專利名稱：一種注射用絲素蛋白透明質(zhì)酸復(fù)合凝膠及其制備與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)用美容填充材料，特別涉及ー種注射用絲素蛋白透明質(zhì)酸復(fù)合凝膠及制備方法和在軟組織填充材料中的應(yīng)用。
(ニ)
背景技術(shù)：
目前在組織修補(bǔ)、組織增強(qiáng)中，非手術(shù)治療的增長(zhǎng)迅速，所占比例已經(jīng)超過了 80% ；由于局部注射屬于微創(chuàng)治療方法，只需將某些藥物和化學(xué)制劑注入結(jié)構(gòu)松弛的軟組織局部，改善局部松弛程度，提高局部耐受壓力的能力，從而使該組織恢復(fù)其正常功能或外觀。隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，組織填充材料也越來越多，根據(jù)其成分和生物學(xué)特征可以將它們分為生物材料類和細(xì)胞注射產(chǎn)品類。
采用細(xì)胞注射是極具應(yīng)用前景的治療方法，細(xì)胞可以合成并分泌細(xì)胞外基質(zhì)，能促進(jìn)膠原蛋白分子的合成，恢復(fù)缺損組織。但由于細(xì)胞產(chǎn)品多為液態(tài)，注射到局部組織后難以控制其分布，不能塑型，影響組織修補(bǔ)、增強(qiáng)的效果。已報(bào)道的用于組織修補(bǔ)、增強(qiáng)類的生物材料已有很多，其中透明質(zhì)酸較為突出。透明質(zhì)酸是β -D-Nこ酰氨基葡萄糖和β -D-葡萄糖醛酸相互結(jié)合的直鏈狀高分子多糖，由于不具有種屬及臟器特異性。透明質(zhì)酸有特殊的流體力學(xué)性能，這使它具有高度粘弾性、可塑性、滲透性和良好的生物相容性。它還具有防止組織粘連，大大減少手術(shù)后并發(fā)癥，同時(shí)，有促進(jìn)創(chuàng)傷愈合，減少癥痕的優(yōu)點(diǎn)。當(dāng)植入到人體內(nèi)之后，不引起異體排斥反應(yīng)和過敏反應(yīng)。天然的外源性的透明質(zhì)酸分子量大約在10萬飛00萬Dalton，在體內(nèi)的存留時(shí)間大約在3 15天左右，很大程度上限制了其在某些領(lǐng)域的應(yīng)用。專利CN1590444A采用透明質(zhì)酸(HA)與交聯(lián)劑(BDDE)用適當(dāng)比例反應(yīng)2_24小時(shí)，形成透明質(zhì)酸凝膠。単一的透明質(zhì)酸凝膠作為軟組織填充材料，過一段時(shí)間就會(huì)因代謝而分解吸收，達(dá)不到長(zhǎng)期填充的目的。專利CN101502676A采用的方法為，將聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)微球和交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠微粒混合。由于PMMA微球的存在，使產(chǎn)品在肌體組織中的存留具有持久性。然而由于PMMA是ー種高分子聚合物，會(huì)對(duì)局部組織產(chǎn)生異物刺激，生物相容性相對(duì)較差。研究表明，蠶絲由約75%的絲素和約25%的絲膠所組成，它是蠶在絹絲腺內(nèi)分泌出來的天然蛋白質(zhì)，由18種氨基酸組成,主要由重復(fù)的Gly-Ala-Gly-Ala-Ser多胎單元組成，與人體膠原蛋白有一定的相似。它無毒性、無刺激性，是ー種降解緩慢，且相對(duì)穩(wěn)定的生物材料，被廣泛用于生物材料學(xué)科、組織工程及藥物釋放等領(lǐng)域。有研究者采用超聲誘導(dǎo)或聚合物靜電作用等方法制備絲素蛋白一透明質(zhì)酸復(fù)合凝膠。