專利名稱：牦牛乳酪蛋白降血壓肽的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明利用胰蛋白酶水解牦牛乳酪蛋白制備降血壓肽，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及多肽的膜分離技術(shù)。
背景技術(shù)：
大量的研究發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)在人體內(nèi)并不完全是以氨 基酸的形式被人體所吸收，而更多的是以小分子肽的形式被人體吸收利用。這些由數(shù)個氨基酸組成小分子肽不僅具有營養(yǎng)功能和生理活性，還具有一定的功能特性，如抗氧化性、抗菌性、提高免疫性等諸多新功倉泛。降血壓肽就是這樣一種具有降低血壓功能的小分子肽，分子量主要集中在1500U左右，它是血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(Angiotension-converting Enzyme, ACE)的抑制劑，因而也稱為 ACE 抑制妝(Angiotension-converting Enzyme Inhibitory peptides, ACEIP)。人體中存在腎素一血管緊張素系統(tǒng)(Renin-Angiotensin System, RAS)和激肽釋放酶一激肽系統(tǒng)(Kallikrein-Kinin System, KKS)對血壓的調(diào)節(jié)起著重要作用。ACE催化RAS系統(tǒng)中的血管素I轉(zhuǎn)化成具有強烈血管收縮作用的血管緊張素II，將KKS系統(tǒng)中具有血管擴張作用的緩激肽降解成無活性的緩釋肽，通過這兩種方式引起血壓上升。ACE抑制肽與ACE結(jié)合后阻止了其對血管緊張素I及緩激肽的催化分解，從而起到了降低血壓的作用。目前已有多種化學合成肽類藥物作為ACE抑制劑，但這類合成降血壓藥存在作用時間不長，血壓容易反彈，并且藥物經(jīng)腎臟排出容易造成腎功能的損傷。而從食品蛋白質(zhì)經(jīng)酶解產(chǎn)生的ACE抑制肽具有食用安全性高、無副作用，特別是其對高血壓患者具有降壓作用，但對血壓正常人無降壓作用等優(yōu)點。專利號為ZL02139559. 4的專利，授權(quán)公布了一種用粗奶酪為原料制備酪蛋白降血壓肽的工藝，其制備工藝簡單，但由于其酶水解產(chǎn)物未經(jīng)過超濾、納濾等純化工藝，水解產(chǎn)物含有較多雜肽段和大量鹽，限制了產(chǎn)品在保健品和藥品中的應用。同時其工藝用鹽酸調(diào)節(jié)PH終止酶解反應，但并未對蛋白酶進行徹底滅火，水解產(chǎn)物潛在的活性蛋白酶類作為食品，會存在潛在的安全風險。其次，未參與水解的酪蛋白，其專利也未提供去除工藝，由于酪蛋白分子量大，不易被吸收，疏水性強，不易溶于水，勢必會影響最終產(chǎn)品品質(zhì)，降低產(chǎn)品營養(yǎng)價值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于利用青藏高原特有的牦牛曲拉，通過提取純化得到的酪蛋白為原料，提供一種對引起高血壓的ACE有明顯抑制作用的牦牛乳酪蛋白降血壓肽的制備方法，工藝簡單，純度高，水解產(chǎn)物不含小分子鹽、大分子酪蛋白和活性蛋白酶，適合在食品、保健品及醫(yī)藥領(lǐng)域中使用。本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的，一種牦牛乳酪蛋白降血壓肽的制備方法，包括以下步驟(I)牦牛乳酪蛋白加水溶解，調(diào)整濃度為1% 10%，調(diào)節(jié)溫度為20°C 50°C，pH6. O 9. 0,攪拌,使牦牛乳酪蛋白完全溶解；(2)加胰蛋白酶水解，維持反應溫度20°C 50°C，pH6. O 9. 0，水解I 7小時；(3)滅活胰蛋白酶，升溫至80°C 100°C，維持30 50分鐘；(4)沉淀酪蛋白，用5mol/L食用級鹽酸調(diào)節(jié)pH到3. 8 4. 6,使酪蛋白在其等電點處析出；(5)離心除沉淀，4000g 12000g離心力，離心5 30分鐘，留上清液；
