一種復(fù)合載藥脂質(zhì)體及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種復(fù)合載藥脂質(zhì)體及其制備方法和應(yīng)用。該復(fù)合載藥脂質(zhì)體包括長循環(huán)脂質(zhì)體和包裹于其中的藥物活性組分，所述長循環(huán)脂質(zhì)體為脂質(zhì)體表面被二硬脂?；字Ｒ掖及?甲氧基聚乙二醇2000修飾的脂質(zhì)體，所述藥物活性組分為蒽環(huán)類抗生素和白藜蘆醇；該復(fù)合載藥脂質(zhì)體的制備方法包括利用薄膜-超聲法將脂質(zhì)體源、二硬脂?；字Ｒ掖及?甲氧基聚乙二醇2000和藥物活性組分制成所述復(fù)合載藥脂質(zhì)體，所述藥物活性組分為蒽環(huán)類抗生素和白藜蘆醇。本發(fā)明的復(fù)合載藥脂質(zhì)體除了對藥物敏感腫瘤的發(fā)展具有抑制活性外，還可有效地抑制化療藥物耐藥性腫瘤的發(fā)展，且產(chǎn)生的副作用較小，因此，具有極大的臨床應(yīng)用價值。
【專利說明】一種復(fù)合載藥脂質(zhì)體及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種復(fù)合載藥脂質(zhì)體及其制備方法和應(yīng)用，更確切地涉及一種克服腫瘤耐藥性的復(fù)合載藥脂質(zhì)體及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]1、腫瘤耐藥性
[0003]目前，在許多腫瘤的治療中，常規(guī)化療效果差和預(yù)后不良是困擾臨床的重要難題，而腫瘤多藥耐藥性(MDR)則是腫瘤化療失敗的關(guān)鍵因素。經(jīng)治療后.殘存的腫瘤干細(xì)胞耐藥性形成，常導(dǎo)致對某些藥物治療敏感性降低，并引起腫瘤復(fù)發(fā)甚至轉(zhuǎn)移。人惡性腫瘤對化療的耐藥性可分為先天性耐藥(nature resistance)和獲得性耐藥(acquired resistance)；根據(jù)耐藥譜又分為 原藥耐藥(primary drug resistance, F1DR)和多藥耐藥(multidrugresistance,MDR)0 PDR只對誘導(dǎo)的原藥產(chǎn)生耐藥，面對其它藥物不產(chǎn)生交叉耐藥；MDR是由一種藥物誘發(fā)，但同時又對其它多種結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制迥異的抗癌藥物產(chǎn)生交叉耐藥。
[0004]耐藥性產(chǎn)生的機(jī)制有多種，如:
[0005]DNA修復(fù)能力的增強(qiáng):化療藥致使DNA損傷，當(dāng)二氫葉酸還原酶(DHFR)和DNA損傷修復(fù)相關(guān)酶活性增強(qiáng)(MGMT)可增加其對化療藥的耐藥程度。
[0006]P-糖蛋白表達(dá):P-糖蛋白是一種能量依賴性藥物排出泵，可以與一些抗腫瘤藥物結(jié)合，也有ATP結(jié)合位點。P-糖蛋白一旦與抗腫瘤藥物結(jié)合，通過ATP提供能量，就可將藥物從細(xì)胞內(nèi)泵出細(xì)胞外，使藥物在細(xì)胞內(nèi)濃度不斷下降，并使其細(xì)胞毒作用減弱直至散失，出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象。P-糖蛋白在正常膽管、腎、小腸、腎上腺、造血干細(xì)胞等均有表達(dá)，負(fù)責(zé)激素運輸及排泌毒物等生理功能。P-糖蛋白高表達(dá)的腫瘤病人常伴預(yù)后不良，如低緩解率、高復(fù)發(fā)率、生存期短，可作為預(yù)后評價指標(biāo)。
[0007]谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶:谷胱甘肽是一種含半胱氨酸的三肽，為細(xì)胞內(nèi)主要的非蛋白巰基。谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶能夠催化機(jī)體內(nèi)親電性化合物與GSH結(jié)合，使有毒化合物增加水溶性、減少毒性，最終排出細(xì)胞外。
[0008]2、蒽環(huán)類抗生素
