專利名稱：利用旋轉(zhuǎn)組合模具制備紡錘狀復(fù)雜器官前體的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物體復(fù)雜組織器官的人工制造技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及利用合成高分子材料、細胞基質(zhì)材料制備組織器官前體的工藝方法，超出了目前組織工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
組織工程學(xué)是由美國國家科學(xué)基金委員會于1987年正式提出和確定的，是應(yīng)用細胞生物學(xué)、生物材料和工程學(xué)的原理，研究開發(fā)用于修復(fù)或改善人體病損組織或器官的結(jié)構(gòu)、功能的生物活性替代物的一門科學(xué)。Wolter在1984年正式提出“組織工程” 一詞，1987年美國國家科學(xué)基金委員會正式確定組織工程學(xué)成為一門新學(xué)科。在現(xiàn)今的醫(yī)療過程中，器官移植術(shù)已經(jīng)成為一種重要的治療手段，但是移植器官來源的短缺長久困擾該項技術(shù)的應(yīng)用。以我國為例，近年來，每年需要進行各種器官移植的 患者約有150萬人，但可移植器官數(shù)量不到I. 5萬份。除開供源的不足，器官移植術(shù)亦面臨一定的道德與法律等非醫(yī)學(xué)因素困境。移植器官來源問題以及非醫(yī)學(xué)因素困境，即使從長期來看，亦是不易解決的，但是，通過復(fù)雜組織器官制造技術(shù)，以自體干細胞生成供移植的器官，從理論上來講，可以克服器官移植中供源不足以及排異反應(yīng)等問題，同時，也可以規(guī)避現(xiàn)階段器官移植所需面對的非醫(yī)學(xué)因素困境。申請?zhí)枮?01110448154. 3的發(fā)明專利《基于一種組合模具的復(fù)雜器官前體的制備方法》中提供了一種多分支及多層結(jié)構(gòu)的復(fù)雜組織器官前體的制備方法，也是利用組合模具的分層灌注來成形含多分支結(jié)構(gòu)的復(fù)雜組織器官前體。該發(fā)明的缺點在于采用直接拆模的方式對模具的內(nèi)部形狀及表面粗糙度要求較高，同時在成形過程中由于高分子溶液充滿型腔，交聯(lián)劑或聚合劑與材料接觸面過少，容易影響交聯(lián)或聚合效果，繼而影響細胞基質(zhì)層的成形效果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是利用旋轉(zhuǎn)組合模具的方法制備紡錘狀復(fù)雜器官前體，以克服目前組織工程領(lǐng)域存在的細胞很難滲入到三維支架中、含多種細胞的支架成形不易等缺點；同時避免模具的內(nèi)部形狀及表面粗糙度對成形的影響，使成形過程更加穩(wěn)定、可靠。本發(fā)明的技術(shù)方案如下一種利用旋轉(zhuǎn)組合模具制備紡錘狀復(fù)雜器官前體的方法，其特征在于該方法包括如下步驟進行I)將不同天然高分子溶液與不同動物體細胞懸浮液分別按I 9 :9 I體積比混合制成多種細胞基質(zhì)溶液；天然高分子溶液的質(zhì)量百分濃度為1% 30% ;2)將內(nèi)模具底部插入陣列孔板的孔洞中，陣列孔板鑲嵌在底座模具底層，底座模具采用從下至上的多層臺階結(jié)構(gòu)，內(nèi)模具采用多級分支結(jié)構(gòu)，且各級內(nèi)環(huán)模具厚度與底座模具對應(yīng)的臺階寬度相同；將第一級內(nèi)環(huán)模具套在底座模具的第一級臺階上，之后將其中一種細胞基質(zhì)溶液灌注到內(nèi)模具和第一級內(nèi)環(huán)模具之間的縫隙中，使底座模具、內(nèi)模具和陣列孔板一起旋轉(zhuǎn)并使第一級內(nèi)環(huán)模具保持不動，使細胞基質(zhì)溶液形成半紡錘狀外形，旋轉(zhuǎn)過程中采用物理或化學(xué)交聯(lián)或聚合方法，使細胞基質(zhì)溶液中的天然高分子交聯(lián)，去除第一級內(nèi)環(huán)模具，形成穩(wěn)定的第一層細胞基質(zhì)層；3)將第二級內(nèi)環(huán)模具套在底座模具的第二級臺階上，將另一種細胞基質(zhì)溶液灌注到第一層細胞基質(zhì)層和第二級內(nèi)環(huán)模具之間的縫隙中，使底座模具、內(nèi)模具和陣列孔板一起旋轉(zhuǎn)并使第二級內(nèi)環(huán)模具保持不動，使細胞基質(zhì)溶液形成半紡錘狀外形，旋轉(zhuǎn)過程中采用物理或化學(xué)交聯(lián)或聚合方法，使細胞基質(zhì)溶液中的天然高分子交聯(lián)，去除第二級內(nèi)環(huán)模具，形成穩(wěn)定的第二層細胞基質(zhì)層；4)重復(fù)步驟2)與步驟3)，得到含不同動物體細胞的多層細胞基質(zhì)層結(jié)構(gòu)；5)將合成高分子材料溶于有機溶劑中制成質(zhì)量百分濃度為5% 