(6)超濾，用截留量3000Da的超濾膜，超濾步驟(5)所得上清液，除去大分子蛋白及多肽，收集透過液；(7)納濾，用截留量500Da的納濾膜，納濾步驟(6)所得超濾液去除小分子鹽和氨基酸，收集回流液；(8)對步驟(7)收集的回流液進行噴霧干燥，即得所述的牦牛乳酪蛋白降血壓肽。在步驟(I)中所述的牦牛乳酪蛋白為食品級牦牛乳酪蛋白，購自華羚酪蛋白股份有限公司，步驟(I)中所述的牦牛乳酪蛋白加水溶解是取5 50g牦牛乳酪蛋白，加水500mL進行溶解。在步驟(2)中胰蛋白酶，酶添加量為牦牛乳酪蛋白加入量的O. 5% 2%，所述的胰蛋白酶購自北京格源天潤生物技術(shù)有限公司，酶活為1:2500。在步驟(8)中，是采用噴霧干燥機對步驟(7)收集的回流液進行干燥的，所述噴霧干燥機進風溫度為150 165°C，出風溫度為65 85°C，流速300 400mL/h。所述的噴霧干燥機現(xiàn)主要采用上海沃迪科技有限公司提供的SD-1500型噴霧干燥機。最終，我們還可以對所述牦牛乳酪蛋白降血壓肽進行了降血壓活性測定ACE酶液50mg兔肺丙酮粉浸泡于5mL預冷至4°C硼酸緩沖液(pH8. 3，IOOmmoI/L)中，4°C保持12h后4°C、20000r/min離心40min，收集上清液并4°C保。FAPGG底物溶液將FAPGG溶于100mmol/L的硼酸沖液(含300mmol/L的NaCl，pH8. 3),配制成 I. 6mmol/L 溶液。500 μ L FAPGG底物溶液與100 μ L超純水或抑制劑ACE抑制肽或卡托普利)混勻，37°C預熱2min，加入IOOyL ACE酶液開始反應，30min后立即加入100 μ LDTA (IOOmmoI/L)終止反應，加入4000 μ L超純水稀釋，實驗平行3次。Omin樣品的測定，要先加入EDTA再加入ACE酶液，其他相同。于340nm波長處分別測系在Omin和30min時的吸光度，計算差值ΛΑ(ΛΑ = AOmin — A30min)。以單位時間內(nèi)吸光度的變化表示ACE酶活力，抑制劑對ACE的抑制程度用(2)式計算。
jS, i j
ACE 抑制活性%= (I _ —— ) X100
ii-AC式中AAc為加入超純水時吸光度在30min內(nèi)的變；AAi為加入抑制劑時吸光度在30min內(nèi)的變化。半抑制濃度(IC50)定義為抑制50%ACE酶活力時抑制劑濃度。配制不同濃度的ACE抑制劑(nmol/L或mg/mL)上述步驟測定其ACE抑制活性，以Ig抑制劑的濃度橫坐標，ACE抑制活性(%)為縱坐標，進行回歸分析回歸方程，利用回歸方程計算抑制劑的IC50。本發(fā)明的有益效果是I.本發(fā)明采用青藏高原無污染的牦牛乳酪蛋白為原料，原料蛋白含量高，價格低，間接降低了生產(chǎn)成本；同時開發(fā)了牧區(qū)資源，對牧區(qū)經(jīng)濟發(fā)展具有重要意義。2.食源牦牛乳酪蛋白降血壓肽，與合成降血壓產(chǎn)品相比，食用安全性高、無副作用，特別是其對高血壓患者具有降壓作用，但對血壓正常人無降壓作用?？蓮V泛應用于治療心血管疾病方面的藥品、保健食品和食品添加劑中。3.采用膜技術(shù)除大分子片段和鹽，產(chǎn)品分子量穩(wěn)定，純度更高。4.本發(fā)明操作工藝簡單，綠色環(huán)保，生產(chǎn)成本低，適合工業(yè)化生產(chǎn)和推廣。
具體實施例方式本發(fā)明結(jié)合具體實施實例做進一步詳述

實施例I :(I)牦牛乳酪蛋白加水溶解稱取牦牛乳酪蛋白30g，加水500mL，調(diào)節(jié)反應溫度37°C，pH8.0，攪拌，使牦牛乳酪蛋白溶解；所述的牦牛乳酪蛋白購自華羚酪蛋白股份有限公司，食品級；(2)加胰蛋白酶水解，胰蛋白酶添加量為I. 5g，維持反應溫度30°C，pH8. 0，水解2小時；所述胰蛋白酶購自北京格源天潤生物技術(shù)有限公司，酶活為1:2500 ；(3)滅活胰蛋白酶，升溫至90°C，維持30分鐘；(4)沉淀酪蛋白用5mol/L食用級鹽酸調(diào)節(jié)pH到4. 