專利名稱：修飾抗體的方法和具有改善的功能性質(zhì)的修飾抗體的制作方法
修飾抗體的方法和具有改善的功能性質(zhì)的修飾抗體本申請是申請日為2008年6月25日、發(fā)明名稱為“修飾抗體的方法和具有改善的功能性質(zhì)的修飾抗體”、申請?zhí)枮?00880021889. 4的申請的分案申請。本申請要求于2007年6月25日提交的美國臨時申請序列號60/937，112的優(yōu)先權(quán)，所述美國臨時申請的名稱為 “Sequence Based Engineering and Optimization ofSingle Chain Antibodies”。本申請還要求于2008年3月12日提交的美國臨時申請序列號61/069，056的優(yōu)先權(quán),所述美國臨時申請的名稱為“Methods of Modifying Antibodies,and Modified Antibodies with Improved Functional Properties，，。發(fā)明背景
已證明抗體在癌癥、自身免疫疾病和其他病癥的治療中是非常有效和成功的治療齊U。盡管一般已在臨床上使用全長抗體，但存在使用抗體片段可以提供的許多優(yōu)點，例如增加組織穿透力、與增加其他效應(yīng)子功能的能力結(jié)合的Fe效應(yīng)子功能的不存在、和由較短的全身體內(nèi)半衰期導(dǎo)致的較少全身性副作用的可能性。抗體片段的藥代動力學(xué)性質(zhì)表明，它們可能特別良好地適合于局部治療方法。此外，抗體片段在特定表達系統(tǒng)中可以比全長抗體更容易產(chǎn)生。一個類型的抗體片段是單鏈抗體(scFv)，其由經(jīng)由接頭序列綴合的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(')與重鏈可變結(jié)構(gòu)域(Vh)組成。因此，scFv缺乏所有抗體恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域，并且先前的可變/恒定結(jié)構(gòu)域界面的氨基酸殘基(界面殘基)變成溶劑暴露的。scFv可以通過已建立的重組改造技術(shù)由全長抗體(例如IgG分子)制備。然而，全長抗體轉(zhuǎn)變成scFv通常導(dǎo)致蛋白質(zhì)的弱穩(wěn)定性和溶解性、低產(chǎn)量和高聚集趨勢，這增加免疫原性危險。因此，已嘗試改善scFv的性質(zhì)例如溶解性和穩(wěn)定性。例如,Nieba,L.等人(Prot.Eng. (1997) 10 =435-444)選擇已知為界面殘基的3個氨基酸殘基且使其突變。他們觀察到突變的scFv在細菌中周質(zhì)表達增加，以及熱誘導(dǎo)聚集速率減小，盡管熱力學(xué)穩(wěn)定性和溶解性未顯著改變。其中對scFv內(nèi)的特定氨基酸殘基執(zhí)行定點誘變的其他研究也已得到報告(參見例如，Tan，P. H.等人(1988) Biophys. J. 75 1473-1482 ；WftriIjA.和 Pluckthun,A. (1998) Biochem. 37 13120-13127 ； Worn, A.和 Pliickthun，A. (1999) Biochem. 38 8739-8750)。在這些各種研究中，選擇用于誘變的氨基酸殘基基于其在scFv結(jié)構(gòu)內(nèi)的已知位置(例如，來自分子建模研究)進行選擇。在另一種方法中，將來自表達極弱的scFv的互補決定區(qū)(⑶R)移植到已證實具有有利性質(zhì)的 scFv 的構(gòu)架區(qū)內(nèi)(Jung, S.和 Pliickthun, A. (1997) Prot. Eng. 10 :959_966)。所得到的scFv顯示改善的可溶性表達和熱力學(xué)穩(wěn)定性。改造scFv以改善功能性質(zhì)中的進展在例如'Viini , Α.和Pliickthun，A. (2001)J. Mol. Biol. 305 :989-1010中綜述。然而，仍需要允許合理設(shè)計具有優(yōu)良功能性質(zhì)的scFv的新方法，特別是幫助技術(shù)人員選擇潛在有問題的氨基酸殘基用于改造的方法。此外，仍需要改造scFv和其他類型抗體從而賦予改善的功能性質(zhì)，例如增加的穩(wěn)定性和/或溶解性性質(zhì)的方法。發(fā)明概述
本發(fā)明提供了基于穩(wěn)定、可溶SCFv構(gòu)架的序列分析改造免疫結(jié)合劑例如SCFv抗體的方法，所述序列分析允許鑒定在scFv序列內(nèi)對于穩(wěn)定性和/或溶解性潛在有問題的氨基酸和鑒定在此種氨基酸位置處優(yōu)選的氨基酸殘基置換。因此，依照本發(fā)明的方法鑒定的氨基酸殘基可以選擇用于突變，并且可以制備已突變的改造的免疫結(jié)合劑例如scFv，且就改善的功能性質(zhì)例如穩(wěn)定性和/或溶解性進行篩選。本發(fā)明提供“功能共有區(qū)"(functionalconsensus)方法且證實其優(yōu)點,其基于功能性選擇的(functionally_selected)scFv序列數(shù)據(jù)庫的使用，鑒定scFv構(gòu)架內(nèi)的優(yōu)選氨基酸置換。因此，本發(fā)明提供了改造免疫結(jié)合劑(例如scFv)的 方法，其通過使特定構(gòu)架氨基酸位置突變成使用本文描述的“功能共有區(qū)”方法鑒定的特定氨基酸殘基。再進一步地，本發(fā)明提供了基于本文描述的“功能共有區(qū)”方法設(shè)計的scFv構(gòu)架支架，其可以用作目的CDR序列可以插入其內(nèi)以制備針對靶目的抗原的免疫結(jié)合劑例如scFv的構(gòu)架序列。優(yōu)選地，在本發(fā)明的改造方法中使用或由本發(fā)明的改造方法產(chǎn)生的免疫結(jié)合劑是scFv，但其他免疫結(jié)合劑例如全長免疫球蛋白、Fab片段、單結(jié)構(gòu)域抗體(例如Dab)和納米抗體也可以根據(jù)本發(fā)明的方法進行改造。本發(fā)明還包含了根據(jù)改造方法制備的免疫結(jié)合齊U，以及包含所述免疫結(jié)合劑和藥學(xué)上可接受的載體的組合物。在一個方面，本發(fā)明提供了改造免疫結(jié)合劑的方法，所述免疫結(jié)合劑包含(i )重鏈可變區(qū)或其片段，所述重鏈可變區(qū)包含Vh構(gòu)架殘基，和/或(ii )輕鏈可變區(qū)或其片段，所述輕鏈可變區(qū)包含\構(gòu)架殘基，所述方法包括A)選擇在Vh構(gòu)架殘基、' 構(gòu)架殘基或Vh和\構(gòu)架殘基內(nèi)的一個或多個氨基酸位置用于突變；和B)使選擇用于突變的一個或多個氨基酸位置突變，其中選擇用于突變的一個或多個氨基酸位置和在所選擇的一個或多個位置處插入的一個或多個氨基酸殘基在下文進一步詳細描述。下文描述的氨基酸位置編號使用AHo編號系統(tǒng)；使用Kabat編號系統(tǒng)的對應(yīng)位置在本文中進一步描述，并且關(guān)于AHo和Kabat編號系統(tǒng)的換算表在實施例I中闡述。使用標(biāo)準(zhǔn)單字母縮寫編碼闡述氨基酸殘基。在一個實施方案中，其中如果選擇用于突變的一個或多個氨基酸位置在重鏈可變區(qū)，那么突變包括選自下述的一個或多個置換(a)在氨基酸位置I處的Q或E ;(b)在氨基酸位置6處的Q或E ;(c)在氨基酸位置7處的T、S或A，更優(yōu)選T或A，更加優(yōu)選T ；(d)在氨基酸位置10處的A、T、P、V或D，更優(yōu)選T、P、V或D ;(e)在氨基酸位置12處的L或V，更優(yōu)選L ;(f)在氨基酸位置13處的V、R、Q、M或K，更優(yōu)選V、R、Q或M ;(g)在氨基酸位置14處的R、M、E、Q或K，更優(yōu)選R、M、E或Q，更加優(yōu)選R或E ;(h)在氨基酸位置19處的L或V，更優(yōu)選L ；(i )在氨基酸位置20處的R、T、K或N，更優(yōu)選R、T或N，更加優(yōu)選N ；(j)在氨基酸位置21處的I、F、L或V，更優(yōu)選I、F或L，更加優(yōu)選I或L ;(k)在氨基酸位置45處的R或K，更優(yōu)選K;