30%的合成高分子溶液； 6)將外環(huán)模具套在底座模具的最外級臺階上，將合成高分子溶液灌入步驟4)中得到的多層細胞基質(zhì)層結(jié)構(gòu)與外環(huán)模具的縫隙中，使底座模具、內(nèi)模具和陣列孔板一起旋轉(zhuǎn)并使外環(huán)模具保持不動，使合成高分子溶液形成半紡錘狀外形，旋轉(zhuǎn)過程中用細胞培養(yǎng)液或PBS萃取合成高分子溶液中的溶劑，形成外層合成高分子材料層，然后依次去除外環(huán)模具、底座模具和內(nèi)模具，制成含多分支通道的半紡錘狀復(fù)雜器官前體；7)將兩個半紡錘體通過天然或合成高分子溶液滲透粘連合并在一起，形成具有內(nèi)分支管道的完整紡錘狀復(fù)雜器官前體。所述的一種利用旋轉(zhuǎn)組合模具制備復(fù)雜器官前體的方法，其特征在于所述的細胞基質(zhì)層與合成高分子材料層在成形過程中，底座模具連同內(nèi)模具與陣列孔板的旋轉(zhuǎn)速度為 5 IOOr /min。所述的一種利用旋轉(zhuǎn)組合模具制備復(fù)雜器官前體的方法，其特征在于所述的內(nèi)模具由尼龍、合成纖維、聚乙烯、聚碳酸酯、聚氯乙烯或聚氨酯軟性材料制成的實心管組合而成，內(nèi)模具級數(shù)為I 10，每級分支數(shù)為2 100 ;內(nèi)模具最末級分支的直徑范圍在O. Imm 5mmο所述的一種利用旋轉(zhuǎn)組合模具制備復(fù)雜器官前體的方法，其特征在于底座模具的臺階從各級臺階寬度相同或不同，臺階的級數(shù)為2 20 ;底座模具外形及各級臺階截面為圓型；底座模具的材料為金屬或是硬質(zhì)合成高分子材料。所述的一種利用旋轉(zhuǎn)組合模具制備紡錘狀復(fù)雜器官前體的方法，其特征在于在細胞基質(zhì)溶液中加入凍存保護劑，所述的凍存保護劑采用甘油、二甲基亞砜、乙二醇和葡聚糖中的一種或兩種材料的混合物。所述的一種利用旋轉(zhuǎn)組合模具制備復(fù)雜器官前體的方法，其特征在于在細胞基質(zhì)溶液中加入細胞生長因子及抗凝血因子。所述的一種利用旋轉(zhuǎn)組合模具制備復(fù)雜器官前體的方法，其特征在于所述的細胞生長因子采用內(nèi)皮細胞生長因子、細胞轉(zhuǎn)移因子或肝細胞生長因子；抗凝血因子采用肝素、紫杉醇或硫酸化殼聚糖。所述的一種利用旋轉(zhuǎn)組合模具制備復(fù)雜器官前體的方法，其特征在于所述的合成高分子材料采用聚氨酯、聚乳酸、聚酯和乳酸與乙醇酸共聚物中的一種或幾種材料的復(fù)合物。所述的一種利用旋轉(zhuǎn)組合模具制備復(fù)雜器官前體的方法，其特征在于所述的天然高分子材料采用明膠、纖維蛋白原、膠原、殼聚糖、海藻酸鈉、透明質(zhì)酸和纖粘連蛋白中的一種或幾種材料的復(fù)合物。所述的一種利用旋轉(zhuǎn)組合模具制備復(fù)雜器官前體的方法，其特征在于步驟I)中用于溶解所述天然高分子材料的溶劑采用水、生理鹽水、PBS溶液、pH = 6 8的O. 09M氯化鈉、3 —羥甲基氨基甲烷鹽酸溶液或細胞培養(yǎng)液；步驟5)中用于溶解所述合成高分子材料的有機溶劑采用四乙二醇、乙二醇、異丙醇或1，4-二氧六環(huán)。本發(fā)明利用旋轉(zhuǎn)成形時非牛頓流體的Weissenbery效應(yīng)可形成天然的半紡錘狀結(jié)構(gòu)，同時避免了模具的內(nèi)部形狀及表面粗糙度對成形的影響，增加了交聯(lián)劑或聚合劑與材料的接觸面積、使成形過程更加穩(wěn)定、可靠。本發(fā)明可成形含不同細胞與合成高分子支架的復(fù)雜含多分支通道的紡錘狀三維結(jié)構(gòu)，克服了目前組織工程領(lǐng)域存在的細胞很難滲入到三維支架中、含多種細胞的支架成形不易等缺點。