[0009]蒽環(huán)類抗生素特別是阿霉素是一種抗腫瘤抗生素，可抑制RNA和DNA的合成，對RNA的抑制作用最強(qiáng)，抗瘤譜較廣，對多種腫瘤均有作用，屬周期非特異性藥物，對各種生長周期的腫瘤細(xì)胞都有殺滅作用。主要適用于急性白血病,對急性白血病(淋巴細(xì)胞性和粒細(xì)胞性)、惡性淋巴瘤、乳腺癌、支氣管肺癌(未分化小細(xì)胞性和非小細(xì)胞性)、卵巢癌等惡性腫瘤，一般作為第二線藥物，即在首選藥物耐藥時可考慮應(yīng)用此藥。但是隨著腫瘤化療藥物在臨床治療中的廣泛應(yīng)用，腫瘤的耐藥性問題越來越突出，已成為腫瘤有效治療的主要障礙之一。而聯(lián)合用藥是目前克服腫瘤耐藥性的重要方法之一，也有很多相關(guān)研究。比如將阿霉素與維拉帕米聯(lián)合應(yīng)用來逆轉(zhuǎn)耐藥性，參見文獻(xiàn)《阿霉素與維拉帕米聯(lián)合用藥與單一用藥的藥動學(xué)及組織分布比較》(安杰等，中國煤炭工業(yè)醫(yī)學(xué)雜志，2002.5 (6):600-601)、《新型阿霉素抗耐藥性隱形脂質(zhì)體的體外細(xì)胞毒和體內(nèi)毒性研究》(王堅成等，藥學(xué)學(xué)報，2005，40(5):475-480)。雖然這種聯(lián)合用藥有逆轉(zhuǎn)耐藥性的效果，但是所使用的逆轉(zhuǎn)劑維拉帕米是一種常用的鈣離子通道阻斷劑，具有引起心率增快，心力衰竭，低血壓等副作用，使此類聯(lián)合用藥的應(yīng)用受到限制。
[0010]3、白藜蘆醇
[0011]20世紀(jì)80年代，世界衛(wèi)生組織調(diào)查發(fā)現(xiàn)，盡管法國人偏愛奶酪等高脂肪食物，但冠心病發(fā)病率和死亡率低于其他西方國家，其原因可能是與法國人常飲含白藜蘆醇的葡萄酒有關(guān)。此后，白藜蘆醇備受關(guān)注。到目前為止至少已在21科、31屬的72種植物中發(fā)現(xiàn)了白藜蘆醇。白藜蘆醇主要來源于寥科植物虎杖(Polygonum cuspidatum Sieb.etZucc.)的莖和根，葡萄科植物葡萄(Vitis vinifera)果實的皮和籽，豆科植物花生(Arachishypogaea)的種子等。 [0012]白藜蘆醇是一種天然無毒的抗氧化劑，可降低血液粘稠度，抑制血小板凝結(jié)和血管舒張，保持血液暢通，可預(yù)防癌癥的發(fā)生及發(fā)展，具有抗動脈粥樣硬化和冠心病，缺血性心臟病，高血脂的防治作用。此外，白藜蘆醇還具有保護(hù)心血管、抗氧化、抗自由基、抗炎、抗菌等作用，而且還有很多的臨床使用實例。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0013]本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)中蒽環(huán)類抗生素以及與其他抗癌藥聯(lián)合使用的蒽環(huán)類抗生素藥物對耐藥性腫瘤療效都較差的缺陷，提供一種對耐藥性腫瘤療效較好且產(chǎn)生的副作用較小的復(fù)合載藥脂質(zhì)體及其制備方法和應(yīng)用。
[0014]為了實現(xiàn)上述目的，一方面，本發(fā)明提供一種復(fù)合載藥脂質(zhì)體，其特征在于，該復(fù)合載藥脂質(zhì)體包括長循環(huán)脂質(zhì)體和包裹于其中的藥物活性組分，所述長循環(huán)脂質(zhì)體為脂質(zhì)體表面被二硬脂?；字Ｒ掖及?甲氧基聚乙二醇2000 (DSPE-mPEG2000)修飾的脂質(zhì)體，所述藥物活性組分為蒽環(huán)類抗生素和白藜蘆醇。
[0015]另一方面，本發(fā)明提供一種復(fù)合載藥脂質(zhì)體的制備方法及由該方法制得的復(fù)合載藥脂質(zhì)體，其特征在于，該方法包括，利用薄膜-超聲法，將脂質(zhì)體源、二硬脂?；字Ｒ掖及?甲氧基聚乙二醇2000和藥物活性組分制成所述復(fù)合載藥脂質(zhì)體，所述藥物活性組分為蒽環(huán)類抗生素和白藜蘆醇。
[0016]再一方面，本發(fā)明還提供上述復(fù)合載藥脂質(zhì)體在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
[0017]本發(fā)明的復(fù)合載藥脂質(zhì)體含有蒽環(huán)類抗生素和白藜蘆醇，除了對藥物敏感腫瘤的發(fā)展具有抑制活性外，還可有效地抑制化療藥物耐藥性腫瘤的發(fā)展，且產(chǎn)生的副作用較小，因此，具有極大的臨床應(yīng)用價值。
