鋸葉棕果實提取物在制備治療勃起功能障礙藥物中的用途
【專利摘要】本發(fā)明屬中藥領(lǐng)域，涉及鋸葉棕果實提取物在制備治療勃起功能障礙藥物中的用途。本發(fā)明的鋸葉棕果實提取物制成軟膠囊，通過連續(xù)一周對雄性大鼠和家兔灌胃給予鋸葉棕果實提取物軟膠囊制劑后，通過生物信號處理系統(tǒng)測定給予實驗動物電刺激之后的陰莖海綿體平滑肌放電幅度；實驗結(jié)果表明，所述鋸葉棕果實提取物軟膠囊通過抑制陰莖海綿體中PDE5活性，從而抑制cGMP的水解，提高cGMP濃度，從而使實驗動物電刺激后陰莖海綿體放電幅度呈劑量依賴性增強，上述作用及機制與西地那非藥物類似，本發(fā)明的鋸葉棕果實提取物軟膠囊制劑可作為治療勃起功能障礙的藥物，且有顯著的效果。
【專利說明】鋸葉棕果實提取物在制備治療勃起功能障礙藥物中的用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬中藥領(lǐng)域，涉及中藥鋸葉棕果實提取物的藥用用途，具體涉及鋸葉棕果實提取物在制備治療勃起功能障礙藥物中的用途。
[0002]【背景技術(shù)】:[0003]陰莖勃起功能障礙(Erectile Dysfunction, ED)又稱陽痿(Impotence),是指成年男性不具有足夠的勃起以完成全部性交過程；由于長期受封建意識的束縛，該病一直未引起人們足夠的重視。所述ED為發(fā)病率較高的疾病，不僅嚴重危害著成年男性的身心健康，也給社會發(fā)展產(chǎn)生重大影響。在國外，目前比較公認的數(shù)據(jù)是馬薩諸塞男性老齡化研究調(diào)查顯示:40~70歲男性的ED患病率是52.0±1.3%，其中輕、中、重度ED的患病率分別是17.2%,25.2%和9.6%，在有代謝障礙如心血管病患者和糖尿病患者間好發(fā)；在中國上海，通過調(diào)查1582名40歲以上的城市男子，發(fā)現(xiàn)ED患病率約為73%。有預測顯示，到2025年，全球ED患者將到達3億人口。
[0004]目前，普遍認為ED的發(fā)生與陰莖海綿體上的環(huán)磷酸鳥苷(cyclic guanosinemonophosphate, cGMP)的第二信使傳導系統(tǒng)所主導的陰莖海綿體平滑肌的收縮舒張障礙有關(guān)。所述特異性磷酸二酯酶5 (phosphodiesterase type5, PDE5)抑制劑西地那非(偉哥)、他達拉非是目前臨床上治療各型、各種病因ED的一線口服藥物；其通過選擇性抑制TOE5的活性而抑制cGMP的水解，從而促進并延長cGMP的激活時程，延長勃起的持續(xù)時間。然而，調(diào)查顯示約有309ffiD患者因?qū)OE5抑制劑無反應而停藥。
[0005]鋸葉棕果實提取物(saw palmatto extract, SPE)采用來源于美國矮鋸葉棕果實提取而成，其中含有多種復合物成分，通常被制成軟膠囊。所述鋸葉棕漿果是美國印第安人傳統(tǒng)的用與治療泌尿生殖系統(tǒng)疾病的藥物，用于緩解黏膜刺激癥狀、增加睪丸功能、或增加乳腺大小；早在19世紀就有醫(yī)學文獻報道其用于治療良性前列腺增生(benign prostatichyperplasia, BPH)及其導致的嚴重影響中老年男性生活質(zhì)量的下尿道癥狀包括尿頻、尿急、夜尿、尿不盡、尿流細等。目前，被普遍接受的兩種治療BPH的方法是5 a還原酶抑制劑和a腎上腺素受體阻斷劑，可單用或者合用；然而，上述治療方法往往會引起性功能障礙。有研究公開的有對照的對BPH病人的臨床試驗數(shù)據(jù)表明，SPE在改善最大尿流、較少夜尿方面與典型的治療BPH藥物非那雄胺相當；在許多歐洲國家，SPE是最常用的治療BPH相關(guān)的泌尿系統(tǒng)疾病處方草藥之一。同時研究還發(fā)現(xiàn)，SPE不良反應相對發(fā)生較少，且輕微，ED的發(fā)生率遠遠低于應用非那雄胺的BPH患者。Hotta等采用問卷形式對Permixon (鋸葉棕脂肪酸固醇提取物)，坦索羅辛(a -腎上腺素受體阻斷劑)及非那雄胺(5 a -還原酶抑制劑)治療BPH患者的性功能進行了評價，研究結(jié)果表明，相對于坦索羅辛和非那雄胺對性功能產(chǎn)生負面影響，Permixon對男性性行為的興趣、勃起的質(zhì)量、達到性高潮和射精等方面男性性功能無不良影響。