與單純的透明質(zhì)酸凝膠相比，大大延長(zhǎng)了凝膠的降解時(shí)間。然采用上述方法制備的復(fù)合凝膠，僅靠單純絲素蛋白，或絲素蛋白和透明質(zhì)酸之間的物理作用，透明質(zhì)酸含量較少，復(fù)合凝膠的吸水性較差。因此，尋找ー種制備絲素蛋白和透明質(zhì)酸復(fù)合凝膠的方法，能夠使材料具良好生物相容性，且兼具良好的吸水性、緩慢的降解速度。故探尋ー種兼具良好生物相容性、吸水性、體內(nèi)保留時(shí)間長(zhǎng)的絲素蛋白和透明質(zhì)酸復(fù)合材料，能夠長(zhǎng)期有效的組織修補(bǔ)、增強(qiáng)材料，成為本發(fā)明的出發(fā)點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是克服上述已有技術(shù)的不足，采用制備透明質(zhì)酸、絲素蛋白復(fù)合材料的方法，提供一種兼具良好生物相容性、力學(xué)性能及良好的吸水性，能夠長(zhǎng)期有效的組織修ネト、增強(qiáng)材料。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是ー種注射用絲素蛋白透明質(zhì)酸復(fù)合凝膠，所述復(fù)合凝膠由如下質(zhì)量配比的原料組成絲素蛋白微球I份，透明質(zhì)酸鹽廣50份和交聯(lián)劑O. 08^4份；所述絲素蛋白微球是將質(zhì)量濃度5%的絲素蛋白溶液在25°C下靜置凝膠后，在24000rpm/min條件下均質(zhì)5min，過篩，收集過20(Γ325目篩的絲素蛋白微球；所述交聯(lián)劑為ニこ烯基砜或ニ縮水甘油醚類化合物，優(yōu)選為ニこ烯基砜、こニ醇ニ縮水甘油醚、丁ニ醇ニ縮水甘油醚或聚丙ニ醇ニ縮水甘油醚中的ー種或兩種以上任意比例的混合，最優(yōu)選丁ニ醇ニ縮水甘油醚。所述透明質(zhì)酸鹽優(yōu)選為透明質(zhì)酸鈉、透明質(zhì)酸鉀、透明質(zhì)酸鎂中的ー種或兩種以 上任意比例的混合，更優(yōu)選為透明質(zhì)酸鈉。進(jìn)ー步，所述復(fù)合凝膠由如下質(zhì)量配比的原料組成絲素蛋白微球I份，透明質(zhì)酸鹽10 30份和交聯(lián)劑O. 8 2. 4份。更進(jìn)一歩，所述復(fù)合凝膠由如下質(zhì)量配比的原料組成絲素蛋白微球I份，透明質(zhì)酸鹽30份和交聯(lián)劑2. 4份。更進(jìn)一歩，所述復(fù)合凝膠由如下質(zhì)量配比的原料組成絲素蛋白微球I份，透明質(zhì)酸鹽20份和交聯(lián)劑I. 6份。更進(jìn)一歩，所述復(fù)合凝膠由如下質(zhì)量配比的原料組成絲素蛋白微球I份，透明質(zhì)酸鹽10份和交聯(lián)劑O. 8份。進(jìn)ー步，本發(fā)明所述注射用絲素蛋白透明質(zhì)酸復(fù)合凝膠的制備方法為(1)絲素蛋白微球的制備將桑蠶蠶絲加入到質(zhì)量濃度O. 2%的碳酸鈉水溶液中，96 100°C水浴60min，過濾，取濾餅重復(fù)水浴操作3次，取最后一次過濾的濾餅干燥后用9mol/L的溴化鋰水溶液溶解，在60°C水浴6h，然后在8000rpm條件下離心5min，收集上清液，用截留分子量(MW)為800(Γ14000的透析袋在室溫下進(jìn)行透析，以純化水為透析液，磁力攪拌透析3天，取截留液用水配制成質(zhì)量濃度5%的絲素蛋白溶液(取一定量所述的截留液在80°C烘箱中干燥4h至恒重，計(jì)算出截留液的含水量，進(jìn)而將截留液用水配制成質(zhì)量濃度5%的絲素蛋白溶液)；將質(zhì)量濃度5%的絲素蛋白溶液在25°C下靜置凝膠后，在24000rpm/min條件下均質(zhì)5min，過篩，收集過20(Γ325目篩的絲素蛋白微粒；所述碳酸鈉水溶液的體積用量以桑蠶蠶絲質(zhì)量計(jì)為67. 