[0018]本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點將在隨后的【具體實施方式】部分予以詳細(xì)說明。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]附圖是用來提供對本發(fā)明的進(jìn)一步理解，并且構(gòu)成說明書的一部分，與下面的【具體實施方式】一起用于解釋本發(fā)明，但并不構(gòu)成對本發(fā)明的限制。在附圖中:
[0020]圖1a是本發(fā)明一種實施方式的復(fù)合載藥脂質(zhì)體的透射電鏡圖，圖1b是本發(fā)明一種實施方式的復(fù)合載藥脂質(zhì)體的粒徑分析結(jié)果圖；
[0021]圖2a顯示出本發(fā)明一種實施方式的復(fù)合載藥脂質(zhì)體處理A549敏感細(xì)胞24小時后的結(jié)果，圖2b顯示出該復(fù)合載藥脂質(zhì)體處理A549抗性細(xì)胞24小時后的結(jié)果；
[0022]圖3a顯示出本發(fā)明一種實施方式的復(fù)合載藥脂質(zhì)體處理A549敏感細(xì)胞48小時后的結(jié)果，圖3b顯示出該復(fù)合載藥脂質(zhì)體處理A549抗性細(xì)胞48小時后的結(jié)果；
[0023]圖4a顯示出本發(fā)明一種實施方式的復(fù)合載藥脂質(zhì)體處理A549敏感細(xì)胞72小時后的結(jié)果，圖4b顯示出該復(fù)合載藥脂質(zhì)體處理A549抗性細(xì)胞72小時后的結(jié)果；
[0024]圖5a顯示出本發(fā)明一種實施方式的載藥脂質(zhì)體處理藥物敏感性肺腺癌荷瘤裸鼠后腫瘤的變化結(jié)果，圖5b顯示出本發(fā)明一種實施方式的載藥脂質(zhì)體處理耐藥性肺腺癌荷瘤裸鼠后腫瘤的變化結(jié)果。
【具體實施方式】
[0025]以下對本發(fā)明的【具體實施方式】進(jìn)行詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解的是，此處所描述的【具體實施方式】僅用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限制本發(fā)明。
[0026]本發(fā)明提供一種復(fù)合載藥脂質(zhì)體，其特征在于，該復(fù)合載藥脂質(zhì)體包括長循環(huán)脂質(zhì)體和包裹于其中的藥物活性組分，所述長循環(huán)脂質(zhì)體為脂質(zhì)體表面被二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇2000修飾的脂質(zhì)體，所述藥物活性組分為蒽環(huán)類抗生素和白藜蘆醇。
[0027]根據(jù)本發(fā)明，所述藥物活性組分中，蒽環(huán)類抗生素和白藜蘆醇的摩爾比可以在較寬的范圍內(nèi)變化，例如，所述蒽環(huán)類抗生素和白藜蘆醇的摩爾比可以為1:0.01-100 ;本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在一定濃度范圍內(nèi)，隨著白藜蘆醇量的增加，其與蒽環(huán)類抗生素的協(xié)同作用也越來越顯著，優(yōu)選地，所述蒽環(huán)類抗生素和白藜蘆醇的摩爾比為1:1-80，進(jìn)一步優(yōu)選為1:3-40，綜合考慮白藜蘆醇的協(xié)同作用和蒽環(huán)類抗生素的細(xì)胞毒性，最優(yōu)選為1:5-20。本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，使用上述優(yōu)選比例范圍內(nèi)的蒽環(huán)類抗生素和白藜蘆醇能夠獲得具有更高治療效果的復(fù)合載藥脂質(zhì)體。