圖I是成形第一層細胞基質(zhì)層時的模具剖面圖(以單級分支雙層結(jié)構(gòu)為例)。圖2成形合成高分子材料層時的模具剖面圖(以單級分支雙層結(jié)構(gòu)為例)。圖3是成形后的半紡錘狀前體剖面圖(以單級分支雙層結(jié)構(gòu)為例)。圖4是內(nèi)模具的三維效果圖(以三級分支為例)。圖5a是是底座模具的俯視圖；圖5b是底座模具的側(cè)視剖面圖(以二級臺階為例)。圖6是陣列孔板的俯視圖(以16孔為例)。圖7內(nèi)環(huán)模具的側(cè)視剖面圖(外環(huán)模具結(jié)構(gòu)相似)。圖8a是轉(zhuǎn)速為a的成形效果圖；圖8b是轉(zhuǎn)速為b的成形效果圖；圖8c是轉(zhuǎn)速為c的成形效果圖(a〈b〈c)。在圖I至圖8中I 一內(nèi)模具；2 —陣列孔板；3 —底座模具；4 一內(nèi)環(huán)模具；5 —細胞基質(zhì)層；6 —外環(huán)模具-J 一合成高分子材料層。具體實施方法本發(fā)明提供的一種利用旋轉(zhuǎn)組合模具制備紡錘狀復(fù)雜器官前體，其具體工藝步驟如下I)將不同天然高分子溶液與不同動物體細胞懸浮液按I 9 :9 I體積比混合制成多種細胞基質(zhì)溶液；天然高分子溶液的質(zhì)量百分濃度為1% 30% ;2)將內(nèi)模具I底部插入陣列孔板2的孔洞中，陣列孔板2鑲嵌在底座模具3底層，底座模具3采用從下至上的多層臺階結(jié)構(gòu)，內(nèi)模具I采用多級分支結(jié)構(gòu)，且各級內(nèi)環(huán)模具
(4)厚度與底座模具(3)對應(yīng)的臺階寬度相同；將第一級內(nèi)環(huán)模具4a套在底座模具3的第一級臺階上，之后將其中一種細胞基質(zhì)溶液灌注到內(nèi)模具I和第一級內(nèi)環(huán)模具4a之間的縫隙中，使底座模具3、內(nèi)模具I和陣列孔板2 —起旋轉(zhuǎn)并使第一級內(nèi)環(huán)模具4a保持不動，使細胞基質(zhì)溶液形成半紡錘狀外形，旋轉(zhuǎn)過程中采用物理或化學(xué)交聯(lián)或聚合方法，使細胞基質(zhì)溶液中的天然高分子交聯(lián)，去除第一級內(nèi)環(huán)模具4a，形成穩(wěn)定的第一層細胞基質(zhì)層5a;具體成形過程示意圖如圖I所示(以單級分支雙層結(jié)構(gòu)為例)；3)將第二級內(nèi)環(huán)模具4b套在底座模具3的第二級臺階上，將另一種細胞基質(zhì)溶液灌注到第一層細胞基質(zhì)層5a和第二級內(nèi)環(huán)模具4b之間的縫隙中，使底座模具3、內(nèi)模具I和陣列孔板2 —起旋轉(zhuǎn)并使第二級內(nèi)環(huán)模具4b保持不動，使細胞基質(zhì)溶液形成半紡錘狀外形，旋轉(zhuǎn)過程中采用物理或化學(xué)交聯(lián)或聚合方法，使細胞基質(zhì)溶液中的天然高分子交聯(lián)，去除第二級內(nèi)環(huán)模具4b，形成穩(wěn)定的第二層細胞基質(zhì)層5b ；4)重復(fù)步驟2)與步驟3)，得到含不同動物體細胞的多層細胞基質(zhì)層結(jié)構(gòu)；5)將合成高分子材料溶于有機溶劑中制成質(zhì)量百分濃度為5% 30%的合成高分子溶液；6)將外環(huán)模具6套在底座模具3的最外級臺階上，將合成高分子溶液灌入步驟4) 中得到的多層細胞基質(zhì)層結(jié)構(gòu)與外環(huán)模具6的縫隙中，使底座模具3、內(nèi)模具I和陣列孔板
2一起旋轉(zhuǎn)并使外環(huán)模具6保持不動，使合成高分子溶液形成半紡錘狀外形，旋轉(zhuǎn)過程中用細胞培養(yǎng)液或PBS萃取合成高分子溶液中的溶劑，形成外層合成高分子材料層7，具體成形過程示意圖如圖2所示(以單級分支雙層結(jié)構(gòu)為例)；然后依次去除外環(huán)模具6、底座模具3和內(nèi)模具1，制成含多分支通道的半紡錘狀復(fù)雜器官前體，結(jié)構(gòu)如圖3所示(以單級分支雙層結(jié)構(gòu)為例)；7)將兩個半紡錘體通過天然或合成高分子溶液滲透粘連合并在一起，形成具有內(nèi)分支管道的完整紡錘狀復(fù)雜器官前體。本發(fā)明的優(yōu)選方案是在細胞基質(zhì)溶液中加入凍存保護劑，所述的凍存保護劑采用甘油、二甲基亞砜、乙二醇和葡聚糖中的一種或兩種材料的混合物；在細胞基質(zhì)溶液中加入細胞生長因子及抗凝血因子，所述的細胞生長因子采用內(nèi)皮細胞生長因子、細胞轉(zhuǎn)移因子或肝細胞生長因子，抗凝血因子采用肝素、紫杉醇或硫酸化殼聚糖；合成高分子材料采用聚氨酯、聚乳酸、聚酯和乳酸與乙醇酸共聚物中的一種或幾種材料的復(fù)合物；天然高分子材料采用明膠、纖維蛋白原、膠原、殼聚糖、海藻酸鈉、透明質(zhì)酸和纖粘連蛋白中的一種或幾種材料的復(fù)合物；步驟I)中用于溶解所述天然高分子材料的溶劑采用水、生理鹽水、PBS溶液、pH = 6 8的O. 09M氯化鈉、3 —羥甲基氨基甲烷鹽酸溶液或細胞培養(yǎng)液；步驟5)中用于溶解所述合成高分子材料的有機溶劑采用四乙二醇、乙二醇、異丙醇或I，4-二氧六環(huán)。