5^125ml/g (優(yōu)選67. 5ml/g)，所述溴化鋰水溶液的體積用量以桑蠶蠶絲質(zhì)量計(jì)為5飛.25ml/g；(2)注射用絲素蛋白透明質(zhì)酸復(fù)合凝膠的制備將配方量的透明質(zhì)酸鹽用質(zhì)量濃度1%的氫氧化鈉水溶液配制成O. lg/ml的透明質(zhì)酸鹽溶液，然后將配方量的絲素蛋白微粒加入到上述透明質(zhì)酸鹽溶液中充分混勻，再加入配方量交聯(lián)劑混勻，25飛(TC條件下靜置2lh，形成絲素蛋白透明質(zhì)酸復(fù)合凝膠材料，將絲素蛋白透明質(zhì)酸復(fù)合凝膠材料置于截留分子量(MW) 8000^14000的透析袋中，以pH為7. 4的PBS緩沖液為透析液進(jìn)行透析處理，取透析處理后的復(fù)合凝膠材料(即截留液)在24000rpm/min條件下均質(zhì)5 15min,過60目篩，收集粒徑為60目篩的顆粒即為所述注射用絲素蛋白透明質(zhì)酸復(fù)合凝膠；所述透明質(zhì)酸鹽為透明質(zhì)酸鈉、透明質(zhì)酸鉀、透明質(zhì)酸鎂中的ー種或兩種以上任意比例的混合，優(yōu)選透明質(zhì)酸鈉，所述交聯(lián)劑為ニこ烯基砜、こニ醇ニ縮水甘油醚、丁ニ醇ニ縮水甘油醚或聚丙ニ醇ニ縮水甘油醚中的ー種或兩種以上任意比例的混合，優(yōu)選丁ニ醇ニ縮水甘油醚。進(jìn)ー步，步驟(2)加入交聯(lián)劑混勻后，優(yōu)選在3(T40°C條件下靜置。進(jìn)ー步，步驟(2)加入交聯(lián)劑混勻后，優(yōu)選在4 6h條件下靜置。
本發(fā)明提供所述注射用絲素蛋白透明質(zhì)酸復(fù)合凝膠在軟組織填充材料中的應(yīng)用，它具有粒徑均一，易于注射、與單純的HA注射凝膠相比，存留時(shí)間長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)。所述軟組織填充材料是指面部除皺等微整形填充材料。絲素蛋白微球的平均粒徑范圍為I 120μπι，優(yōu)選2(Γ 00μπι，更優(yōu)選5(Γ75μπι，由
于絲素蛋白微球在溶液中為白色，不透明，因此，本發(fā)明復(fù)合凝膠外觀呈現(xiàn)乳白色。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明所述的絲素蛋白透明質(zhì)酸復(fù)合凝膠具有以下顯著優(yōu)點(diǎn)I)本發(fā)明與傳統(tǒng)透明質(zhì)酸單純交聯(lián)的凝膠相比，絲素蛋白透明質(zhì)酸復(fù)合凝膠體外抗酶解能力顯著提高，體外抗酶解試驗(yàn)證明，在相同酶液，相同時(shí)間作用下，絲素蛋白透明質(zhì)酸復(fù)合凝膠內(nèi)的透明質(zhì)酸的體外抗酶解能力隨著絲素蛋白顆粒的增加而增加，由此可以發(fā)現(xiàn)，絲素蛋白顆粒的加入，有效的減緩了復(fù)合凝膠的降解速度，延長(zhǎng)其在組織修補(bǔ)，填充的作用時(shí)間，提聞了材料的有效性；2)本發(fā)明與單純絲素蛋白顆粒材料相比，HA的加入，增加了材料的吸水性，提高材料的潤(rùn)滑度和儲(chǔ)水功能，可顯著增加材料的填充效果；3)本發(fā)明與單純物理方法混合絲素蛋白顆粒和HA顆粒相比，由于絲素蛋白顆粒是包裹在HA凝膠顆粒中的，兩者混合更加均勻，SD大鼠體內(nèi)試驗(yàn)證明，絲素蛋白透明質(zhì)酸復(fù)合凝膠和單純的透明質(zhì)酸交聯(lián)凝膠一祥，炎癥反應(yīng)小，生物相容性好，這提高了材料的安全性。


