)胞(C3H10T1/2，ATDC5)的體外微團(tuán)培養(yǎng)，在軟骨細(xì)胞分化的不同時(shí)期，采用real-time PCR及免疫應(yīng)跡等方法檢測(cè)了 IREl a的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)；同時(shí)運(yùn)用免疫組織化學(xué)技術(shù)在不同胎齡小鼠骨生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)了 IREla的表達(dá)，我們發(fā)現(xiàn)IREl a在軟骨細(xì)胞分化的各個(gè)時(shí)期均有表達(dá)，尤其是增殖期和肥大期，并且隨著軟骨發(fā)育的不斷成熟，IREl a表達(dá)逐漸増加，在新生小鼠軟骨發(fā)育的肥大期IREl a表達(dá)達(dá)到峰值。 第三，構(gòu)建si-IREl a腺病毒載體，與前面構(gòu)建好的IREl a腺病毒載體Ad-IREl a分別轉(zhuǎn)染干細(xì)胞C3H10T1/2和ATDC5，結(jié)合干細(xì)胞微團(tuán)培養(yǎng)、小鼠趾骨體外誘導(dǎo)培養(yǎng)等方法，檢測(cè)IREla與軟骨細(xì)胞分化的關(guān)系，結(jié)果顯示，IREl a參與誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞的分化，通過(guò)上調(diào)軟骨細(xì)胞肥大期標(biāo)志基因X型膠原(Collagen type X，ColX, Alp)的表達(dá)，促進(jìn)軟骨細(xì)胞的分化。總之，真核細(xì)胞中IREl a具有調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)、増殖、分化或者凋亡的能力，是決定細(xì)胞最終命運(yùn)的調(diào)節(jié)器。我們進(jìn)一歩通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，IREl a可以促進(jìn)和誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞的分化，促進(jìn)骨質(zhì)增長(zhǎng)，修復(fù)受損的關(guān)節(jié)，増加骨關(guān)節(jié)腔中軟骨的密度，從而促進(jìn)形成關(guān)節(jié)軟骨組織，達(dá)到預(yù)防和治療關(guān)節(jié)炎的作用。

發(fā)明內(nèi)容
IREla (inositol-requiring enzyme I a )可以促進(jìn)軟骨細(xì)胞的分化與軟骨生長(zhǎng)發(fā)育，促進(jìn)骨質(zhì)增長(zhǎng)，靶向修復(fù)受損的軟骨、増加骨關(guān)節(jié)腔中軟骨的密度。我們申請(qǐng)對(duì)IREl a上述特定的功能進(jìn)行專(zhuān)利保護(hù)。根據(jù)中華人民共和國(guó)國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局發(fā)布的“專(zhuān)利審查指南(2010)”第三部分“進(jìn)入國(guó)家階段的國(guó)際申請(qǐng)的審查”部分的規(guī)定(P302):如果在申請(qǐng)的發(fā)明中，某蛋白質(zhì)已知而其氨基酸序列是未知的，那么只要本領(lǐng)域技術(shù)人員在該申請(qǐng)?zhí)峤粫r(shí)可以容易地確定其氨基酸序列，編碼該蛋白質(zhì)的基因發(fā)明就不具有創(chuàng)造性。但是，如果該基因具有特定的堿基序列，而且與其他編碼所述蛋白質(zhì)的、具有不同堿基序列的基因相比，具有本領(lǐng)域技術(shù)人員預(yù)料不到的效果，則該基因的發(fā)明具有創(chuàng)造性。因此，我們認(rèn)定我們申請(qǐng)的關(guān)于“ー種新型促進(jìn)骨生長(zhǎng)發(fā)育、靶向骨發(fā)育異常的雙功能酶”發(fā)明專(zhuān)利是完全符合中華人民共和國(guó)國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局各項(xiàng)規(guī)定的，懇請(qǐng)國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局給予批準(zhǔn)與支持。
權(quán)利要求
1.人類(lèi)肌醇需酶IREla (inositol requiring enzyme I a )在制備促進(jìn)骨生長(zhǎng)發(fā)育、靶向骨發(fā)育異常藥物中的用途。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的用途，其特征在于所述IREla可以明顯上調(diào)骨生長(zhǎng)發(fā)育各標(biāo)志基因II型膠原、X型膠原及堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase)的表達(dá)、促進(jìn)軟骨細(xì)胞的肥大和礦化、明顯促進(jìn)軟骨內(nèi)骨化、軟骨修復(fù)及骨的生長(zhǎng)發(fā)育。
3.我們需要申請(qǐng)的權(quán)利要求如下我們發(fā)現(xiàn)的人類(lèi)肌醇需酶IREla具有促進(jìn)和誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞分化，促進(jìn)骨生長(zhǎng)發(fā)育的這一生物學(xué)功能與用途具有創(chuàng)造性和創(chuàng)新性，屬于我們的獨(dú)創(chuàng)性工作，在此申請(qǐng)專(zhuān)利保護(hù)。
全文摘要
人類(lèi)肌醇需酶IRE1α是一種同時(shí)具有絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性和核糖核酸內(nèi)切酶活性的雙功能酶。細(xì)胞處于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)，可誘導(dǎo)IRE1α內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔的結(jié)構(gòu)域發(fā)生二聚化，進(jìn)而激活胞質(zhì)的蛋白激酶域(Kinasedomain)和羧基末端具有核糖核酸內(nèi)切酶活性的RNase結(jié)構(gòu)域，這一過(guò)程可以緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激壓力，同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)IRE1α蛋白激酶域、RNase結(jié)構(gòu)域及全長(zhǎng)均可以上調(diào)軟骨分化相關(guān)靶基因ColII/ColX的表達(dá)誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞分化，促進(jìn)骨生長(zhǎng)發(fā)育和骨質(zhì)生長(zhǎng)，靶向修復(fù)受損關(guān)節(jié)，促進(jìn)軟骨內(nèi)骨生長(zhǎng)和軟骨修復(fù)，具有預(yù)防和治療關(guān)節(jié)炎的作用。IRE1α具有促進(jìn)骨生長(zhǎng)發(fā)育、修復(fù)受損骨關(guān)節(jié)的獨(dú)特生物學(xué)作用。
文檔編號(hào)A61K38/45GK102949711SQ20121030706
公開(kāi)日2013年3月6日 申請(qǐng)日期2012年8月27日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月27日
發(fā)明者郭風(fēng)勁 申請(qǐng)人:郭風(fēng)勁, 重慶醫(yī)科大學(xué)