內(nèi)模具I由尼龍、合成纖維、聚乙烯、聚碳酸酯、聚氯乙烯或聚氨酯軟性材料制成的實心管組合而成，內(nèi)模具)級數(shù)為I 10，每級分支數(shù)為2 100 ;內(nèi)模具I最末級分支的直徑范圍在O. Imm 5mm,如圖4所示(以三級分支為例)。底座模具3的臺階各級臺階寬度相同或不同，臺階的級數(shù)為2 20 ;底座模具3外形及各級臺階截面為圓型；底座模具3的材料為金屬或是硬質(zhì)合成高分子材料；底座模具3的俯視圖如圖5a所示,側(cè)視剖面圖如圖5b所示(以二級臺階為例)。陣列孔板2鑲嵌在底座模具3最內(nèi)級臺階底層；陣列孔板2上的孔洞數(shù)量為2 400個，孔洞陣列排布，孔洞直徑與內(nèi)模具I的末端分支直徑相吻合；陣列孔板2材料為金屬或是硬質(zhì)合成高分子材料；陣列孔板2的俯視圖如圖6所示(以16孔為例)。內(nèi)環(huán)模具4及外環(huán)模具6外形與底座模具3中各自對應(yīng)的臺階形狀相吻合；內(nèi)環(huán)模具4及外環(huán)模具6為中空的外殼結(jié)構(gòu)，其外殼厚度與底座模具3中各自對應(yīng)的臺階寬度相吻合，底部全部開口，頂部部分開口 ；內(nèi)環(huán)模具4及外環(huán)模具6的材料為金屬或是硬質(zhì)合成高分子材料；內(nèi)環(huán)模具4的側(cè)視剖面圖如圖7所示。細胞基質(zhì)層(5)與合成高分子材料層(7)在成形過程中，底座模具(3)連同內(nèi)模具⑴與陣列孔板⑵的旋轉(zhuǎn)速度為5 100r/min。由于非牛頓流體的Weissenbery效應(yīng)，細胞基質(zhì)溶液與合成高分子溶液在旋轉(zhuǎn)作用下向中軸爬桿呈半紡錘狀，從而使成形后的細胞基質(zhì)層(5)與合成高分子材料層(7)形成半紡錘狀外形；整體紡錘狀器官前體的外形曲率與底座模具(3)的旋轉(zhuǎn)速度正相關(guān)，如圖8a、圖8b與圖8 c所示，圖中a〈b〈c。實施例I :I)使用黃銅制備含三級臺階的底模具，內(nèi)環(huán)模具與外環(huán)模具，用尼龍制備含一級分支的內(nèi)模具；2)配制1%纖維蛋白原溶液，將內(nèi)模具底部插入底座模具的陣列孔板中，陣列孔板鑲嵌在底座模具底層，將第一級內(nèi)環(huán)模具套在底座模具的第一級臺階上，在內(nèi)模具與第一級內(nèi)環(huán)模具間注入纖維蛋白原與內(nèi)皮細胞的混合物，細胞密度為I X IO7個/mL，使底座模具、內(nèi)模具和陣列孔板一起旋轉(zhuǎn)(轉(zhuǎn)速為5r/min)并使第一級內(nèi)環(huán)模具保持不動，使細胞基質(zhì)溶液形成半紡錘狀外形，旋轉(zhuǎn)過程中用凝血酶溶液(20IU/mL)浸泡成形物2分鐘聚合，去除第一級內(nèi)環(huán)模具，形成穩(wěn)定的第一層細胞基質(zhì)層；3)將第二級內(nèi)環(huán)模具套在底座模具的第二級臺階上。將纖維蛋白原/脂肪干細胞混合物(細胞密度為I X IO5個/mL)，加入肝細胞生長因子(HGFO. 5ng/mL)、人血小板衍化生長因子(BB或TOGF-BB 50ng/mL)、轉(zhuǎn)化生長因子β (TGF0 110ng/mL)和堿性成纖維細胞生長因子(bFGF 2. 5ng/mL)，灌注到第一層細胞基質(zhì)層和第二級內(nèi)環(huán)模具之間的縫隙中，使底座模具、內(nèi)模具和陣列孔板一起旋轉(zhuǎn)(轉(zhuǎn)速為5r/min)并使第二級內(nèi)環(huán)模具保持不動，使細胞基質(zhì)溶液形成半紡錘狀外形，旋轉(zhuǎn)過程中用凝血酶溶液(20IU/mL)使細胞基質(zhì)溶液中的纖維蛋白原聚合，去除內(nèi)環(huán)模具，形成穩(wěn)定的第二層細胞基質(zhì)層；(4)配備濃度為10% (W/V)的PLGA/四乙二醇(Tetraglycol)溶液，加入1% (W/W)的肝素，外環(huán)模具套在底座模具的最外級臺階上，將復(fù)合肝素的PLGA/四乙二醇溶液灌入多層細胞基質(zhì)層結(jié)構(gòu)與外環(huán)模具的縫隙中，使底座模具、內(nèi)模具和陣列孔板一起旋轉(zhuǎn)(轉(zhuǎn)速為5r/min)并使外環(huán)模具保持不動，使合成高分子溶液形成半紡錘狀外形，旋轉(zhuǎn)過程中用細胞培養(yǎng)液萃取溶劑，形成紡錘狀的外層合成形成PLGA外支架層，然后依次去除外環(huán)模具、底座模具與內(nèi)模具，制成含多分支通道的半紡錘狀人工血管前體；(5)將兩個半紡錘體通過PLGA/四乙二醇(Tetraglycol)溶液滲透粘連合并在一起,形成具有內(nèi)分支管道的完整紡錘狀人工血管前體。