圖I葡萄糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線；圖2絲素蛋白透明質(zhì)酸復(fù)合凝膠體外抗降解能力樣本I為實(shí)施例I制備的絲素蛋白透明質(zhì)酸復(fù)合凝膠，樣本2為實(shí)施例2制備的絲素蛋白透明質(zhì)酸復(fù)合凝膠，樣本3為實(shí)施例3制備的絲素蛋白透明質(zhì)酸復(fù)合凝膠；圖3絲素蛋白透明質(zhì)酸復(fù)合凝膠在體內(nèi)植入兩周后的組織切片顯微圖，A為實(shí)施例I制備的絲素蛋白透明質(zhì)酸復(fù)合凝膠在體內(nèi)植入兩周后的組織切片顯微圖，B為實(shí)施例I制備的絲素蛋白透明質(zhì)酸復(fù)合凝膠在體內(nèi)植入八周后的組織切片顯微圖；圖4絲素蛋白透明質(zhì)酸復(fù)合凝膠及透明質(zhì)酸凝膠在體內(nèi)植入兩周后的組織切片顯微圖，Al為實(shí)施例廣4制備絲素蛋白透明質(zhì)酸復(fù)合凝膠和透明質(zhì)酸凝膠體內(nèi)植入兩周的HE染色圖片，E為對(duì)照樣本(PBS)體內(nèi)植入兩周后的HE染色圖片。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此實(shí)施例I :絲素蛋白透明質(zhì)酸復(fù)合凝膠(I)絲素蛋白微球的制備40g桑蠶蠶絲加入到2700ml質(zhì)量濃度O. 2%的碳酸鈉水溶液中，96 100°C水浴60min，過濾，取濾餅重復(fù)水浴3次，取最后一次過濾的濾餅在60°C烘干后用9mol/L的溴化鋰水溶液200ml緩慢溶解，在60°C水浴6h，然后8000rpm離心5min，取上清，將離心處理后的上清液裝入透析袋(MW8，00(Γ14，000)，以純化水為透析液，磁力攪拌透析三天，取截留液，并用純化水配制成質(zhì)量濃度為5%的絲素蛋白溶液。在25°C條件下，將上述5%絲素蛋白溶液靜置形成白色凝膠材料5g，將凝膠材料用均質(zhì)機(jī)(T25, IKA)在24000rpm/min條件下均質(zhì)5min后,得到直徑大小不同的絲素蛋白凝膠顆粒5g，過濾，收集過200目篩的絲素蛋白顆粒3. 5g，稱取少量收集的絲素蛋白顆粒干燥 至恒重確定絲素蛋白顆粒的含水量，并確定絲素蛋白顆粒質(zhì)量濃度為3. 23%。(2)絲素蛋白透明質(zhì)酸復(fù)合凝膠將O. 7g透明質(zhì)酸鈉溶解在7ml質(zhì)量濃度1%氫氧化鈉溶液中制成O. lg/ml透明質(zhì)酸鈉溶液，并向透明質(zhì)酸鈉溶液中加入步驟(I)獲得的絲素蛋白顆粒O. 712g (O. 023/0. 0323=0. 712g，絲素蛋白顆粒干重為O. 023g),充分混合后加入56 μ I (O. 056g)的BDDE (1，4-丁ニ醇ニ縮水甘油醚)，混合均勻后，置于40°C條件下靜置4小時(shí)進(jìn)行交聯(lián)，即可形成絲素蛋白-HA復(fù)合凝膠材料。將上述絲素蛋白-HA復(fù)合凝膠材料加入到MW8，000-14, 000的透析袋中，以pH值為7. 4的PBS緩沖液為透析液，在磁力攪拌下進(jìn)行透析處理，將透析處理后的復(fù)合凝膠材料用均質(zhì)機(jī)在24000rpm/min條件下均質(zhì)IOmin后，置于注射器內(nèi)擠壓使凝膠通過60目篩，收集復(fù)合凝膠顆粒，120°C高溫高壓蒸汽滅菌15min后，進(jìn)行無菌分裝，裝入一次性注射器中。即得到注射用的絲素蛋白透明質(zhì)酸復(fù)合凝膠35g，可用作皮下注射產(chǎn)品。取絲素蛋白透明質(zhì)酸復(fù)合凝膠用蒸餾水作等質(zhì)量比稀釋(配比見表I所示)，混合均勻后，室溫(25°C)靜置半小時(shí)，測(cè)量溶液的pH值，每個(gè)樣本重復(fù)三次，并取平均值作為樣本的pH值，結(jié)果見表I所