(I)在氨基酸位置47處的T、P、V、A或R，更優(yōu)選T、P、V或R，更加優(yōu)選R ；(m)在氨基酸位置50處的K、Q、H或E，更優(yōu)選K、H或E，更加優(yōu)選K ；(η)在氨基酸位置55處的M或I，更優(yōu)選I ;(ο)在氨基酸位置77處的K或R，更優(yōu)選K ；(P)在氨基酸位置78處的Α、V、L或I，更優(yōu)選A、L或I，更加優(yōu)選A ；(q)在氨基酸位置82處的E、R、T或Α，更優(yōu)選Ε、Τ或Α，更加優(yōu)選E ;Cr)在氨基酸位置86處的Τ、S、I或L，更優(yōu)選T、S或L，更加優(yōu)選T ； (S)在氨基酸位置87處的D、S、N或G，更優(yōu)選D、N或G，更加優(yōu)選N;(t)在氨基酸位置89處的Α、V、L或F，更優(yōu)選Α、V或F，更加優(yōu)選V;(u)在氨基酸位置90處的F、S、H、D或Y，更優(yōu)選F、S、H或D ;(V)在氨基酸位置92處的D、Q或E，更優(yōu)選D或Q，更加優(yōu)選D ；(w)在氨基酸位置95處的G、N、T或S，更優(yōu)選G、N或T，更加優(yōu)選G ；(X)在氨基酸位置98處的Τ、A、P、F或S，更優(yōu)選Τ、A、P或F，更加優(yōu)選F ；(y)在氨基酸位置103處的R、Q、V、I、M、F或L，更優(yōu)選R、Q、I、M、F或L，更加優(yōu)選Y或L ;和(Z)在氨基酸位置107處的N、S或Α，更優(yōu)選N或S，更加優(yōu)選N。在另一個實施方案中，其中如果選擇用于突變的一個或多個氨基酸位置在輕鏈可變區(qū)，那么突變包括選自下述的一個或多個置換(aa)在氨基酸位置I處的Q、D、L、E、S或I，更優(yōu)選L、E、S或I，更加優(yōu)選L或E ；(bb)在氨基酸位置2處的S、A、Y、I、P或T，更優(yōu)選A、Y、I、P或T，更加優(yōu)選P或T ；(cc)在氨基酸位置3處的Q、V、T或I，更優(yōu)選V、T或I，更加優(yōu)選V或T ;(dd)在氨基酸位置4處的V、L、I或M，更優(yōu)選V或L ;(ee)在氨基酸位置7處的S、E或P，更優(yōu)選S或E，更加優(yōu)選S ；(ff)在氨基酸位置10處的T或I，更優(yōu)選I ;(gg)在氨基酸位置11處的A或V，更優(yōu)選A ;(hh)在氨基酸位置12處的S或Y，更優(yōu)選Y ；(ii)在氨基酸位置14處的T、S或A，更優(yōu)選T或S，更加優(yōu)選T ;(jj)在氨基酸位置18處的S或R，更優(yōu)選S ；(kk)在氨基酸位置20處的T或A，更優(yōu)選A ；(11)在氨基酸位置24處的R或Q，更優(yōu)選Q ;(mm)在氨基酸位置46處的H或Q，更優(yōu)選H;(nn)在氨基酸位置47處的K、R或I，更優(yōu)選R或I，更加優(yōu)選R ；(OO)在氨基酸位置50處的R、Q、K、E、T或M，更優(yōu)選Q、K、E、T或M ;(PP)在氨基酸位置53處的K、T、S、N、Q或P，更優(yōu)選T、S、N、Q或P ;(qq)在氨基酸位置56處的I或M，更優(yōu)選M ;(rr)在氨基酸位置57處的H、S、F或Y，更優(yōu)選H、S或F ;(ss)在氨基酸位置74處的1、￥或1'，更優(yōu)選￥或1\1 ，更加優(yōu)選1';(tt)在氨基酸位置82處的R、Q或K，更優(yōu)選R或Q，更加優(yōu)選R ；
(uu)在氨基酸位置91處的L或F，更優(yōu)選F ；(W)在氨基酸位置92處的G、D、T或A，更優(yōu)選G、D或T，更加優(yōu)選T ；(XX)在氨基酸位置94處的S或N，更優(yōu)選N ；(yy)在氨基酸位置101處的F、Y或S，更優(yōu)選Y或S，更加優(yōu)選S ;和(ZZ)在氨基酸位置 103處的0、？、!13、1^、4、1\￥、5、6或1，更優(yōu)選!13、1^、4、1\V、S、G或I，更加優(yōu)選A或V。在一個實施方案中，重鏈可變區(qū)或其片段是VH3家族的，并且因此，如果選擇用于突變的一個或多個氨基酸位置在VH3家族重鏈可變區(qū)，那么突變包括選自下述的一個或多個置換
(i)在氨基酸位置I處的E或Q，更優(yōu)選Q ;(ii)在氨基酸位置6處的E或Q，更優(yōu)選Q ;(iii)在氨基酸位置7處的T、S或A，更優(yōu)選T或A，更加優(yōu)選T ;(iv)在氨基酸位置89處的A、V、L或F，更優(yōu)選A、V或F，更加優(yōu)選V ;和(V)在氨基酸位置103處的R、Q、V、I、L、M或F，更優(yōu)選R、Q、I、L、M或F，更加優(yōu)選L ；在另一個實施方案中，重鏈可變區(qū)或其片段是VHla家族的，并且因此，如果選擇用于突變的一個或多個氨基酸位置在VHla家族重鏈可變區(qū)，那么突變包括選自下述的一個或多個置換(i)在氨基酸位置I處的E或Q，更優(yōu)選E ;(ii)在氨基酸位置6處的E或Q，更優(yōu)選E ;(iii)在氨基酸位置12處的L或V，更優(yōu)選L ;(iv)在氨基酸位置13處的M或K，更優(yōu)選M ；(V)在氨基酸位置14處的E、Q或K，更優(yōu)選E或Q，更加優(yōu)選E ;(vi)在氨基酸位置19處的L或V，更優(yōu)選L ；(vii)在氨基酸位置21處的I或V，更優(yōu)選I ;(viii)在氨基酸位置90處的F、S、H、D或Y，更優(yōu)選F、S、H或D ;(ix)在氨基酸位置92處的D、Q或E，更優(yōu)選D或Q，更加優(yōu)選D ；(X)在氨基酸位置95處的G、N、T或S，更優(yōu)選G、N或T，更加優(yōu)選G ;和(xi )在氨基酸位置98處的Τ、A、P、F或S，更優(yōu)選Τ、A、P或F，更加優(yōu)選F。在另一個實施方案中，重鏈可變區(qū)或其片段是VHlb家族的，并且因此，如果選擇用于突變的一個或多個氨基酸位置在VHlb家族重鏈可變區(qū)，那么突變包括選自下述的一個或多個置換(i )在氨基酸位置I處的E或Q，更優(yōu)選E ；(ii)在氨基酸位置10處的A、T、P、V或D，更優(yōu)選T、P、V或D ;(iii)在氨基酸位置12處的L或V，更優(yōu)選L ;(iv)在氨基酸位置13處的K、V、R、Q或M，更優(yōu)選V、R、Q或M ;(V)在氨基酸位置14處的E、K、R或M，更優(yōu)選E、R或M，更加優(yōu)選R ；(vi )在氨基酸位置20處的R、T、K或N，更優(yōu)選R、T或N，更加優(yōu)選N ；(vii)在氨基酸位置21處的I、F、V或L，更優(yōu)選I、F或L，更加優(yōu)選L ;