[0006]有關(guān)鋸葉棕果實提取物的作用機制尚不明確，研究推測其可能與抑制5 a還原酶活性、抗雄激素作用、調(diào)節(jié)雄、雌激素平衡、a受體阻斷效應、抑制前列腺組織生長因子活性、抗增殖效應以及抗炎作用等有關(guān)。迄今，尚未見有關(guān)鋸葉棕果實提取能治療ED的文獻報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是提供中藥鋸葉棕果實提取物新的藥用用途，具體涉及鋸葉棕果實提取物在制備治療勃起功能障礙藥物中的用途。軟膠囊的軟膠囊
[0008]本發(fā)明中，所述的中藥鋸葉棕果實提取物制成軟膠囊，可通過市購突進獲得。
[0009]本發(fā)明通過整體動物模型試驗證實所述的中藥鋸葉棕果實提取物(saw palmattoextract, SPE)軟膠囊具有很顯著的治療勃起功能障礙的作用；
[0010]本發(fā)明還采用連續(xù)循環(huán)定磷比色法測定動物陰莖海綿體組織中TOE5活性進一步分析所述中藥鋸葉棕果實提取物的軟膠囊治療勃起功能障礙的分子機制。
[0011]具體而言，本發(fā)明通過下述實驗進行驗證所述的鋸葉棕果實提取物(軟膠囊)具有很顯著的治療勃起功能障礙的作用:
[0012](I)鋸葉棕果實提取物軟膠囊連續(xù)灌胃一周后對大鼠陰莖海綿體電刺激后放電幅度的影響
[0013]SPE軟膠囊(購自德國泰德制藥廠)，實驗動物采用SD雄性大鼠40只，體重280-300g,(購自復旦大學醫(yī)學實驗動物中心)；
[0014]大鼠分為4組，分別是對照組、SPE低劑量組、SPE中劑量組和SPE高劑量組，SPE采用生理鹽水配制，每天灌胃給藥一次，給藥容量為lmL/100g體重，連續(xù)給藥7天；末次灌胃給藥24h后，大鼠陰莖背部兩側(cè)連入SMUP-E生物信號處理器(復旦大學上海醫(yī)學院生理與病理生理學系監(jiān)制)，給予方波脈沖電刺激，記錄給予電刺激后海綿體平滑肌的放電情況，
[0015]結(jié)果顯示，當電刺激時SD雄`性大鼠陰莖海綿體放電幅度相對于生理鹽水組的大鼠明顯增加，且呈劑量依賴性；表明SPE有效增加電刺激后大鼠陰莖海綿體壓力，對ED有良好的治療作用；
[0016](2)鋸葉棕果實提取物軟膠囊連續(xù)灌胃一周后對家兔陰莖海綿體電刺激后放電幅度的影響
[0017]SPE軟膠囊(購自德國泰德制藥廠)，
[0018]雄性新西蘭家兔30只，平均體重2.0 - 2.5kg，購自復旦大學醫(yī)學實驗動物中心；
[0019]家兔適應性飼養(yǎng)10天后開始實驗；將30只家兔隨機分為生理鹽水對照組，SPE軟膠囊低劑量組、中劑量組、高劑量組，每組6-7只；SPE采用生理鹽水配制，每天灌胃給藥一次，給藥容量為lmL/kg體重，連續(xù)給藥7天；末次灌胃給藥24h后測定電刺激后家兔海綿體放電幅度；
[0020]結(jié)果顯示，雄性家兔在連續(xù)7天給予SPE之后出現(xiàn)與上述大鼠實驗相似的結(jié)果，相對于生理鹽水組，給予不同劑量SPE的家兔陰莖海綿體放電幅度有明顯增加，呈劑量依賴關(guān)系，表明SPE可有效增加電刺激后家兔陰莖海綿體壓力，對ED有良好的治療作用；
[0021](3)鋸葉棕果實提取物軟膠囊連續(xù)灌胃一周后對大鼠和家兔陰莖海綿體磷酸二酯酶5活性的影響