/Jn ο實(shí)施例2絲素蛋白透明質(zhì)酸復(fù)合凝膠(I)根據(jù)實(shí)施例I步驟(I)所述的方法，制備過200目篩的絲素蛋白顆粒3. 5g，質(zhì)量濃度為3. 23%。(2)將O. 7g透明質(zhì)酸鈉溶解在7ml質(zhì)量濃度1%氫氧化鈉溶液中制成O. Ig/ml透明質(zhì)酸鈉溶液，并向透明質(zhì)酸溶液中加入步驟(I)獲得的絲素蛋白顆粒I. 0836g(O. 035/0. 0323=1. 0836g),充分混合后加入56 μ I的BDDE，混合均勻后，置于40°C條件下靜置6小時(shí)進(jìn)行交聯(lián)，形成絲素蛋白透明質(zhì)酸復(fù)合凝膠材料。將上述絲素蛋白透明質(zhì)酸復(fù)合凝膠材料進(jìn)行透析處理，其它操作同實(shí)施例1，得到注射用的絲素蛋白透明質(zhì)酸復(fù)合凝膠35g，可用作組織填充注射產(chǎn)品。取絲素蛋白透明質(zhì)酸復(fù)合凝膠用蒸餾水作等質(zhì)量比稀釋(配比見表I所示)，混合均勻后，室溫(25°C)靜置半小時(shí)，測(cè)量溶液的PH值，每個(gè)樣本重復(fù)三次，并取平均值作為樣本的pH值，結(jié)果見表I所示。實(shí)施例3 :絲素蛋白透明質(zhì)酸復(fù)合凝膠(I)根據(jù)實(shí)施例I步驟(I)所述的方法，制備過200目篩的絲素蛋白顆粒3. 5g，質(zhì)量濃度為3. 23%。(2)將O. 7g透明質(zhì)酸鈉溶解在7ml質(zhì)量濃度1%氫氧化鈉溶液中制成O. lg/ml的透明質(zhì)酸鈉溶液，井向透明質(zhì)酸鈉溶液中加入2. 167g (O. 07/0. 0323=2. 167g)絲素蛋白顆粒，充分混合后加入56 μ I的BDDE，混合均勻后，置于40°C條件下靜置5小時(shí)進(jìn)行交聯(lián)，形成絲素蛋白透明質(zhì)酸復(fù)合凝膠材料。將絲素蛋白透明質(zhì)酸復(fù)合凝膠材料進(jìn)行透析處理，其它操作同實(shí)施例1，得到注射用的絲素蛋白透明質(zhì)酸復(fù)合凝膠35g，可用作皮下填充注射產(chǎn)品。取絲素蛋白透明質(zhì)酸復(fù)合凝膠用蒸餾水作等質(zhì)量比稀釋(配比見表I所示)，混合均勻后，室溫(25°C)靜置半小時(shí)，測(cè)量溶液的PH值，每個(gè)樣本重復(fù)三次，并取平均值作為樣本的pH值，結(jié)果見表I所示。實(shí)施例4 :透明質(zhì)酸凝膠的制備將O. 7g透明質(zhì)酸鈉溶解在7ml質(zhì)量濃度1%氫氧化鈉溶液中制成O. lg/ml的透明質(zhì)酸鈉溶液，充分混合后加入56 μ I BDDE,混合均勻后，置于40°C條件下靜置5小時(shí)進(jìn)行交 聯(lián)，即可得到透明質(zhì)酸凝膠。將透明質(zhì)酸凝膠進(jìn)行透析處理后，其它操作同實(shí)施例1，即得到注射用的透明質(zhì)酸凝膠35g。取絲素蛋白透明質(zhì)酸復(fù)合凝膠用蒸餾水作等質(zhì)量比稀釋(配比見表I所示)，混合均勻后，室溫(25°C )靜置半小時(shí)，測(cè)量溶液的pH值，每個(gè)樣本重復(fù)三次，并取平均值作為樣本的PH值，結(jié)果見表I所示。表I絲素蛋白透明質(zhì)酸復(fù)合凝膠pH值
.....涵................................................................................Ilii.......("g)..........................................................I—i "/K.......c'g)^ TpH