(viii)在氨基酸位置45處的R或K，更優(yōu)選K ；(ix)在氨基酸位置47處的T、P、V、A、R，更優(yōu)選T、P、V或R，更加優(yōu)選R ；(X)在氨基酸位置50處的K、Q、H或E，更優(yōu)選K、H或E，更加優(yōu)選K ；(xi)在氨基酸位置55處的M或I，更優(yōu)選I ;(xii)在氨基酸位置77處的K或R，更優(yōu)選K ；
(xiii)在氨基酸位置78處的A、V、L或I，更優(yōu)選A、L或I，更加優(yōu)選A ;(xiv)在氨基酸位置82處的E、R、T或A，更優(yōu)選E、T或A，更加優(yōu)選E ；(XV)在氨基酸位置86處的T、S、I或L，更優(yōu)選T、S或L，更加優(yōu)選T ；(xvi)在氨基酸位置87處的D、S、N或G，更優(yōu)選D、N或G，更加優(yōu)選N ;和(xvii)在氨基酸位置107處的N、S或A，更優(yōu)選N或S，更加優(yōu)選N。在另一個實施方案中，輕鏈可變區(qū)或其片段是V K I家族的，并且因此，如果選擇用于突變的一個或多個氨基酸位置在V K I家族輕鏈可變區(qū)，那么突變包括選自下述的一個或多個置換(i)在氨基酸位置I處的D、E或I，更優(yōu)選E或I，更加優(yōu)選E ;(ii)在氨基酸位置3處的Q、V或I，更優(yōu)選V或I，更加優(yōu)選V ；(iii)在氨基酸位置4處的V、L、I或M，更優(yōu)選V、L或I，更加優(yōu)選L ；(iv)在氨基酸位置24處的R或Q，更優(yōu)選Q ;(V)在氨基酸位置47處的K、R或I，更優(yōu)選R或I，更加優(yōu)選R ；(vi)在氨基酸位置50處的K、R、E、T、M或Q，更優(yōu)選K、E、T、M或Q ;(vii)在氨基酸位置57處的H、S、F或Y，更優(yōu)選H、S或F，更加優(yōu)選S ；(viii)在氨基酸位置91處的L或F，更優(yōu)選F ;和(ix)在氨基酸位置103處的T、V、S、G或I，更優(yōu)選V、S、G或I，更加優(yōu)選V。在另一個實施方案中，輕鏈可變區(qū)或其片段是Vk 3家族的，并且因此，如果選擇用于突變的一個或多個氨基酸位置在V K 3家族輕鏈可變區(qū)，那么突變包括選自下述的一個或多個置換(i)在氨基酸位置2處的I或T，更優(yōu)選T ;(ii)在氨基酸位置3處的V或T，更優(yōu)選T ;(iii)在氨基酸位置10處的T或I，更優(yōu)選I ;(iv)在氨基酸位置12處的S或Y，更優(yōu)選Y;(V)在氨基酸位置18處的S或R，更優(yōu)選S ;(vi)在氨基酸位置20處的T或A，更優(yōu)選A ；(vii)在氨基酸位置56處的I或M，更優(yōu)選M ;(viii)在氨基酸位置74處的I、V或T，更優(yōu)選V或T，更加優(yōu)選T ;(ix)在氨基酸位置94處的S或N，更優(yōu)選N;(X)在氨基酸位置101處的F、Y或S，更優(yōu)選Y或S，更加優(yōu)選S ;和(xi)在氨基酸位置103處的V、L或A，更優(yōu)選L或A，更加優(yōu)選A。在另一個實施方案中，輕鏈可變區(qū)或其片段是V λ I家族的，并且因此，如果選擇用于突變的一個或多個氨基酸位置在V λ I家族輕鏈可變區(qū)，那么突變包括選自下述的一個或多個置換
(i)在氨基酸位置I處的L、Q、S或E，更優(yōu)選L、S或E，更加優(yōu)選L;(ii)在氨基酸位置2處的S、A、P、I或Y，更優(yōu)選A、P、I或Y，更加優(yōu)選P ;(iii)在氨基酸位置4處的V、M或L，更優(yōu)選V或M，更加優(yōu)選V ；(iv)在氨基酸位置7處的S、E或P，更優(yōu)選S或E，更加優(yōu)選S ；(V)在氨基酸位置11處的A或V，更優(yōu)選A ;(vi)在氨基酸位置14處的T、S或A，更優(yōu)選T或S，更加優(yōu)選T ;(vii)在氨基酸位置46處的H或Q，更優(yōu)選H ；
(viii)在氨基酸位置53處的K、T、S、N、Q或P，更優(yōu)選T、S、N、Q或P ;(ix)在氨基酸位置82處的R、Q或K，更優(yōu)選R或Q，更加優(yōu)選R ；(X)在氨基酸位置92處的G、T、D或A，更優(yōu)選G、T或D，更加優(yōu)選T ;和(xi )在氨基酸位置103處的D、V、T、H或E，更優(yōu)選V、T、H或E，更加優(yōu)選V。在另一個實施方案中，突變進一步包含選自下述的一個或多個(優(yōu)選所有)重鏈置換(i)使用AHo或Kabat編號的氨基酸位置12處的絲氨酸(S)；(ii)使用AHo編號的氨基酸位置103 (使用Kabat編號的氨基酸位置85)處的絲氨酸(S);和(iii)使用AHo編號的氨基酸位置144 (使用Kabat編號的氨基酸位置103)處的絲氨酸(S)或蘇氨酸(T)。在另一個方面，本發(fā)明提供了分離的抗體構(gòu)架支架(例如scFv支架)。例如，在多種實施方案中，本發(fā)明提供了包含如圖9 (SEQ ID N0:1)、

圖10 (SEQ ID NO :2)或圖11(SEQ ID NO :3)中所示的氨基酸序列的分離的重鏈構(gòu)架支架。在另一個示例性實施方案中，本發(fā)明提供了包含如圖 12 (SEQ ID NO :4)、圖 13 (SEQ ID NO :5)或圖 14 (SEQ ID NO
6)中所示的氨基酸序列的分離的輕鏈構(gòu)架支架。此種支架可以用于改造免疫結(jié)合劑，例如scFv抗體。因此，在另一個方面，本發(fā)明提供了改造免疫結(jié)合劑的方法，所述免疫結(jié)合劑包含重鏈和/或輕鏈⑶R1XDR2和⑶R3序列，所述方法包括將重鏈和/或輕鏈⑶R1XDR2和CDR3序列分別插入重鏈構(gòu)架支架內(nèi)。在特定示例性實施方案中，重鏈構(gòu)架支架包含如圖9(SEQ ID NO :1)、圖 10 (SEQ ID NO :2)、圖 11 (SEQ ID NO :3)、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :8或SEQ ID NO :9中所示的氨基酸序列。在一個優(yōu)選實施方案中，重鏈構(gòu)架支架包含如圖9(SEQ ID NO :1)中所示的氨基酸序列。在另一個優(yōu)選實施方案中，重鏈構(gòu)架支架包含如圖10 (SEQ ID NO :2)中所示的氨基酸序列。在另一個優(yōu)選實施方案中，重鏈構(gòu)架支架包含如圖11 (SEQ ID NO :3)中所示的氨基酸序列。在另一個優(yōu)選實施方案中，重鏈構(gòu)架支架包含SEQ ID NO :7的氨基酸序列。在另一個優(yōu)選實施方案中，重鏈構(gòu)架支架包含SEQ ID NO 8的氨基酸序列。在另外一個優(yōu)選實施方案中，重鏈構(gòu)架支架包含SEQ ID NO :9的氨基酸序列。在其他示例性實施方案中，輕鏈構(gòu)架支架包含如圖12 (SEQ ID N0:4)、圖13 (SEQ IDN0:5)、圖 14 (SEQ ID N0:6)、SEQ ID NO 10,SEQ ID N0:11 或 SEQ ID NO :12 中所示的氨基酸序列。