[0022]在上述試驗I以及2中的大鼠及家兔陰莖海綿體放電測定結(jié)束后，常規(guī)分離出實驗動物陰莖海綿體組織樣本，以PBS溶液洗凈并稱重置于_70°C冰箱保存?zhèn)溆茫?br> [0023]實驗時，將實驗動物陰莖海綿體組織樣本置預冷的錐形離心管中，清洗后移入液氮凍存管，液氮罐過夜；第3日取出，碾碎組織成粉末狀，放入錐形離心管；粉末樣品中加入裂解液強力漩渦震蕩30s，之后放進冰槽孵育30min，反復強力渦旋震蕩后離心，移取上清液到新的無菌離心管，移取20iU用BCA方法進行蛋白定量，其余樣品置于-70°C保存；
[0024]采用GENMEDTOE5酶活性連續(xù)循環(huán)定磷比色法定量檢測試劑盒(GENMEDSCIENTIFICSINC.U.S.A，上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司代理)進行酶活性的測定；底物環(huán)核苷酸(cAMP或cGMP)，在TOE5敏感性抑制劑(MY-5445)存在的情況下，通過TOE5的催化作用，進行水解反應，產(chǎn)生1-磷酸鳥苷產(chǎn)物后，經(jīng)由5-核苷酸酶(5-nucleotidase，5_NT)作用，釋放出游離磷酸根，進而與孔雀綠染料發(fā)生顯色反應后，通過分光光度儀(660nm波長)測定其峰值的變化；吸光度值的大小和TOE5酶活性成正比；
[0025]首先測定標準曲線，然后進行樣品背景(不加酶促液和底物液)測定，獲得樣品非特異活性；
[0026]所述樣品總活性和非特異活性計算按下述公式:
[0027]{[根據(jù)標準曲線獲得樣品活性對應5-GMP濃度(y mol/L) 一根據(jù)標準曲線獲得樣品背景對應5-GMP濃度(ii mol/L) ]X樣品稀釋倍數(shù)} +30 (反應時間；min) =nmol5-GMP\ml\min+ 樣品蛋白濃度(mg\ml) =nmol5_GMP\mg\min ；
[0028]樣品特異活性計算按下述公式:
[0029]樣品特異活性=樣品總活性一樣品非特異活性；
[0030]結(jié)果顯示，經(jīng)灌胃給予不同劑量SPE的大鼠陰莖海綿體組織中TOE5活性相對生理鹽水組有顯著性的下降；經(jīng)灌胃給予不同劑量的SPE的家兔陰莖海綿體組織中TOE5活性也出現(xiàn)了相似的結(jié)果；實驗結(jié)果表明SPE能有效地抑制陰莖海綿體中TOE5的活性，從而抑制cGMP的水解，延長陰莖勃起的時程，對ED起到良好的治療作用。
[0031]上述實驗結(jié)果顯示，本發(fā)`明所述SPE軟膠囊通過抑制陰莖海綿體中TOE5活性，從而抑制cGMP的水解，提高cGMP濃度，從而使實驗動物電刺激后陰莖海綿體放電幅度呈劑量依賴性增強，上述作用及機制與西地那非類似，所述SPE軟膠囊對勃起功能障礙有顯著的治療效果。
[0032]為了便于理解，以下將通過【具體實施方式】對本發(fā)明進行詳細地描述。需要特別指出的是，這些描述僅僅是示例性的描述，并不構(gòu)成對本發(fā)明范圍的限制。依據(jù)本說明書的論述，本發(fā)明的許多變化、改變對所屬領(lǐng)域技術(shù)人員來說都是顯而易見的。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0033]圖1顯示了鋸葉棕果實提取物軟膠囊連續(xù)灌胃一周后對大鼠和家兔陰莖海綿體電刺激后放電幅度的影響(均數(shù)土標準誤，n=6-10)，
[0034]其中，
[0035]A:鋸葉棕果實提取物軟膠囊連續(xù)灌胃一周后對大鼠陰莖海綿體電刺激后放電幅度的影響；
[0036]B:鋸葉棕果實提取物軟膠囊連續(xù)灌胃一周后對家兔陰莖海綿體電刺激后放電幅度的影響；
[0037]與saline 組比較，*P〈0.05，**P〈0.01 ；
[0038]與SPE小劑量組比較，A AP<0.01 ；[0039]與SPE中劑量組比較，##P<0.01。