2.51342.54027.42實(shí)施倒12.53542.51207.41
[2.5199J 2.61281:7.41
均位7.41
T 2.5090I 2.5326[7.41
食施例 2 2.50052.49697.40
[2.5292J 2.53621:7.41
均+tff:; 7.41
[2.5081I 2.5211〔7.40
實(shí)施例 3 2.53392.52227.39
し 5」_ 2.5057_ 2.4931_[ 7.40
均7·40
[2.5213I 2.5385Γ .41
實(shí)施倒 4 2.51722.51887.40
[2.5494J 2.55311:7.41表I可以看出，實(shí)施例f 4所制備的絲素蛋白透明質(zhì)酸復(fù)合凝膠、透明質(zhì)酸凝膠的pH值均在7.4。實(shí)施例5 :體外抗降解能力試驗(yàn)交聯(lián)透明質(zhì)酸經(jīng)過酶解后，會(huì)分解成葡萄糖醛酸，葡萄糖醛酸與咔唑試劑作用產(chǎn)生紅紫色，顏色的深淺與葡萄糖醛酸的含量成正比?？梢酝ㄟ^吸光值確定葡萄糖醛酸的含量。通過考察不同比例絲素蛋白加入量制成的絲素蛋白透明質(zhì)酸復(fù)合凝膠中，葡萄糖醛酸含量的多少，來判斷復(fù)合凝膠的體外抗酶解能力，從而判斷復(fù)合凝膠及單純透明質(zhì)酸交聯(lián)凝膠的體外抗酶解能力。具體實(shí)施方案如下
把實(shí)施例f 3制備的絲素蛋白透明質(zhì)酸復(fù)合凝膠進(jìn)行體外抗降解能力的測(cè)定。( I)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制用水配制70、60、50、40、3(^8/!111的葡萄糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)液，取O. 5ml標(biāo)準(zhǔn)液置于試管中，以O(shè). 5ml蒸餾水作為對(duì)照。將標(biāo)準(zhǔn)管及對(duì)照管一起置于冰水浴((TC)中，用玻璃移液管緩慢地向每管中分別加入四硼酸鈉硫酸2. 5ml，邊加邊搖勻(注意，需要充分混勻)，置于沸水浴中煮沸20min后取出，冷卻至室溫(可以冰浴，加速冷卻)。各試管中加入O. 1%的咔唑こ醇液(稱取O. Ig咔唑,加無水こ醇IOOml溶液)O. Iml,充分混勻后,置于室溫放置2h,分別用分光光度計(jì)測(cè)定530nm處各樣品液的吸光值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)液濃度和吸光值繪制葡萄糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(擬合度大于等于O. 995)，見圖I所示，曲線方程為y=0. 0384x+0. 1383，R2=O. 9981。(2)分別取實(shí)施例廣3制備的絲素蛋白透明質(zhì)酸復(fù)合凝膠O. 5g，分別加入300U/ml 透明質(zhì)酸酶液2ml (透明質(zhì)酸酶的活力為838U/mg, sigma), 37°C保溫降解65h,再分別用pH值為7. 4的PBS緩沖液將上述反應(yīng)液定容至10ml，各取Iml定容后的反應(yīng)液加入無水こ醇4ml，在10000r/min離心15min,分別取上清液2ml加pH值為7. 4的PBS緩沖液3ml，作為樣品液，平行對(duì)照一組。分別取O. 5ml樣品液置于試管中，以O(shè). 5ml蒸餾水作為對(duì)照。將樣品管及對(duì)照管一起置于冰水浴中，用玻璃移液管緩慢地向每管中分別加入四硼酸鈉硫酸2. 