實施例2 :( I)用硅橡膠制備含四級臺階的底模具，內(nèi)環(huán)模具與外環(huán)模具，用聚乙烯制備含二級分支的內(nèi)模具；(2)配制5%纖維蛋白原溶液，將內(nèi)模具底部插入底座模具的陣列孔板中，陣列孔板鑲嵌在底座模具底層，將第一級內(nèi)環(huán)模具套在底座模具的第一級臺階上，在內(nèi)模具與第一級內(nèi)環(huán)模具間注入含1%紫杉醇的纖維蛋白原/內(nèi)皮細胞混合物(細胞密度為I X IO7個/mL)，使底座模具、內(nèi)模具和陣列孔板一起旋轉(zhuǎn)(轉(zhuǎn)速為10r/min)并使第一級內(nèi)環(huán)模具保持不動，使細胞基質(zhì)溶液形成半紡錘狀外形，旋轉(zhuǎn)過程中用凝血酶溶液(10IU/mL)浸泡成形物I分鐘聚合，去除第一級內(nèi)環(huán)模具，形成穩(wěn)定的第一層細胞基質(zhì)層；(3)將第二級內(nèi)環(huán)模具套在底座模具的第二級臺階上，將纖維蛋白原與脂肪干細胞的混合物，細胞密度為I X IO6個/mL，灌注到第一層細胞基質(zhì)層和第二級內(nèi)環(huán)模具之間的縫隙中，使底座模具、內(nèi)模具和陣列孔板一起旋轉(zhuǎn)(轉(zhuǎn)速為lOr/min)并使第二級內(nèi)環(huán)模具保持不動，使細胞基質(zhì)溶液形成半紡錘狀外形，旋轉(zhuǎn)過程中用凝血酶溶液(10IU/mL)浸泡成形物I分鐘，使細胞基質(zhì)溶液中的纖維蛋白原聚合，去除第二級內(nèi)環(huán)模具，形成穩(wěn)定的第二層細胞基質(zhì)層；(4)將第三級內(nèi)環(huán)模具套在底座模具的第三級臺階上，將纖維蛋白原/肝細胞混合物(細胞密度為IXlO7個/mL)灌注到第二層細胞基質(zhì)層和第三級內(nèi)環(huán)模具之間的縫隙中，使底座模具、內(nèi)模具和陣列孔板一起旋轉(zhuǎn)(轉(zhuǎn)速為lOr/min)并使第三級內(nèi)環(huán)模具保持不動，使細胞基質(zhì)溶液形成半紡錘狀外形，旋轉(zhuǎn)過程中用凝血酶溶液(10IU/mL)浸泡成形物I分鐘，使細胞基質(zhì)溶液中的纖維蛋白原聚合，去除第三級內(nèi)環(huán)模具，形成穩(wěn)定的第三層細胞基質(zhì)層；(5)將外環(huán)模具套在底座模具的最外級臺階上，將5%的聚氨酯/乙二醇溶液，加入5%的紫杉醇，攪拌均勻，灌入三層細胞基質(zhì)層結(jié)構(gòu)與外環(huán)模具的縫隙中，使底座模具、內(nèi)模具和陣列孔板一起旋轉(zhuǎn)(轉(zhuǎn)速為lOr/min)并使外環(huán)模具保持不動，使合成高分子溶液形成半紡錘狀外形，旋轉(zhuǎn)過程中用PBS萃取合成高分子溶液中的溶劑，形成半紡錘狀的外層聚氨酯層，然后依次去除外環(huán)模具、底座模具與內(nèi)模具，制成含多分支通道的半紡錘狀人工肝臟前體；(6)將兩個半紡錘體通過5%的聚氨酯/乙二醇溶液滲透粘連合并在一起，形成具有內(nèi)分支管道的完整紡錘狀人工肝臟前體。實施例3 :( I)用聚四氟乙烯制備含五級臺階的底模具，內(nèi)環(huán)模具與外環(huán)模具，用聚氨酯制備含三級分支的內(nèi)模具；(2)配制10%膠原溶液，將內(nèi)模具底部插入底座模具的陣 列孔板中，陣列孔板鑲嵌在底座模具底層，將第一級內(nèi)環(huán)模具套在底座模具的第一級臺階上，之后將1%檸檬酸鈉的膠原/內(nèi)皮細胞混合物(細胞密度為I X IO7個/mL)灌注到內(nèi)模具和第一級內(nèi)環(huán)模具之間的縫隙中，使底座模具、內(nèi)模具和陣列孔板一起旋轉(zhuǎn)(轉(zhuǎn)速為20r/min)并使第一級內(nèi)環(huán)模具保持不動，使細胞基質(zhì)溶液形成半紡錘狀外形，旋轉(zhuǎn)過程中用物理交聯(lián)方法在37°C下放置10分鐘，使膠原/內(nèi)皮細胞混合物結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，去除第一級內(nèi)環(huán)模具，形成穩(wěn)定的第一層細胞基質(zhì)層；(3)將第二級內(nèi)環(huán)模具套在底座模具的第二級臺階上，將膠原/內(nèi)皮細胞溶液灌注到第一層細胞基質(zhì)層和第二級內(nèi)環(huán)模具之間的縫隙中，使底座模具、內(nèi)模具和陣列孔板一起旋轉(zhuǎn)(轉(zhuǎn)速為20r/min)并使第二級內(nèi)環(huán)模具保持不動，使細胞基質(zhì)溶液形成半紡錘狀外形，旋轉(zhuǎn)過程中用物理交聯(lián)方法在37°C下放置10分鐘，使膠原/內(nèi)皮細胞混合物結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，去除第二級內(nèi)環(huán)模具，形成穩(wěn)定的第二層細胞基質(zhì)層；(4)將第三級內(nèi)環(huán)模具套在底座模具的第三級臺階上，將膠原/平滑肌細胞混合物(細胞密度為I