在一個優(yōu)選實施方案中，輕鏈構(gòu)架支架包含如圖11 (SEQID NO :4)中所示的氨基酸序列。在另一個優(yōu)選實施方案中，輕鏈構(gòu)架支架包含如圖12 (SEQ ID NO :5)中所示的氨基酸序列。在另一個優(yōu)選實施方案中，輕鏈構(gòu)架支架包含如圖13 (SEQ ID N0:6)中所示的氨基酸序列。在另一個優(yōu)選實施方案中，輕鏈構(gòu)架支架包含如SEQ ID N0:10中所示的氨基酸序列。在另一個優(yōu)選實施方案中，輕鏈構(gòu)架支架包含如SEQ ID NO : 11中所示的氨基酸序列。在另外一個優(yōu)選實施方案中，輕鏈構(gòu)架支架包含如SEQ ID NO :12中所示的氨基酸序列。優(yōu)選地，免疫結(jié)合劑是scFv抗體，盡管如本文所描述的其他免疫結(jié)合劑(例如，全長抗體、Fab、Dab或納米抗體)也可以根據(jù)本發(fā)明的方法進行改造。本發(fā)明還提供了根據(jù)本發(fā)明的方法改造的免疫結(jié)合劑組合物，例如scFv抗體。附圖簡述圖I是概括根據(jù)本發(fā)明的方法的scFv的一般的基于序列的分析的流程圖。在第一個步驟中，提供了待在溶解性和穩(wěn)定性方面進行改善的scFv的序列(框1)，其隨后與抗體序列數(shù)據(jù)庫進行比較(框2)，例如開放源種系序列數(shù)據(jù)庫(例如，Vbase,IMGT ;框3)、開放源成熟抗體序列數(shù)據(jù)庫(例如，KDB ;框4)或全長人穩(wěn)定和可溶scFv片段的數(shù)據(jù)庫(例如，QC ;框5)。 應(yīng)用例如框3中描述的開放源種系序列數(shù)據(jù)庫允許鑒定高度保守的位置，其在進化過程中進行選擇，并且因此被認為促成全長抗體背景中的可變結(jié)構(gòu)域的穩(wěn)定性(框3’)。針對開放源成熟抗體序列數(shù)據(jù)庫4的比較允許鑒定這樣的模式，其代表不依賴于各自的⑶R的穩(wěn)定性、溶解性和/或結(jié)合的改善(框4’)。此外，針對全長人穩(wěn)定和可溶scFv片段的數(shù)據(jù)庫(框5)的比較導(dǎo)致鑒定對于穩(wěn)定性和/或溶解性關(guān)鍵的殘基(特別是在scFv形式中)，以及鑒定這樣的模式，其代表特別是在scFv形式，例如VL和VH組合中不依賴于各自的CDR的穩(wěn)定性、溶解性和/或結(jié)合的改善(框5’)。在下一個步驟中(框6)，用各個數(shù)據(jù)庫中鑒定的最頻繁的合適氨基酸置換關(guān)鍵殘基。最后(框7)，可以在酵母QC系統(tǒng)中進行關(guān)鍵殘基的隨機或偏好性誘變并且隨后就改善的穩(wěn)定性和/或溶解性進行篩選。突變體可以再次經(jīng)歷上文描述的操作(至框2的箭頭)。圖2是用于scFv的基于序列的分析的示例性多步驟方法的流程圖。在第一個步驟中(框1)，基于生物信息學(xué)工具提供的結(jié)果，通過比較每個位置處不同氨基酸的出現(xiàn)情況，測定每一個殘基在構(gòu)架中的頻率。在第二個步驟中，例如通過使用用式D=Sni (ni-1) /N (N-I)計算的辛普森(Simpson’s)指數(shù),定義每個位置處的保守程度。在第三個步驟中，測定了使總體自由能降到最低的最佳置換(例如，通過應(yīng)用玻爾茲曼(Boltzmann’s)定律Δ AGth=-RTln (f親本/f共有區(qū)))。最后(步驟4),測定潛在的穩(wěn)定性突變的作用。為了這個目的，可以考慮因素例如局部和非局部相互作用、規(guī)范殘基(canonical residue)、界面、暴露程度和β-轉(zhuǎn)角傾向。圖3是用于在酵母中選擇穩(wěn)定和可溶scFv的示例性質(zhì)量控制(QC)系統(tǒng)的示意圖。利用這個系統(tǒng)，通過誘導(dǎo)型報告構(gòu)建體的存在(所述構(gòu)建體的表達依賴于穩(wěn)定和可溶scFv-AD-Galllp融合蛋白的存在)選擇在還原環(huán)境中能夠表達穩(wěn)定和可溶scFv的宿主細胞。融合蛋白與Gal4 (1-100)的相互作用形成激活可選標(biāo)記的表達的功能轉(zhuǎn)錄因子(參見圖3A)。不穩(wěn)定和/或不溶性scFv無法形成功能轉(zhuǎn)錄因子并且誘導(dǎo)可選標(biāo)記的表達，并且因此從選擇中排除(圖3B)。即使在其中二硫鍵不折疊的還原條件下，所選擇的scFv也能夠獲得穩(wěn)定和可溶的蛋白質(zhì)折疊，而不穩(wěn)定和/或不溶性scFv趨于去折疊、聚集和/或降解。在氧化條件下，所選擇的scFv仍展現(xiàn)優(yōu)良的溶解性和穩(wěn)定性特征。
圖4是另一個不例性質(zhì)量控制(QC)系統(tǒng)的不意圖。用于選擇可溶和穩(wěn)定scFv的總體概念與圖3描述的相同，然而，在這個形式中，scFv與包含活化結(jié)構(gòu)域(AD)和DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DBD)的功能轉(zhuǎn)錄因子直接融合。圖4A描述了示例性可溶和穩(wěn)定scFv,其當(dāng)與功能轉(zhuǎn)錄因子融合時，不阻礙可選標(biāo)記的轉(zhuǎn)錄。相比之下，圖4B描述了其中不穩(wěn)定scFv與轉(zhuǎn)錄因子融合而產(chǎn)生無功能融合構(gòu)建體的情形，所述構(gòu)建體無法激活可選標(biāo)記的轉(zhuǎn)錄。圖5是體細胞突變前在天然種系序列內(nèi)的特定構(gòu)架(FW)位置處(圖5A)，和在QC系統(tǒng)中選擇的體細胞突變后在成熟抗體序列內(nèi)的相應(yīng)FW位置處(圖5B)的變異性分析的示意圖?？梢再x予種系和QC序列內(nèi)分別的FW位置(例如，高度可變構(gòu)架殘基(“hvFR”))不同的變異性值(即，分別為“G”和“Q”值)。如果對于特定位置G>Q，那么在那個位置處存在有限數(shù)目的合適的穩(wěn)定FW殘基。如果對于特定位置G〈Q，那么這可能表明該殘基已就最佳溶解性和穩(wěn)定性進行了天然選擇。圖6描述了在25_95°C下的熱誘導(dǎo)脅迫后對于ESBA105變體觀察到的變性曲線圖。虛線表示具有至種系共有殘基的回復(fù)突變(V3Q、R47K或V103T)的ESBA-105變體。實線表示包含通過本發(fā)明的方法鑒定的優(yōu)選置換的變體(QC11. 2、QC15. 2和QC23. 2)。 圖7描述了包含共有序列回復(fù)突變(S-2、D-2、D_3)、至丙氨酸(D_l)或QC殘基(QC7. I、QC11. 2、QC15. 2、QC23. 2)的突變的一組ESBA105變體的熱穩(wěn)定性的比較。提供了每種變體的熱穩(wěn)定性(以任意去折疊單位表示)。圖8描述了在25-95°C下的熱誘導(dǎo)脅迫后對于ESBA212變體觀察到的變性曲線圖。虛線表示具有至種系共有殘基的回復(fù)突變(V3Q或R47K)的ESBA-212變體。實線表示親本ESBA212 分子。圖9舉例說明了 VHla家族的scFv構(gòu)架支架。第一行顯示使用Kabat系統(tǒng)的重鏈可變區(qū)編號。第二行顯示使用AHo系統(tǒng)的重鏈可變區(qū)編號。第三行顯示scFv構(gòu)架支架序列(SEQ ID N0:1)，其中在標(biāo)記為“X”的那些位置處，該位置可以由“X”下所列出的任何氨基酸殘基占據(jù)。標(biāo)記為“X”的位置以及標(biāo)記為⑶Rl HlXDR H2和⑶R H3的區(qū)域可以由任