[0040]圖2顯示了鋸葉棕果實提取物軟膠囊連續(xù)灌胃一周后對大鼠和家兔陰莖海綿體磷酸二酯酶5活性的影響(均數(shù)土標準誤，n=4-7)，
[0041]其中，
[0042]A:鋸葉棕果實提取物軟膠囊連續(xù)灌胃一周后對大鼠陰莖海綿體磷酸二酯酶5活性的影響；
[0043]B:鋸葉棕果實提取物軟膠囊連續(xù)灌胃一周后對家兔陰莖海綿體磷酸二酯酶5活性的影響；
[0044]與saline 組比較，*P〈0.05，**P〈0.01 ； [0045]與SPE小劑量組比較，A AP<0.01 ；
[0046]與SPE中劑量組比較，##P<0.01。
【具體實施方式】
[0047]實施例1
[0048]SPE軟膠囊(購自德國泰德制藥廠)，
[0049]實驗動物采用SD雄性大鼠40只，體重280_300g，購自復旦大學醫(yī)學實驗動物中心；
[0050]大鼠飼養(yǎng)在12h明暗環(huán)境，室溫控制在22°C，自由進食飲水；適應性飼養(yǎng)10天后開始實驗；將40只SD雄性大鼠分為4組，每組10只，分別是對照組(生理鹽水)、SPE低劑量組(14.29mg/kg)、SPE 中劑量組(28.58mg/kg)和 SPE 高劑量組(57.16mg/kg)，SPE 采用生理鹽水配制，每天灌胃給藥一次，給藥容量為lmL/100g體重，連續(xù)給藥7天；末次灌胃給藥24h后，采用50mg/kg戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，將大鼠仰臥位固定，取兩根針狀電極插入大鼠陰莖背部兩側(cè)，連入SMUP-E生物信號處理器(復旦大學上海醫(yī)學院生理與病理生理學系監(jiān)制)，給予1.2V，頻率為30Hz，波寬為0.1ms的方波脈沖電刺激，每次持續(xù)30s ;向大鼠陰莖背部海綿體根部插入引導電極記錄給予海綿體神經(jīng)電刺激后海綿體平滑肌的放電情況；另取一根接地電極夾住皮膚。
[0051]結(jié)果如圖1A所示，SPE連續(xù)灌胃7天之后，當電刺激時SD雄性大鼠陰莖海綿體放電幅度相對于生理鹽水組的大鼠明顯增加，且呈劑量依賴性；表明SPE可有效增加電刺激后大鼠陰莖海綿體壓力，對ED有良好的治療作用。
[0052]實施例2
[0053]SPE軟膠囊(SPE)由德國泰德制藥廠提供。雄性新西蘭家兔30只，平均體重2.0 -
2.5kg，購自復旦大學醫(yī)學實驗動物中心；家兔飼養(yǎng)在12h明暗環(huán)境，室溫控制在22°C，自由進食飲水；適應性飼養(yǎng)10天后開始實驗；將30只家兔隨機分為生理鹽水對照組，SPE軟膠囊低劑量組(7.5mg/kg)、中劑量組(15mg/kg)、高劑量組(30mg/kg),每組6-7只；SPE采用生理鹽水配制，每天灌胃給藥一次，給藥容量為lmL/kg體重，連續(xù)給藥7天；末次灌胃給藥24h后測定電刺激后豕兔海綿體放電幅度。
[0054]結(jié)果如圖1B所示，雄性家兔在連續(xù)7天給予SPE之后也出現(xiàn)了與大鼠實驗相似的結(jié)果，相對于生理鹽水組，給予不同劑量SPE的家兔陰莖海綿體放電幅度有明顯增加，也呈劑量依賴關(guān)系，其中小劑量SPE已經(jīng)表現(xiàn)出使陰莖海綿體放電幅度增強的作用；表明SPE可有效增加電刺激后家兔陰莖海綿體壓力，對ED有良好的治療作用。
[0055]實施例3
[0056]在上述實施例1以及實施例2中，大鼠及家兔陰莖海綿體放電測定實驗結(jié)束后，迅速解剖、分離出陰莖海綿體組織，包括祛除皮膚、陰莖頭、尿道海綿體、筋膜等，以0.01mol/LPBS溶液沖洗凈血液并稱重后迅速置于_70°C冰箱保存?zhèn)溆茫?br> [0057]實驗時，將大鼠和家兔陰莖海綿體組織放進預冷的錐形離心管中，加入清理液清洗后移入到液氮凍存管中，即刻放進液氮罐過夜；第3日從液氮罐中取出，立即用研磨棒碾碎組織成粉末狀，放進一個15mL錐形離心管；樣品粉末中加入裂解液后強力漩渦震蕩30s，之后放進冰槽孵育30min，期間每IOmin強力渦旋震蕩30s，后于4°C臺式離心機離心IOmin,速度為lOOOOg，移取上清液到新的無菌離心管，移取20 采用BCA方法進行蛋白定量，其余樣品置于_70°C保存；