[0028] 根據(jù)本發(fā)明，所述蒽環(huán)類抗生素可以為本領(lǐng)域常用的各種蒽環(huán)類抗生素。由于蒽環(huán)類抗生素都具有7，8，9，10-四氫-5，12-四并苯醌的結(jié)構(gòu)骨架，因此蒽環(huán)類抗生素能夠通過嵌入DNA雙鏈的堿基之間，形成穩(wěn)定復(fù)合物，抑制DNA復(fù)制與RNA合成，從而阻礙快速生長的癌細(xì)胞的分裂，或者，抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶II，影響DNA超螺旋轉(zhuǎn)化成為松弛狀態(tài)，從而阻礙DNA復(fù)制與轉(zhuǎn)錄。優(yōu)選情況下，所述蒽環(huán)類抗生素為阿霉素或鹽酸阿霉素。本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，當(dāng)使用阿霉素或鹽酸阿霉素作為本發(fā)明復(fù)合載藥脂質(zhì)體的藥物活性組分之一時，能夠獲得更好的抗腫瘤活性。
[0029]本發(fā)明中，所述長循環(huán)脂質(zhì)體與藥物活性組分的摩爾比可以與現(xiàn)有技術(shù)中脂質(zhì)體載體與藥物活性組分的比例相同，優(yōu)選地，所述長循環(huán)脂質(zhì)體與藥物活性組分的摩爾比為I:0.001-0.5，進(jìn)一步優(yōu)選為 I:0.01-0.3，最優(yōu)選為 I:0.02-0.1。
[0030]根據(jù)本發(fā)明，所述長循環(huán)脂質(zhì)體可以與現(xiàn)有技術(shù)中的常規(guī)的長循環(huán)脂質(zhì)體相同，其中，脂質(zhì)體與二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇2000的摩爾比可以在很寬的范圍內(nèi)變化，例如可以為1:0.01-1，優(yōu)選為1:0.02-0.2，進(jìn)一步優(yōu)選為1:0.05-0.1。
[0031]本發(fā)明提供一種復(fù)合載藥脂質(zhì)體的制備方法，其特征在于，該方法包括，利用薄膜-超聲法，將脂質(zhì)體源、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇2000和藥物活性組分制成所述復(fù)合載藥脂質(zhì)體，所述藥物活性組分為蒽環(huán)類抗生素和白藜蘆醇。[0032]根據(jù)本發(fā)明的方法，所述藥物活性組分中，蒽環(huán)類抗生素和白藜蘆醇的摩爾比可以根據(jù)需要進(jìn)行調(diào)節(jié)，優(yōu)選地，所述蒽環(huán)類抗生素和白藜蘆醇的摩爾比為1:0.01-100，進(jìn)一步優(yōu)選為1: 1-80，再優(yōu)選為1: 3-40，最優(yōu)選為1:5-20。
[0033]本發(fā)明中，所述蒽環(huán)類抗生素可以為本領(lǐng)域常用的各種蒽環(huán)類抗生素。由于蒽環(huán)類抗生素都具有7，8，9，10-四氫-5，12-四并苯醌的結(jié)構(gòu)骨架，因此蒽環(huán)類抗生素能夠通過嵌入DNA雙鏈的堿基之間，形成穩(wěn)定復(fù)合物，抑制DNA復(fù)制與RNA合成，從而阻礙快速生長的癌細(xì)胞的分裂，或者，抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶II，影響DNA超螺旋轉(zhuǎn)化成為松弛狀態(tài)，從而阻礙DNA復(fù)制與轉(zhuǎn)錄。優(yōu)選情況下，所述蒽環(huán)類抗生素為阿霉素或鹽酸阿霉素。本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，當(dāng)使用阿霉素或鹽酸阿霉素作為本發(fā)明復(fù)合載藥脂質(zhì)體的藥物活性組分之一時，能夠獲得更好的抗腫瘤活性。
[0034]本發(fā)明中，所述脂質(zhì)體源、二硬脂?；字Ｒ掖及?甲氧基聚乙二醇2000和藥物活性組分的摩爾比為可以為常規(guī)的脂質(zhì)體載體與藥物活性組分的比例，優(yōu)選地，所述脂質(zhì)體源、二硬脂?；字Ｒ掖及?甲氧基聚乙二醇2000和藥物活性組分的摩爾比為 I:0.01-1:0.001-0.5，進(jìn)一步優(yōu)選為 I:0.02-0.2:0.01-0.3，最優(yōu)選為 I:0.05-0.1:
0.02—0.1
[0035]本發(fā)明中，所述脂質(zhì)體源可以為本領(lǐng)域任何常規(guī)的能夠制得脂質(zhì)體載體的物質(zhì)，包括但不限于大豆卵磷脂、氫化大豆磷脂、蛋黃卵磷脂中的至少一種，優(yōu)選為大豆卵磷脂。本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的是，所述脂質(zhì)體源還可以包括一定量的膽固醇，上述磷脂與所述膽固醇的摩爾比可以在較寬范圍內(nèi)選擇，例如，可以為2-10:1。