何氨基酸占據(jù)。圖10舉例說明了 VHlb家族的scFv構(gòu)架支架。第一行顯示使用Kabat系統(tǒng)的重鏈可變區(qū)編號。第二行顯示使用AHo系統(tǒng)的重鏈可變區(qū)編號。第三行顯示scFv構(gòu)架支架序列(SEQ ID NO :2)，其中在標(biāo)記為“X”的那些位置處，該位置可以由“X”下所列出的任何氨基酸殘基占據(jù)。標(biāo)記為“X”的位置以及標(biāo)記為⑶Rl HlXDR H2和⑶R H3的區(qū)域可以由任何氨基酸占據(jù)。圖11舉例說明了 VH3家族的scFv構(gòu)架支架。第一行顯示使用Kabat系統(tǒng)的重鏈可變區(qū)編號。第二行顯示使用AHo系統(tǒng)的重鏈可變區(qū)編號。第三行顯示scFv構(gòu)架支架序列(SEQ ID NO :3)，其中在標(biāo)記為“X”的那些位置處，該位置可以由“X”下所列出的任何氨基酸殘基占據(jù)。標(biāo)記為“X”的位置以及標(biāo)記為⑶Rl HlXDR H2和⑶R H3的區(qū)域可以由任
何氨基酸占據(jù)。圖12舉例說明了 V K I家族的scFv構(gòu)架支架。第一行顯示使用Kabat系統(tǒng)的輕鏈可變區(qū)編號。第二行顯示使用AHo系統(tǒng)的輕鏈可變區(qū)編號。第三行顯示scFv輕鏈構(gòu)架支架序列(SEQ ID NO :4)，其中在標(biāo)記為“X”的那些位置處，該位置可以由“X”下所列出的任何氨基酸殘基占據(jù)。標(biāo)記為”的位置以及標(biāo)記為⑶Rl LlXDR L2和⑶R L3的區(qū)域可以由任何氨基酸占據(jù)。圖13舉例說明了 Vk 3家族的scFv構(gòu)架支架。第一行顯示使用Kabat系統(tǒng)的輕鏈可變區(qū)編號。第二行顯示使用AHo系統(tǒng)的輕鏈可變區(qū)編號。第三行顯示scFv輕鏈構(gòu)架支架序列(SEQ ID N0:5)，其中在標(biāo)記為“X”的那些位置處，該位置可以由“X”下所列出的任何氨基酸殘基占據(jù)。標(biāo)記為”的位置以及標(biāo)記為⑶Rl LI、⑶R L2和⑶RL3的區(qū)域可以由任何氨基酸占據(jù)。圖14舉例說明了 VLl家族的scFv構(gòu)架支架。第一行顯示使用Kabat系統(tǒng)的輕鏈可變區(qū)編號。第二行顯示使用AHo系統(tǒng)的輕鏈可變區(qū)編號。第三行顯示scFv輕鏈構(gòu)架支架序列，其中在標(biāo)記為“X”的那些位置處，該位置可以由“X”下所列出的任何氨基酸殘基占據(jù)。標(biāo)記為”的位置以及標(biāo)記為⑶Rl LlXDR L2和⑶R L3的區(qū)域可以由任何氨基酸 占據(jù)。在特定的優(yōu)選實施方案中，在⑶R LI內(nèi)的AHo位置58和67-72分別由下述殘基占據(jù)D 和 NNQRPS。圖15描述了野生型ESBA105及其可溶性變體的PEG沉淀溶解度曲線。圖16描述了如在廣泛溫度范圍(25_96°C)下的熱攻擊后測量的野生型ESBA105及其可溶性變體的熱變性曲線圖。圖17描述了 SDS-PAGE凝膠，其顯示了在熱脅迫條件下溫育2周后各種ESBA105可溶性突變體的降解行為。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及用于免疫結(jié)合劑性質(zhì)，特別地scFv性質(zhì)(包括但不限于穩(wěn)定性、溶解性和/或親和力)的基于序列的改造和優(yōu)化的方法。更具體地，本發(fā)明公開了使用抗體序列分析鑒定scFv中待突變的氨基酸位置來優(yōu)化scFv抗體,從而提高scFv的一個或多個物理性質(zhì)的方法。本發(fā)明還涉及按照本發(fā)明的方法產(chǎn)生的或可獲得的經(jīng)改造的免疫結(jié)合劑例如ScFv0本發(fā)明至少部分基于抗體序列的多個數(shù)據(jù)庫中的各重鏈和輕鏈構(gòu)架位置上的氨基酸頻率的分析。特別地，已將抗體序列數(shù)據(jù)庫(例如，種系抗體序列數(shù)據(jù)庫或成熟抗體數(shù)據(jù)庫，例如Kabat數(shù)據(jù)庫)的頻率分析與因具有期望的功能性質(zhì)而被選擇的scFv序列的數(shù)據(jù)庫的頻率分析相比較。通過給各構(gòu)架位置的變異性程度賦值(例如，通過使用辛普森指數(shù))和通過比較不同類型的抗體序列數(shù)據(jù)庫中的各構(gòu)架位置上的變異性程度，現(xiàn)已能夠鑒定對于scFv的功能性質(zhì)(例如，穩(wěn)定性、溶解性)是重要的構(gòu)架位置。這現(xiàn)允許對構(gòu)架氨基酸位置定義“功能共有區(qū)”，其中已鑒定了比免疫球蛋白序列(例如種系或成熟免疫球蛋白序列)中的相應(yīng)位置更耐受變異性或更不耐受變異性的構(gòu)架位置。因此，本發(fā)明提供基于功能性選擇的scFv序列的數(shù)據(jù)庫的使用的“功能共有區(qū)”方法并證明了其優(yōu)點。此外，本發(fā)明提供了通過突變使用本文中描述的“功能共有區(qū)”方法鑒定的特定構(gòu)架氨基酸位置來對免疫結(jié)合劑(例如，scFv)進行改造的方法。首先定義某些術(shù)語，這樣可使本發(fā)明更容易被理解。除非另外指出，本文中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員通常理解的意義相同的意義。雖然與本文中描述的方法和材料相似或等同的方法和材料可用于本發(fā)明的實踐或試驗中，但下面描述了適當(dāng)?shù)姆椒ê筒牧稀１疚闹刑峒暗乃泄_物、專利申請、專利和其他參考資料以它們的全文通過引用合并入本文。在矛盾的情況下，以本說明書(包括定義)為準(zhǔn)。此外，材料、方法和實施例只是舉例說明性的而非限定性的。本文中使用的術(shù)語“抗體”是免疫球蛋白的同義詞。根據(jù)本發(fā)明的抗體可以是完整的免疫球蛋白或其片段，其包括免疫球蛋白的至少一個可變結(jié)構(gòu)域，例如單個可變結(jié)構(gòu)域，F(xiàn)v (Skerra A.和 Pliickthun, A. (1988) Science240 :1038-41)、scFv (Bird, R. E.等人(1988) Science2M :423-26 ;Huston，J. S.等人(1988 ;Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 5879-83)，F(xiàn)ab、(Fab’ ) 2、或本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的其他片段。本文中使用的術(shù)語“抗體構(gòu)架(antibody framework)”是指可變結(jié)構(gòu)域VL或VH的一部分，其用作該可變結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合環(huán)的支架(Kabat, E. A.