[0058]采用GENMED PDE 5酶活性連續(xù)循環(huán)定磷比色法定量檢測試劑盒(GENMEDSCIENTIFICS INC.U.S.A，上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司代理)進行酶活性的測定；底物環(huán)核苷酸(cAMP或cGMP)，在TOE5敏感性抑制劑(MY-5445)存在的情況下，通過TOE5的催化作用，進行水解反應，產(chǎn)生1-磷酸鳥苷產(chǎn)物后，經(jīng)由5-核苷酸酶(5-nucleotidase，5_NT)作用，釋放出游離磷酸根，進而與孔雀綠染料發(fā)生顯色反應后，通過分光光度儀(660nm波長)測定其峰值的變化；吸光度值的大小和TOE5酶活性成正比；
[0059]首先測定標準曲線，然后進行樣品背景(不加酶促液和底物液)測定，即比色皿中加入緩沖液以及5iU待測樣品，依次加入陰性液、終止液以及顯色液，靜止15min之后，放進分光光度計測量樣品背景；另取新的比色皿，加入酶促液和底物液，30°C孵育30min后加入待測樣品5 yl，再次30°C孵育30min。依次加入陰性液、終止液和顯色液靜置15min后，放入分光光度計檢測，獲得樣品總活性；另取新的比色皿，一次加入緩沖液、酶促液、底物液和專性液，30 0C中孵育30min之后加入待測樣品5 yl，再次30°C孵育30min后加入陰性液、終止液和顯色液靜置15min，放入分光光度計`檢測，獲得樣品非特異活性。
`[0060]樣品總活性和非特異活性計算:
[0061]{[根據(jù)標準曲線獲得樣品活性對應5-GMP濃度(y mol/L) 一根據(jù)標準曲線獲得樣品背景對應5-GMP濃度(ii mol/L) ]X樣品稀釋倍數(shù)} +30 (反應時間；min) =nmol5-GMP\ml\min+ 樣品蛋白濃度(mg\ml) =nmol5_GMP\mg\min ；
[0062]樣品特異活性計算:樣品特異活性=樣品總活性一樣品非特異活性；
[0063]結(jié)果如圖2所示，經(jīng)過灌胃給予不同劑量SPE的大鼠陰莖海綿體組織中TOE5活性相對生理鹽水組有顯著性的下降，經(jīng)過灌胃給予不同劑量的SPE的家兔陰莖海綿體組織中PDE5活性也出現(xiàn)了相似的結(jié)果；表明SPE可有效地抑制陰莖海綿體中TOE5的活性，從而抑制cGMP的水解，延長陰莖勃起的時程，對ED起到良好的治療作用。
【權(quán)利要求】
1.鋸葉棕果實提取物在制備治療勃起功能障礙藥物中的用途。
2.按權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述鋸葉棕果實提取物制成軟膠囊。
3.按權(quán)利要求2所述的用途，所述的鋸葉棕果實提取物軟膠囊用于抑制陰莖海綿體中PDE5活性，抑制cGMP的水解，提高cGMP濃度。
4.按權(quán)利要求2所述的用途，其特征在于，鋸葉棕果實提取物軟膠囊的給藥劑量為， SD雄性大鼠:低劑量組14.29mg/kg、中劑量組28.58mg/kg、高劑量組57.16mg/kg ； 雄性新西蘭家兔:低劑 量組7.5mg/kg、中劑量組15mg/kg、高劑量組30mg/kg。
【文檔編號】A61P15/10GK103623167SQ201210309278
【公開日】2014年3月12日 申請日期:2012年8月27日 優(yōu)先權(quán)日:2012年8月27日
【發(fā)明者】楊素榮, 李一瀛, 張云剛, 涂庭婷, 吳淦桐, 王浩, 姚明輝 申請人:復旦大學, 江蘇弘惠醫(yī)藥有限公司