X IO7個/mL)灌注到第二層細胞基質(zhì)層和第三級內(nèi)環(huán)模具之間的縫隙中，使底座模具、內(nèi)模具和陣列孔板一起旋轉(zhuǎn)(轉(zhuǎn)速為20r/min)并使第三級內(nèi)環(huán)模具保持不動，使細胞基質(zhì)溶液形成半紡錘狀外形，旋轉(zhuǎn)過程中用物理交聯(lián)方法在37°C下放置10分鐘，使膠原/平滑肌細胞混合物結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，去除第三級內(nèi)環(huán)模具，形成穩(wěn)定的第三層細胞基質(zhì)層；(5)將第四級內(nèi)環(huán)模具套在底座模具的第四級臺階上，將膠原與脂肪干細胞/乳鼠心肌細胞(I :1)的混合物，細胞密度為I X IO6個/mL，灌注到第三層細胞基質(zhì)層和第四級內(nèi)環(huán)模具之間的縫隙中，，使底座模具、內(nèi)模具和陣列孔板一起旋轉(zhuǎn)(轉(zhuǎn)速為20r/min)并使第四級內(nèi)環(huán)模具保持不動，使細胞基質(zhì)溶液形成半紡錘狀外形，旋轉(zhuǎn)過程中用物理交聯(lián)方法在37°C下放置10分鐘，使膠原與脂肪干細胞/乳鼠心肌細胞的混合物結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，去除第四級內(nèi)環(huán)模具，形成穩(wěn)定的第四層細胞基質(zhì)層；(6)將外環(huán)模具套在底座模具的最外級臺階上并夾緊固定，將濃度為30%的聚乳酸/異丙醇溶液，加入30%的檸檬酸鈉，攪拌均勻，灌入多層細胞基質(zhì)層結(jié)構(gòu)與外環(huán)模具的縫隙中，使底座模具、內(nèi)模具和陣列孔板一起旋轉(zhuǎn)(轉(zhuǎn)速為20r/min)并使外環(huán)模具保持不動，使合成高分子溶液形成半紡錘狀外形，旋轉(zhuǎn)過程中用PBS萃取合成高分子溶液中的溶劑，形成半紡錘狀的聚乳酸層，然后依次去除外環(huán)模具、底座模具與內(nèi)模具，制成含多分支通道的半紡錘狀人工心臟前體；(6)將兩個半紡錘體通過濃度為30%的聚乳酸/異丙醇溶液滲透粘連合并在一起，形成具有內(nèi)分支管道的完整紡錘狀人工心臟前體。實施例4 : (I)用聚四氟乙烯制備含二級臺階的底模具，內(nèi)環(huán)模具與外環(huán)模具，用合成纖維制備含四級分支的內(nèi)模具；(2)纖維蛋白原和明膠兩種天然生物材料分別溶于磷酸緩沖液(PBS)溶液中制成10%和30%的高分子溶液，再按1:1 (v/v)比例混合均勻。然后按體積比加入10%的二甲基亞砜、5%葡聚糖；將脂肪干細胞與腎小球細胞按I :1比例混合均勻，加入高分子溶液中，得到脂肪干細胞一腎小球細胞-明膠一纖維蛋白原-二甲基亞砜-葡聚糖混合物(細胞密度為IX IO4個/mL)，將內(nèi)模具底部插入底座模具的陣列孔板中，陣列孔板鑲嵌在底座模具底層，將第一級內(nèi)環(huán)模具套在底座模具的第一級臺階上，之后將脂肪干細胞一腎小球細胞-明膠一纖維蛋白原-二甲基亞砜-葡聚糖混合物灌注到內(nèi)模具和第一級內(nèi)環(huán)模具之間的縫隙中，使底座模具、內(nèi)模具和陣列孔板一起旋轉(zhuǎn)(轉(zhuǎn)速為50r/min)并使第一級內(nèi)環(huán)模具保持不動，使細胞基質(zhì)溶液形成半紡錘狀外形，旋轉(zhuǎn)過程中用凝 血酶溶液(30IU/mL)浸泡2分鐘，使細胞基質(zhì)溶液中的纖維蛋白聚合，去除第一級內(nèi)環(huán)模具，形成穩(wěn)定的細胞基質(zhì)層；(3)將外環(huán)模具套在底座模具的最外級臺階上，將30%PU/四乙二醇溶液灌入細胞基質(zhì)層結(jié)構(gòu)與外環(huán)模具的縫隙中，使底座模具、內(nèi)模具和陣列孔板一起旋轉(zhuǎn)(轉(zhuǎn)速為50r/min)并使外環(huán)模具保持不動，使合成高分子溶液形成半紡錘狀外形，旋轉(zhuǎn)過程中用PBS萃取合成高分子溶液中的溶劑，形成半紡錘狀的外PU層，然后依次去除外環(huán)模具、底座模具與內(nèi)模具，制成含多分支通道的半紡錘狀人工腎臟前體；(4)將兩個半紡錘體通過30%PU/四乙二醇溶液滲透粘連合并在一起，形成具有內(nèi)分支管道的完整紡錘狀人工腎臟前體。