6,使酪蛋白在其等電點處析出；(5)離心除沉淀4000g離心力，離心5 30分鐘，除去酪蛋白沉淀，留上清液；(6)超濾取離心后上清液，過截留量3000Da的超濾膜，收集透過液，除去大分子蛋白及多肽；(7)納濾取超濾透過液，通過截留分子量為500Da的納濾膜，收集回流液，除去小分子鹽和氨基酸；(8)噴霧干燥取納濾回流液,采用噴霧干燥機,對產(chǎn)品進行噴干,得到牦牛乳酪蛋白降血壓肽，得干粉20. Ig,得率67% ；(9)降血壓活性測定ACE抑制活性為87. 5%。對所述牦牛乳酪蛋白降血壓肽進行了降血壓活性測定步驟是ACE酶液50mg兔肺丙酮粉浸泡于5mL預冷至4°C硼酸緩沖液(pH 8. 3，IOOmmoI/L)中，4°C保持12h后4°C、20000r/min離心40min，收集上清液并4°C保。FAPGG底物溶液將FAPGG溶于100mmol/L的硼酸沖液(含300mmol/L的NaCl，pH8. 3),配制成 I. 6mmol/L 溶液。500 μ L FAPGG底物溶液與100 μ L超純水或抑制劑ACE抑制肽或卡托普利)混勻，37°C預熱2min，加入100 μ L ACE酶液開始反應，30min后立即加入IOOLDTA (IOOmmoI/L)終止反應，加入4000 μ L超純水稀釋，實驗平行3次。Omin樣品的測定，要先加入EDTA再加AACE酶液，其他相同。于340nm波長處分別測系在Omin和30min時的吸光度，計算差值ΔΑ(ΔΑ = AOmin 一 A30min)。以單位時間內(nèi)吸光度的變化表示ACE酶活力，抑制劑對ACE的抑制程度用(2)式計算。
權(quán)利要求
1.一種牦牛乳酪蛋白降血壓肽的制備方法，其特征在于包括以下步驟 (1)牦牛乳酪蛋白加水溶解，調(diào)整濃度為1% 10%，調(diào)節(jié)溫度為20°C 50°C，pH6.O 9.0，攪拌，使牦牛乳酪蛋白完全溶解； (2)加胰蛋白酶水解，維持反應溫度20°C 50°C，pH6.O 9. 0，水解I 7小時； (3)滅活胰蛋白酶，升溫至80°C 100°C，維持30 50分鐘； (4)沉淀酪蛋白，用5mol/L食用級鹽酸調(diào)節(jié)pH到3.8 4. 6,使酪蛋白在其等電點處析出； (5)離心除沉淀，4000g 12000g離心力，離心5 30分鐘，留上清液； (6)超濾，用截留量3000Da的超濾膜，超濾步驟(5)所得上清液，除去大分子蛋白及多妝，收集透過液； (7)納濾，用截留量500Da的納濾膜，納濾步驟(6)所得超濾液去除小分子鹽和氨基酸，收集回流液； (8)對步驟(7)收集的回流液進行噴霧干燥，即得所述的牦牛乳酪蛋白降血壓肽。
2.如權(quán)利要求I所述的牦牛乳酪蛋白降血壓肽的制備方法，其特征是在步驟(I)中所述的牦牛乳酪蛋白為食品級牦牛乳酪蛋白，步驟(I)中所述的牦牛乳酪蛋白加水溶解是取5 50g牦牛乳酪蛋白，加水500mL進行溶解。
3.如權(quán)利要求I所述的牦牛乳酪蛋白降血壓肽的制備方法，其特征是在步驟(2)中胰蛋白酶，酶添加量為牦牛乳酪蛋白加入量的O. 5% 2%。
4.如權(quán)利要求I所述的牦牛乳酪蛋白降血壓肽的制備方法，其特征是在步驟(8)中，是采用噴霧干燥機對步驟(7 )收集的回流液進行干燥的，所述噴霧干燥機進風溫度為150 165°C，出風溫度為65 85°C，流速300 400mL/h。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用牦牛乳酪蛋白為原料制備降血壓肽的方法，該方法主要技術(shù)步驟如下(1)牦牛乳酪蛋白溶解；(2)加胰蛋白酶水解；(3)滅活胰蛋白酶；(4)沉淀酪蛋白；(5)離心除沉淀；(6)超濾；(7)納濾；(8)噴霧干燥。本發(fā)明的原料獨特，工藝科學合理、簡單易行，產(chǎn)品為純度較高的酪蛋白降血壓肽，ACE抑制活性高達70%以上，安全、無副作用，兼具營養(yǎng)和輔助醫(yī)療功能，可作為添加劑廣泛應用于食品、保健品、藥品等領(lǐng)域。
文檔編號A61P9/12GK102787155SQ20121031549
公開日2012年11月21日 申請日期2012年8月30日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月30日
發(fā)明者何瀟, 宋禮, 紀銀莉, 蘇艷萍, 葛靜微, 謝小冬, 高維東 申請人:甘肅華羚生物技術(shù)研究中心