5ml，邊加邊搖勻(注意，需要充分混勻)，置于沸水浴中煮沸20min后取出，冷卻至室溫(可以冰浴，加速冷卻)。各試管中加入質(zhì)量濃度O. 1%的咔唑こ醇液O. 1ml，充分混勻后，置于室溫放置2h，用分光光度計(jì)測(cè)定530nm處樣品液的吸光值。絲素蛋白透明質(zhì)酸復(fù)合凝膠中透明質(zhì)酸鈉降解后釋放出葡萄糖醛酸，降解的越多形成的葡萄糖醛酸就越多，根據(jù)葡萄糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程，查得樣品液的葡萄糖醛酸濃度，進(jìn)而獲得絲素蛋白透明質(zhì)酸復(fù)合凝膠體外抗降解能力，結(jié)果如表2和圖2所示。透明質(zhì)酸酶酶解情況計(jì)算方法為HACnif/iil) = -........X N X-*-
Ws xlOOO194.ICS—線性回歸得出的稀釋樣品中的葡萄糖醛酸的均濃度(ug/ml )；ffs-稱量凝膠的重量(Ig=Iml)；401. 3=雙糖的分子量；194. I=D-葡萄糖醛酸的分子量；N=稀釋倍數(shù)；可以看出，隨著絲素蛋白加入量的不斷増加，凝膠的抗酶解能力増加，體外保持的時(shí)間增加。表2絲素蛋白透明質(zhì)酸復(fù)合凝膠體外抗降解能力
葡萄糖醛酸濃度透明質(zhì)酸酶酶解~
實(shí)施例 I56.76ug/ml29. 34mg/ml
實(shí)施例 237.24ug/ml19.25mg/ml
權(quán)利要求
1.ー種注射用絲素蛋白透明質(zhì)酸復(fù)合凝膠，其特征在于所述復(fù)合凝膠由如下質(zhì)量配比的原料組成絲素蛋白微球I份，透明質(zhì)酸鹽I飛O份和交聯(lián)劑O. 08、份；所述絲素蛋白微球是將質(zhì)量濃度5%的絲素蛋白溶液在25°C下靜置凝膠后，在24000rpm/min條件下均質(zhì)5min，過篩，收集過20(Γ325目篩的絲素蛋白微球；所述交聯(lián)劑為ニこ烯基砜、こニ醇ニ縮水甘油醚、丁ニ醇ニ縮水甘油醚或聚丙ニ醇ニ縮水甘油醚中的ー種或兩種以上任意比例的混合。
2.如權(quán)利要求I所述注射用絲素蛋白透明質(zhì)酸復(fù)合凝膠，其特征在于所述透明質(zhì)酸鹽為透明質(zhì)酸鈉、透明質(zhì)酸鉀、透明質(zhì)酸鎂中的ー種或兩種以上任意比例的混合。
3.如權(quán)利要求I所述注射用絲素蛋白透明質(zhì)酸復(fù)合凝膠，其特征在于所述復(fù)合凝膠由如下質(zhì)量配比的原料組成絲素蛋白微球I份，透明質(zhì)酸鹽1(Γ30份和交聯(lián)劑O. 8^2. 4份。
4.如權(quán)利要求I所述注射用絲素蛋白透明質(zhì)酸復(fù)合凝膠，其特征在于所述復(fù)合凝膠由如下質(zhì)量配比的原料組成絲素蛋白微球I份，透明質(zhì)酸鹽30份和交聯(lián)劑2. 4份。
5.如權(quán)利要求I所述注射用絲素蛋白透明質(zhì)酸復(fù)合凝膠，其特征在于所述復(fù)合凝膠由如下質(zhì)量配比的原料組成絲素蛋白微球I份，透明質(zhì)酸鹽20份和交聯(lián)劑I. 6份。
6.如權(quán)利要求I所述注射用絲素蛋白透明質(zhì)酸復(fù)合凝膠，其特征在于所述復(fù)合凝膠由如下質(zhì)量配比的原料組成絲素蛋白微球I份，透明質(zhì)酸鹽10份和交聯(lián)劑O. 8份。