實施例5 : (I)用不繡鋼制備含二級臺階的底模具，內(nèi)環(huán)模具與外環(huán)模具，用聚碳酸酯制備含五級分支的內(nèi)模具；制備不繡鋼材質(zhì)的旋轉(zhuǎn)組合模具；(2)將纖維蛋白原溶于磷酸緩沖液(PBS)溶液中制成10%高分子溶液。然后按體積比加入20%的甘油、5%葡聚糖、O. 1%硫酸化殼聚糖；將脂肪干細胞與胰島細胞按2 1比例混合均勻，加入高分子混合溶液中(細胞密度為I X IO7個/mL)，得到脂肪干細胞一胰島細胞、明膠一纖維蛋白原-二甲基亞砜-葡聚糖混合物；將內(nèi)模具底部插入底座模具的陣列孔板中，陣列孔板鑲嵌在底座模具底層，將第一級內(nèi)環(huán)模具套在底座模具的第一級臺階上，之后將脂肪干細胞一胰島細胞、明膠一纖維蛋白原-二甲基亞砜-葡聚糖混合物灌注到內(nèi)模具和第一級內(nèi)環(huán)模具之間的縫隙中，使底座模具、內(nèi)模具和陣列孔板一起旋轉(zhuǎn)(轉(zhuǎn)速為lOOr/min)并使第一級內(nèi)環(huán)模具保持不動，使細胞基質(zhì)溶液形成半紡錘狀外形，旋轉(zhuǎn)過程中用凝血酶溶液(10IU/mL)浸泡2分鐘，使細胞基質(zhì)溶液中的纖維蛋白聚合，去除第一級內(nèi)環(huán)模具，形成穩(wěn)定的細胞基質(zhì)層；
(3)將外環(huán)模具套在底座模具的最外級臺階上，將含3%紫杉醇的30%聚酯/四異二醇溶液灌入細胞基質(zhì)層結(jié)構(gòu)與外環(huán)模具的縫隙中，使底座模具、內(nèi)模具和陣列孔板一起旋轉(zhuǎn)(轉(zhuǎn)速為lOOr/min)并使外環(huán)模具保持不動，使合成高分子溶液形成半紡錘狀外形，旋轉(zhuǎn)過程中用細胞培養(yǎng)液萃取合成高分子溶液中的溶劑，形成半紡錘狀的聚酯層，然后依次去除外環(huán)模具、底座模具與內(nèi)模具，制成含多分支通道的半紡錘狀人工胰島前體；(4)將兩個半紡錘體通過含3%紫杉醇的30%聚酯/四異二醇溶液滲透粘連合并在一起，形成具有內(nèi)分支管道的完整紡錘狀人工胰島前體。
權(quán)利要求
1.利用旋轉(zhuǎn)組合模具制備紡錘狀復(fù)雜器官前體的方法，其特征在于該方法包括如下步驟進行 1)將不同天然高分子溶液與不同動物體細胞懸浮液分別按I 9:9 I體積比混合制成多種細胞基質(zhì)溶液；天然高分子溶液的質(zhì)量百分濃度為1% 30% ; 2)將內(nèi)模具⑴底部插入陣列孔板(2)的孔洞中，陣列孔板(2)鑲嵌在底座模具(3)底層，底座模具(3)采用從下至上的多層臺階結(jié)構(gòu)，內(nèi)模具(I)采用多級分支結(jié)構(gòu)，且各級內(nèi)環(huán)模具(4)厚度與底座模具(3)對應(yīng)的臺階寬度相同；先將第一級內(nèi)環(huán)模具(4a)套在底座模具(3)的第一級臺階上，之后將其中一種細胞基質(zhì)溶液灌注到內(nèi)模具(I)和第一級內(nèi)環(huán)模具(4a)之間的縫隙中，使底座模具(3)、內(nèi)模具⑴和陣列孔板(2) —起旋轉(zhuǎn)并使第一級內(nèi)環(huán)模具(4a)保持不動，使細胞基質(zhì)溶液形成半紡錘狀外形，旋轉(zhuǎn)過程中采用物理或化學(xué)交聯(lián)或聚合方法，使細胞基質(zhì)溶液中的天然高分子交聯(lián)，去除第一級內(nèi)環(huán)模具(4a)，形成穩(wěn)定的第一層細胞基質(zhì)層(5a)； 3)將第二級內(nèi)環(huán)模具(4b)套在底座模具(3)的第二級臺階上，將另一種細胞基質(zhì)溶液灌注到第一層細胞基質(zhì)層(5a)和第二級內(nèi)環(huán)模具(4b)之間的縫隙中，使底座模具(3)、內(nèi)模具(I)和陣列孔板(2) —起旋轉(zhuǎn)并使第二級內(nèi)環(huán)模具(4b)保持不動，使細胞基質(zhì)溶液形成半紡錘狀外形，旋轉(zhuǎn)過程中采用物理或化學(xué)交聯(lián)或聚合方法，使細胞基質(zhì)溶液中的天然高分子交聯(lián)，去除第二級內(nèi)環(huán)模具(4b)，形成穩(wěn)定的第二層細胞基質(zhì)層(5b)； 4)重復(fù)步驟2)與步驟3)，得到含不同動物體細胞的多層細胞基質(zhì)層結(jié)構(gòu)； 5)將合成高分子材料溶于有機溶劑中制成質(zhì)量百分濃度為5% 30%的合成高分子溶液； 6)將外環(huán)模具(6)套在底座模具(3)的最外級臺階上，將合成高分子溶液灌入步驟4)中得到的多層細胞基質(zhì)層結(jié)構(gòu)與外環(huán)模具(6)的縫隙中，使底座模具(3)、內(nèi)模具⑴和陣列孔板(2) —起旋轉(zhuǎn)并使外環(huán)模具(6)保持不動，使合成高分子溶液形成半紡錘狀外形，旋轉(zhuǎn)過程中用細胞培養(yǎng)液或PBS萃取合成高分子溶液中的溶劑，形成外層合成高分子材料層(7)，然后依次去除外環(huán)模具￠)、底座模具(3)和內(nèi)模具(I)，制成含多分支通道的半紡錘狀復(fù)雜器官前體； 7)將兩個半紡錘體通過天然或合成高分子溶液滲透粘連合并在一起，形成具有內(nèi)分支管道的完整紡錘狀復(fù)雜器官前體。