等人，(1991) Sequencesof proteins of immunological interest. NIH Publication 91-3242)。本文中使用的“抗體⑶R”是指抗體的互補決定區(qū)，其如Kabat E. A.等人，(1991)Sequences of proteins of immunological interest. NIH Publication 91-3242)定義的由抗原結(jié)合環(huán)組成?？贵wFv片段的兩個可變結(jié)構(gòu)域中的每一個包含例如3個⑶R。 術(shù)語“單鏈抗體”或“scFv”意指包含通過接頭連接的抗體重鏈可變區(qū)(Vh)和抗體輕鏈可變區(qū)(')的分子。此類scFv分子可具有一般結(jié)構(gòu)=NH2-V^接頭-Vh-COOH或NH2-Vh-接頭-VfCOOH。如本文中所使用的，“同一性”是指兩個多肽、分子之間或兩個核酸之間匹配的序列。當(dāng)兩個進行比較的序列中的位置都被相同的堿基或氨基酸單體亞單元占據(jù)(例如，如果兩個DNA分子的每一個中的位置都被腺嘌呤占據(jù)，或兩個多肽的每一個中的位置都被賴氨酸占據(jù))時，各個分子在該位置上是同一的。兩個序列之間的“百分數(shù)同一性”是由這兩個序列共有的匹配位置數(shù)目除以進行比較的位置數(shù)目再乘以100的函數(shù)。例如，如果兩個序列的10個位置中有6個匹配，那么這兩個序列具有60%的同一性。例如，DNA序列CTGACT和CAGGTT共有50%的同一性(總共6個位置中有3個位置匹配)。通常，在將兩個序列比對以產(chǎn)生最大同一性時進行比較。這樣的比對可通過使用，例如，通過計算機程序例如Align程序(DNAstar，Inc.)方便地進行的 Needleman 等人(1970) J. Mol. Biol. 48 :443-453 的方法來提供。“相似的”序列是當(dāng)比對時共有相同和相似氨基酸殘基的序列，其中相似的殘基是進行比對的參照序列中的相應(yīng)氨基酸殘基的保守置換。在這點上，參照序列中的殘基的“保守置換”是用在物理或功能上與相應(yīng)的參照殘基相似(例如具有相似大小、形狀、電荷、化學(xué)性質(zhì)，包括形成共價鍵或氫鍵的能力等)的殘基進行的置換。因此，“經(jīng)保守置換修飾的”序列是與參照序列或野生型序列相異在于存在一個或多個保守置換的序列。兩個序列之間的“百分數(shù)相似性”是包含由兩個序列共有的匹配殘基或保守置換的位置數(shù)目除以進行比較的位置數(shù)目再乘以100的函數(shù)。例如,如果兩個序列的10個位置中有6個匹配以及10個位置中有2個包含保守置換，那么這兩個序列具有80%的正相似性。本文中使用的“氨基酸共有序列”是指可使用至少兩個，優(yōu)選更多的進行比對的氨基酸序列的矩陣產(chǎn)生的氨基酸序列(允許在比對中出現(xiàn)缺口)，其使得可能確定各位置上出現(xiàn)頻率最聞的氣基酸殘基。共有序列是包含在各位置上出現(xiàn)頻率最聞的氣基酸的序列。如果兩個或更多個氨基酸等同地出現(xiàn)在單個位置上，那么共有序列包括兩個或所有此類氨基酸?？稍诓煌缴戏治龅鞍踪|(zhì)的氨基酸序列。例如，可在單個殘基水平、多個殘基水平、具有缺口的多個殘基水平等上展示保守性或變異性。殘基可展示相同殘基的保守性或可在種類水平上保守。氨基酸種類的實例包括極性但不帶電荷的R組(絲氨酸、蘇氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺)；帶正電荷的R組(賴氨酸、精氨酸和組氨酸);帶負電荷的R組(谷氨酸和天冬氨酸);疏水R組(丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、纈氨酸和酪氨酸)；以及特殊氨基酸(半胱氨酸、甘氨酸和脯氨酸)。其他種類對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是已知的并且可使用結(jié)構(gòu)測定法或其他數(shù)據(jù)來定義以估量可置換性。在該意義上，可置換的氨基酸可以指可在該位置上進行置換并且保持功能保守性的任何氨基酸。如本文中所使用的，當(dāng)一個氨基酸序列(例如，第一 Vh或\序列)與一個或多個另外的氨基酸序列(例如，數(shù)據(jù)庫中的一個或多個VH或VL序列)比對時，可將一個序列(例如，第一 Vh或\序列)中的氨基酸位置與一個或多個另外的氨基酸序列中的“相應(yīng)位置”相比較。如本文中所使用的，“相應(yīng)位置”表示當(dāng)對序列進行最優(yōu)比對時，即當(dāng)序列進行比對以獲得最高百分數(shù)同一性或百分數(shù)相似性時進行比較的序列中的等同位置。如本文中所使用的，術(shù)語“抗體數(shù)據(jù)庫”是指兩個或更多個抗體氨基酸序列(“多 個”序列)的集合，通常是指數(shù)十個、數(shù)百個或甚至數(shù)千個抗體氨基酸序列的集合?？贵w數(shù)據(jù)庫可存儲例如抗體Vh區(qū)、抗體' 區(qū)或兩者的集合的氨基酸序列，或可存儲由V1^P \區(qū)域組成的scFv序列的集合。優(yōu)選，可將數(shù)據(jù)庫存儲在可檢索的、固定的介質(zhì)中，例如計算機上可檢索的計算機程序中。在一個實施方案中，抗體數(shù)據(jù)庫是包含或由種系抗體序列組成的數(shù)據(jù)庫。在另一個實施方案中，抗體數(shù)據(jù)庫是包含或由成熟(即，表達的)抗體序列組成的數(shù)據(jù)庫(例如，成熟抗體序列的Kabat數(shù)據(jù)庫，例如KBD數(shù)據(jù)庫)。在另一個實施方案中，抗體數(shù)據(jù)庫包含或由功能性選擇的序列(例如，根據(jù)QC測定選擇的序列)組成。術(shù)語“免疫結(jié)合劑”是指分子，所述分子包含抗體的全部或部分抗原結(jié)合位置，例如重鏈和/或輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的全部或一部分，這樣免疫結(jié)合劑能夠特異性識別靶抗原。免疫結(jié)合劑的非限定性實例包括全長免疫球蛋白分子和scFv，以及抗體片段，包括但不限于⑴Fab片段，由Vh、(^和ChI結(jié)構(gòu)域組成的單價片段；(ii)F(ab’)2片段，包含通過鉸鏈區(qū)上的二硫橋連接的兩個Fab片段的二價片段，(iii)Fab'片段，其基本上是具有鉸鏈區(qū)的一部分的 Fab (參見，F(xiàn)UNDAMENTAL IMMUNOLOGY (Paul 編輯，3. sup. rd ed. 1993) ; (iv)由Vh和ChI結(jié)構(gòu)域組成的Fd片段；(V)由抗體的單臂的\和Vh結(jié)構(gòu)域組成的Fv片段；(vi)單結(jié)構(gòu)域抗體例如Dab片段(Ward等人，(1989)Nature 341 :544-546),其由Vh或Vl 結(jié)構(gòu)域組成，Camelid (SlHamers-Casterman,等人，Nature 363:446-448 (1993)和 Dumoulin 等人，Protein Science 11 :500-515 (2002))或 Shark 抗體(例如，sharkIg-NARs ISianohodk1S^));和(vii)納米抗體(Nanobody),包含單個可變結(jié)構(gòu)域和兩個恒定結(jié)構(gòu)域的重鏈可變區(qū)。如本文中所使用的，術(shù)語“功能性質(zhì)”是例如為了提高多肽的生產(chǎn)性質(zhì)或治療功效，其提高(例如相對于常規(guī)多肽)對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是期望的和/或有利的多肽(例如，免疫結(jié)合劑)的性質(zhì)。在一個實施方案中，功能性質(zhì)是提高的穩(wěn)定性(例如，熱穩(wěn)定性)。在另一個實施方案中，功能性質(zhì)是提高的溶解性(例如，在細胞條件下)。在另一個實施方案中，功能性質(zhì)是非聚集性。在另一個實施方案中，功能性質(zhì)是表達(例如，在原核細胞中)的提高。在另一個實施方案中，功能性質(zhì)是在內(nèi)含體純化方法后重折疊產(chǎn)量的提高。在某些實施方案中，功能性質(zhì)不是抗原結(jié)合親和力的提高。