7.如權(quán)利要求I所述注射用絲素蛋白透明質(zhì)酸復(fù)合凝膠的制備方法，其特征在于所述方法為(1)絲素蛋白微球的制備將桑蠶蠶絲加入到質(zhì)量濃度O. 2%的碳酸鈉水溶液中，96 100°C水浴60min，過濾，取濾餅重復(fù)水浴操作3次，取最后一次過濾的濾餅干燥后用9mol/L的溴化鋰水溶液溶解,在60°C水浴6h,然后在8000rpm的條件下離心5min,收集上清液，用截留分子量為800(Γ14000的透析袋在室溫下進(jìn)行透析，以純化水為透析液，磁力攪拌透析3天，取截留液用水配制成質(zhì)量濃度5%的絲素蛋白溶液；將質(zhì)量濃度5%的絲素蛋白溶液在25°C下靜置凝膠后，在24000rpm/min條件下均質(zhì)5min，過篩，收集過200 325目篩的絲素蛋白微粒；所述碳酸鈉水溶液的體積用量以桑蠶蠶絲質(zhì)量計(jì)為67. 5 125ml/g，所述溴化鋰水溶液的體積用量以桑蠶蠶絲質(zhì)量計(jì)為5飛.25ml/g ；(2)注射用絲素蛋白透明質(zhì)酸復(fù)合凝膠的制備將配方量的透明質(zhì)酸鹽用質(zhì)量濃度1%的氫氧化鈉水溶液配制成O. Ig/ml的透明質(zhì)酸鹽溶液，然后將配方量的絲素蛋白微粒加入到上述透明質(zhì)酸鹽溶液中充分混勻，再加入配方量交聯(lián)劑混勻，25飛(TC條件下靜置2 8h，形成絲素蛋白透明質(zhì)酸復(fù)合凝膠材料，將絲素蛋白透明質(zhì)酸復(fù)合凝膠材料置于截留分子量為800(Γ14000的透析袋中，以pH為7. 4的PBS緩沖液為透析液進(jìn)行透析處理，取透析后的復(fù)合凝膠材料，在24000rpm/min條件下均質(zhì)5 15min，過60目篩，收集粒徑為60目篩的顆粒即為所述注射用絲素蛋白透明質(zhì)酸復(fù)合凝膠；所述透明質(zhì)酸鹽為透明質(zhì)酸鈉、透明質(zhì)酸鉀、透明質(zhì)酸鎂中的ー種或兩種以上任意比例的混合，所述交聯(lián)劑為ニこ烯基砜、こニ醇ニ縮水甘油醚、丁ニ醇ニ縮水甘油醚或聚丙ニ醇ニ縮水甘油醚中的ー種或兩種以上任意比例的混合。
8.如權(quán)利要求7所述注射用絲素蛋白透明質(zhì)酸復(fù)合凝膠的制備方法，其特征在于步驟(2)所述反應(yīng)溫度為3(T40°C。
9.如權(quán)利要求7所述注射用絲素蛋白透明質(zhì)酸復(fù)合凝膠的制備方法，其特征在于步驟(2)再加交聯(lián)劑混勻后在3(T40°C條件下靜置時(shí)間為4 6h。
10.如權(quán)利要求I所述注射用絲素蛋白透明質(zhì)酸復(fù)合凝膠在制備軟組織填充材料中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種注射用絲素蛋白透明質(zhì)酸復(fù)合凝膠及其制備與應(yīng)用，所述復(fù)合凝膠由如下質(zhì)量配比的原料組成絲素蛋白微球1份，透明質(zhì)酸鹽1~50份和交聯(lián)劑0.08~4份；本發(fā)明與傳統(tǒng)透明質(zhì)酸單純交聯(lián)的凝膠相比，絲素蛋白顆粒的加入，有效的減緩了復(fù)合凝膠的降解速度，延長(zhǎng)其在組織修補(bǔ)，填充的作用時(shí)間，提高了材料的有效性，HA的加入，增加了材料的吸水性，提高材料的潤(rùn)滑度和儲(chǔ)水功能；本發(fā)明與單純物理方法混合絲素蛋白顆粒和HA顆粒相比，由于絲素蛋白顆粒是包裹在HA凝膠顆粒中的，兩者混合更加均勻，制備的凝膠顆粒炎癥反應(yīng)小，生物相容性好，提高了材料的安全性。
文檔編號(hào)A61L31/04GK102836465SQ20121031494
公開日2012年12月26日 申請(qǐng)日期2012年8月30日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月30日
發(fā)明者謝淑君, 陳隆坤, 趙洪石, 其他發(fā)明人請(qǐng)求不公開姓名 申請(qǐng)人:浙江星月生物科技股份有限公司