2.按照權(quán)利要求I所述的利用旋轉(zhuǎn)組合模具制備復(fù)雜器官前體的方法，其特征在于所述的細胞基質(zhì)層(5)與合成高分子材料層(7)在成形過程中，底座模具(3)、內(nèi)模具(I)和陣列孔板⑵一起旋轉(zhuǎn)的旋轉(zhuǎn)速度為5 100r/min。
3.按照權(quán)利要求I或2所述的利用旋轉(zhuǎn)組合模具制備復(fù)雜器官前體的方法，其特征在于所述的內(nèi)模具(I)由尼龍、合成纖維、聚乙烯、聚碳酸酯、聚氯乙烯或聚氨酯軟性材料制成的實心管組合而成，內(nèi)模具(I)級數(shù)為I 10，每級分支數(shù)為2 100 ;內(nèi)模具(I)最末級分支的直徑范圍在O. Imm 5mm。
4.按照權(quán)利要求I或2所述的利用旋轉(zhuǎn)組合模具制備復(fù)雜器官前體的方法，其特征在于底座模具(3)的各級臺階寬度相同或不同，臺階的級數(shù)為2 20 ;底座模具(3)外形及各級臺階截面為圓型；底座模具(3)的材料為金屬或是硬質(zhì)合成高分子材料。
5.按照權(quán)利要求I所述的利用旋轉(zhuǎn)組合模具制備紡錘狀復(fù)雜器官前體的方法，其特征在于在細胞基質(zhì)溶液中加入凍存保護劑，所述的凍存保護劑采用甘油、二甲基亞砜、乙二醇和葡聚糖中的一種或兩種材料的混合物。
6.按照權(quán)利要求I所述的利用旋轉(zhuǎn)組合模具制備復(fù)雜器官前體的方法，其特征在于在細胞基質(zhì)溶液中加入細胞生長因子及抗凝血因子。
7.按照權(quán)利要求6所述的利用旋轉(zhuǎn)組合模具制備復(fù)雜器官前體的方法，其特征在于所述的細胞生長因子采用內(nèi)皮細胞生長因子、細胞轉(zhuǎn)移因子或肝細胞生長因子；抗凝血因子采用肝素、紫杉醇或硫酸化殼聚糖。
8.按照權(quán)利要求I所述的利用旋轉(zhuǎn)組合模具制備復(fù)雜器官前體的方法，其特征在于所述的合成高分子材料采用聚氨酯、聚乳酸、聚酯和乳酸與乙醇酸共聚物中的一種或幾種材料的復(fù)合物。
9.按照權(quán)利要求I所述的利用旋轉(zhuǎn)組合模具制備復(fù)雜器官前體的方法，其特征在于所述的天然高分子材料采用明膠、纖維蛋白原、膠原、殼聚糖、海藻酸鈉、透明質(zhì)酸和纖粘連蛋白中的一種或幾種材料的復(fù)合物。
10.按照權(quán)利要求I所述的利用旋轉(zhuǎn)組合模具制備復(fù)雜器官前體的方法，其特征在于步驟I)中用于溶解所述天然高分子材料的溶劑采用水、生理鹽水、PBS溶液、pH = 6 8的O.09M氯化鈉、3 —羥甲基氨基甲烷鹽酸溶液或細胞培養(yǎng)液；步驟5)中用于溶解所述合成高分子材料的有機溶劑采用四乙二醇、乙二醇、異丙醇或I，4-二氧六環(huán)。
全文摘要
利用旋轉(zhuǎn)組合模具制備紡錘狀復(fù)雜器官前體的方法，該方法首先制備細胞基質(zhì)溶液和合成高分子溶液，組裝帶有多級分支內(nèi)模具的組合模具，將細胞基質(zhì)溶液灌注到內(nèi)環(huán)模具與底座模具之間，旋轉(zhuǎn)底座模具并經(jīng)物理或化學(xué)交聯(lián)或聚合形成細胞基質(zhì)層；將合成高分子溶液灌注到細胞基質(zhì)層和外環(huán)模具之間，旋轉(zhuǎn)底座模具并用細胞培養(yǎng)液或PBS萃取后形成外支架，去除組合模具形成含不同細胞與合成高分子支架的具有多分支通道的半紡錘狀三維結(jié)構(gòu)，將兩個半紡錘體通過天然或合成高分子溶液滲透粘連合并形成具有內(nèi)分支管道的完整紡錘狀復(fù)雜器官前體,克服了目前細胞很難滲入到三維支架中、含多種細胞的支架成形不易等缺點。
文檔編號A61L27/24GK102871771SQ201210324600
公開日2013年1月16日 申請日期2012年9月4日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月4日
發(fā)明者王小紅, 黃源文 申請人:清華大學(xué)