scFv的某于序列的分析本發(fā)明提供了用于分析scFv序列的方法，其允許鑒定scFv序列中選擇用于突變的氨基酸位置。選擇用于突變的氨基酸位置是經(jīng)預(yù)測影響scFv的功能性質(zhì)例如溶解性、穩(wěn)定性和/或抗原結(jié)合的氨基酸位置，其中預(yù)測該位置上的突變提高scFv的性能。因此，本發(fā)明允許對scFv進行比簡單隨機突變scFv序列中的氨基酸位置更集中的改造以優(yōu)化性能。在圖I的流程圖中示意性地圖解了 scFv序列的基于序列的分析的某些方面。如該圖中所示的，將要優(yōu)化的scFv序列與一個或多個抗體數(shù)據(jù)庫(包括由因穩(wěn)定和可溶而被選擇的scFv序列組成的抗體數(shù)據(jù)庫)中的序列相比較。這可允許鑒定特別地scFv形式中對于穩(wěn)定性和/或溶解性至關(guān)重要的殘基，以及鑒定特別地在scFv形式(例如，Vl和Vh的組合)中顯示不依賴于各自CDR的穩(wěn)定性、溶解性和/或結(jié)合的提高的模式。在鑒定了至關(guān)重要的殘基后，它們就可用例如在各自數(shù)據(jù)庫中鑒定的出現(xiàn)頻率最高的適當(dāng)?shù)陌被徇M行置換，和/或通過隨機或偏好性誘變進行置換。
因此，在一個方面，本發(fā)明涉及鑒定單鏈抗體(scFv)中用于突變的氨基酸位置的方法，所述scFv具有Vh和\氨基酸序列，該方法包括a)將scFv VH,VL或Vh和\氨基酸序列輸入包含許多抗體VH、'或Vh和\氨基酸序列的數(shù)據(jù)庫，以使scFv VH、Vl或Vh和\氨基酸序列與數(shù)據(jù)庫的抗體VH、Vl或Vh和\氨基酸序列比對；b)將scFv Vh或\氨基酸序列中的氨基酸位置與數(shù)據(jù)庫的抗體Vh或\氨基酸序列中的相應(yīng)位置相比較；c)確定scFv Vh或\氨基酸序列中的氨基酸位置是否被在數(shù)據(jù)庫的抗體Vh或\氨基酸序列中的相應(yīng)位置上保守的氨基酸殘基占據(jù)；和d)當(dāng)氨基酸位置被在數(shù)據(jù)庫的抗體Vh或'氨基酸序列中的相應(yīng)位置上不保守的氨基酸殘基占據(jù)時，將scFv Vh或'氨基酸序列中的氨基酸位置鑒定為用于突變的氨基酸位置。因此，在本發(fā)明的方法中，將目的scFv的序列(S卩，VH、'或兩者的序列)與抗體數(shù)據(jù)庫的序列相比較，然后確定目的scFv中的氨基酸位置是否被在數(shù)據(jù)庫中的序列的相應(yīng)位置上“保守的”氨基酸殘基占據(jù)。如果scFv序列的氨基酸位置被在數(shù)據(jù)庫的序列中的相應(yīng)位置上不“保守的”氨基酸殘基占據(jù)，則scFv的該氨基酸位置選擇用于突變。優(yōu)選，被分析的氨基酸位置是目的scFv中的構(gòu)架氨基酸位置。更優(yōu)選，可分析目的scFv中的每一個構(gòu)架氨基酸位置。在備選的實施方案中，可分析目的scFv的一個或多個CDR中的一個或多個氨基酸位置。在另外的實施方案中，可分析目的scFv中的各氨基酸位置。為了確定氨基酸殘基在抗體數(shù)據(jù)庫的序列中的特定氨基酸位置(例如，構(gòu)架位置)上是否“保守”，可計算在特定位置上的保守程度。存在許多不同的本領(lǐng)域內(nèi)已知的可定量給定的位置上的氨基酸多樣性的方法，其全都可用于本發(fā)明的方法。優(yōu)選，使用辛普森多樣性指數(shù)計算保守程度，該指數(shù)是多樣性的量度。其考慮到存在于各位置上的氨基酸的數(shù)目，以及各氨基酸的相對豐度(abundance)。辛普森指數(shù)(S. I.)代表兩個隨機選擇的抗體序列在某些位置包含相同的氨基酸的概率。當(dāng)測量保守性時，辛普森指數(shù)考慮了兩個主要因素，豐富度(richness)和均勻度(evenness)。如本文中所使用的，“豐富度”是存在于特定位置上的氨基酸的不同種類的數(shù)目的量度(即，數(shù)據(jù)庫中在該位置上顯示的不同氨基酸殘基的數(shù)目是豐富度的量度)。如本文中所使用的，“均勻度”是存在于特定位置上的氨基酸中的每一個的豐度的量度(即，數(shù)據(jù)庫的序列中氨基酸殘基在該位置上發(fā)生的頻率是均勻度的量度)。雖然殘基豐富度獨自可用作檢查特定位置上的保守程度的量度，但其沒有考慮存在于某些位置上的各氨基酸殘基的相對頻率。其對在數(shù)據(jù)庫的序列中的特定位置上極少發(fā)生的氨基酸殘基與對在相同位置以極高的頻率發(fā)生的殘基給予同樣的權(quán)重。均勻度是組成位置的豐富度的不同氨基酸的相對豐度的量度。辛普森指數(shù)將兩者(豐富度和均勻度)都考慮到了，從而是按照本發(fā)明定量保守程度的優(yōu)選方法。特別地，在非常保守的位置上的低頻率殘基被認為是潛在有問題的，從而其可選擇用于突變。辛普森指數(shù)的公式為D= Σ Iii (Iii-I) /N(N-I)，其中N是調(diào)查的序列(例如，在數(shù)據(jù)庫中)的總數(shù)，Iii是各氨基酸殘基在被分析的位置上的頻率。氨基酸事件(i)在數(shù)據(jù)庫中的頻率是氨基酸在數(shù)據(jù)庫中發(fā)生的次數(shù)00。計數(shù)Iii本身以相對頻率給出，其表示它們按照事 件的總數(shù)進行了標(biāo)準(zhǔn)化。當(dāng)最大多樣性發(fā)生時，S. I.值是0，當(dāng)最小多樣性發(fā)生時，S. I.值是I。因此S.I.的范圍是O至1，多樣性和指數(shù)值呈負相關(guān)。在圖2中更詳細地描述了概述用于分析數(shù)據(jù)庫的序列中的構(gòu)架氨基酸位置的多個步驟的流程圖。因此，在上述方法的優(yōu)選實施方案中，使用辛普森指數(shù)給數(shù)據(jù)庫的抗體Vh或 '氨基酸序列中的相應(yīng)位置的保守程度賦值。該相應(yīng)位置的S. I.值可用作該位置的保守性的指標(biāo)。在其他實施方案中，將密切相關(guān)的抗體序列的可信比對(trusted alignment)(即，考慮蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)相似性的序列比對)，用于本發(fā)明以產(chǎn)生氨基酸的相對豐度和確定的位置的保守程度的矩陣。這些矩陣經(jīng)設(shè)計用于抗體-抗體數(shù)據(jù)庫比較。計算各殘基的觀察到的頻率，并且將其與預(yù)期的頻率(其基本上是數(shù)據(jù)集中各殘基對于各位置的頻率)相比較。使用所述方法對給定的scFv抗體進行的分析提供了關(guān)于給定的scFv抗體中的某些位置上的生物學(xué)上允許的突變和罕見殘基的信息，以及允許預(yù)測其構(gòu)架中的潛在弱點?？蓪⒊Ｒ?guī)技術(shù)用于對“最佳”擬合一組氨基酸-頻率數(shù)據(jù)的氨基酸置換進行工程設(shè)計(使用
S.I.值和相對頻率作為標(biāo)準(zhǔn))。上述基于序列的分析可用于scFv的Vh區(qū)域，scFv的\區(qū)域或兩者。因此，在一個實施方案中，將scFv Vh氨基酸序列輸入數(shù)據(jù)庫并且與數(shù)據(jù)庫的抗體Vh氨基酸序列比對。在另一個實施方案中，將scFv '氨基酸序列輸入數(shù)據(jù)庫并且與數(shù)據(jù)庫的抗體'氨基酸序列比對。在另一個實施方案中，將scFv V1^P'氨基酸序列輸入數(shù)據(jù)庫并且與數(shù)據(jù)庫的抗體Vh和\氨基酸序列比對。用于將一個序列與數(shù)據(jù)庫中的其他序列的集合進行比對的算法在本領(lǐng)域內(nèi)已良好地建立。將序列進行比對以獲得序列之間的最高百分數(shù)同一性或相似性。本發(fā)明的方法可用于分析scFv序列中的一個目的氨基酸位置或更優(yōu)選，可用于分析多個目的氨基酸位置。因此，在上述方法的步驟b)中，可將scFv VH*'氨基酸序列中的多個氨基酸位置與數(shù)據(jù)庫的抗體Vh或\氨基酸序列中的相應(yīng)位置相比較。要分析的優(yōu)選位置是scFv的Vh和/或\序列中的構(gòu)架位置(例如，可分析各VH和VL構(gòu)架位置)。另外或備選地，可分析scFv的一個或多個⑶R中的一個或多個位置(雖然突變⑶R中的氨基酸位置可能不是優(yōu)選的，因為CDR中的突變比構(gòu)架區(qū)中的突變更可能影響抗原結(jié)合活性)。此外，本發(fā)明的方法允許分析scFv VH、'或Vh和'氨基酸序列中的各氨基酸位置。在本發(fā)明的方法中，可將目的scFv的序列與多種不同類型的抗體序列數(shù)據(jù)庫的一種或多種中的序列相比較。例如，在一個實施方案中，數(shù)據(jù)庫的抗體VH、'或Vh和\氨基酸序列是種系抗體VH、Vl或Vh和\氨基酸序列。在另一個實施方案中，數(shù)據(jù)庫的抗體VH、Vl或Vh和\氨基酸序列是重排的親和力成熟的抗體VH、'或Vh和\氨基酸序列。在另一個優(yōu)選實施方案中，數(shù)據(jù)庫的抗體VH、'或Vh和\氨基酸序列是因具有至少一種期望的功能性質(zhì)例如scFv穩(wěn)定性或scFv溶解性而被選擇(下面進一步論述的)的scFv抗體VtnVlj或％和\氨基酸序列。可從種系序列的序列比對或從天然發(fā)生的任何其他抗體序列獲得、匯編和/或產(chǎn)生抗體序列信息。序列的來源可包括但不限于一種或多種下列數(shù)據(jù)庫 · Kabat 數(shù)據(jù)庫(· immuno. bme. nwu. Edu (到 2007 年 10 月為止)；Johnson 和 Wu(2001) Nucleic Acids Res. :205-206 ;Johnson 和 Wu (2000) Nucleic Acids Res. 28 214-218)。來自2000年的原始數(shù)據(jù)可通過在美國的FTP和在英國的鏡像獲得。·Kabatman包含允許用戶就序列的罕見特征檢索Kabat序列和使用戶能夠發(fā)現(xiàn)對于特定抗體序列中的⑶R的正則分配(canonical assignment)的數(shù)據(jù)庫。· AAAAA 網(wǎng)站(www. bioc. unizh. ch/antibody/ (到 2007 年 10 月為止))，由Annemarie Honegger制作的提供關(guān)于抗體的序列信息和結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)的抗體網(wǎng)頁?！?ABG :抗體的 3D 結(jié)構(gòu)的目錄(directory)-由 Antibody Group (ABG)產(chǎn)生的目錄允許用戶訪問匯編在Protein Data Bank (PDB)中的抗體結(jié)構(gòu)。在該目錄中，各PDB條目(entry)具有至原始來源的超鏈接，從而使重新獲得全部信息變得容易。· ABG 小鼠VH和VK種系區(qū)段的種系基因目錄，在Instituto deBiotecnologia, UNAM(National University of Mexico)的 Antibody Group 的網(wǎng)頁的一部分。· IMGT ，國際免疫遺傳學(xué)信息系統(tǒng)馨(international ImMunoGeneTicsinformation system )-由 Marie-Paule Lefranc (UniversiteMontpellier II, CNRS)于1989年創(chuàng)建，IMGT是專門于人和其他脊椎動物物種的免疫系統(tǒng)的免疫球蛋白、T細胞受體和相關(guān)蛋白質(zhì)的集成知識資源。IMGT由序列數(shù)據(jù)庫(IMGT/LIGM-DB，來自人和其他脊椎動物的IG和TR的綜合數(shù)據(jù)庫，具有完全注釋的序列的翻譯，IMGT/MHC-DB, IMGT/PRIMER-DB)、基因組數(shù)據(jù)庫(MGT/GENE-DB)、結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫aMGT/3Dstructure_DB)、網(wǎng)絡(luò)資源(MGTRepertoire)組成(IMGT, the international ImMunoGeneTics information S》...Stem ;imgt.cines.fr (到 2007 年 10 月為止)；Lefranc 等人(1999) Nucleic Acids Res. 27 209-212 ;Ruiz 等人(2000)Nucleic Acids Res. 28 :219-221 ;Lefranc 等人(2001)NucleicAcids Res. 29 :207-209 ;Lefranc 等人(2003) Nucleic Acids Res. 31 :307_310)?！う?BASE -從一千多個公開序列(包括目前從Genbank和EMBL數(shù)據(jù)庫釋放的序列)匯編的所有人種系可變區(qū)序列的綜合目錄。在優(yōu)選實施方案中，從scFv文庫獲得抗體序列信息，所述scFv文庫具有已在還原性環(huán)境中就增強的穩(wěn)定性和溶解性進行選擇的確定的構(gòu)架。更特別地，已描述了允許細胞內(nèi)選擇在還原性環(huán)境中具有增強的穩(wěn)定性和溶解性的scFv構(gòu)架的酵母質(zhì)量控制(QC)-系統(tǒng)(參見例如，PCT
發(fā)明者D·尤里奇, L·博拉斯 申請人:艾斯巴技術(shù),愛爾康生物醫(yī)藥研究裝置有限責(zé)任公司