[0036]本發(fā)明中，所述脂質(zhì)體源、二硬脂?；字Ｒ掖及?甲氧基聚乙二醇2000、蒽環(huán)類抗生素和白藜蘆醇均可以通過商購獲得。
[0037]本發(fā)明中，所述薄膜-超聲法的具體步驟為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知，即，將各種原料溶解后去除溶劑制成薄膜，然后通過超聲破碎制得顆粒。
[0038]優(yōu)選地，所述薄膜-超聲法中的超聲條件包括:頻率為100-800W，優(yōu)選為200-400W ;超聲時間為5-30S，優(yōu)選為10-20S ;間隔時間為2-20S，優(yōu)選為5-10S ;循環(huán)次數(shù)為5-30次，優(yōu)選為10-20次。其中，超聲時間指的是每次超聲持續(xù)的時間，即超聲時間不包括間隔時間。
[0039]具體地，所述薄膜-超聲法可以包括以下步驟，
[0040](I)將脂質(zhì)體源、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇2000、蒽環(huán)類抗生素、白藜蘆醇和第一有機(jī)溶劑混合，得到第一混合溶液；或者將脂質(zhì)體源、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇2000、白藜蘆醇和第一有機(jī)溶劑混合，得到第一混合溶液，
[0041](2)蒸發(fā)去除第一混合溶液中的第一有機(jī)溶劑，形成薄膜，
[0042](3)將所述薄膜與純水或生理鹽水混合得到第二混合溶液，超聲得到所述復(fù)合載藥脂質(zhì)體；或者將所述薄膜與溶有蒽環(huán)類抗生素的純水或生理鹽水混合得到第二混合溶液，超聲得到所述復(fù)合載藥脂質(zhì)體。
[0043]其中，所述第一有機(jī)溶劑可以為能夠溶解各種原料的溶劑，優(yōu)選為無水乙醇、氯仿和甲醇中的至少一種，最優(yōu)選為無水乙醇。
[0044]所述蒸發(fā)的方法為本領(lǐng)域常規(guī)的方法，只要能夠?qū)⑵渲械牡谝挥袡C(jī)溶劑去除即可，例如可以在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中進(jìn)行。[0045]所述第一有機(jī)溶劑的加入量可以為本領(lǐng)域的常規(guī)選擇，優(yōu)選地，在第一混合溶液中，所述蒽環(huán)類抗生素的濃度為I X 10-4mOl/L-10mOl/L。
[0046]所述純水或生理鹽水的加入量也可以為本領(lǐng)域的常規(guī)選擇，優(yōu)選地，在第二混合溶液中，所述蒽環(huán)類抗生素的濃度為lX10_5mOl/L-10mOl/L，進(jìn)一步優(yōu)選為lX10_3mol/L-lmol/L,最優(yōu)選為 5X10 2mol/L_0.5mol/L。
[0047]本發(fā)明對于所述脂質(zhì)體源、二硬脂?；字Ｒ掖及?甲氧基聚乙二醇2000、蒽環(huán)類抗生素、白藜蘆醇和第一有機(jī)溶劑的混合方式?jīng)]有特別的限定，優(yōu)選地，先將脂質(zhì)體源、二硬脂?；字Ｒ掖及?甲氧基聚乙二醇2000和第一有機(jī)溶劑混合，再加入白藜蘆醇，制備成第一混合溶液，揮發(fā)成薄膜后加入溶有蒽環(huán)類抗生素的第二溶液。其中，對于脂質(zhì)體源、二硬脂?；字Ｒ掖及?甲氧基聚乙二醇2000和第一有機(jī)溶劑三者的加入順序沒有特別的限定。本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，通過上述優(yōu)選的方法，能夠得到治療效果更好的復(fù)合載藥脂質(zhì)體。 [0048]本發(fā)明提供了由上述方法制得的復(fù)合載藥脂質(zhì)體。
[0049]本發(fā)明還提供上述復(fù)合載藥脂質(zhì)體在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的所述復(fù)合載藥脂質(zhì)體不僅適合于制備抗藥物敏感性腫瘤的藥物，還特別適合于制備抗耐藥性腫瘤的藥物。
[0050]所述腫瘤和耐藥性腫瘤包括但不限于卵巢癌、乳腺癌、非小細(xì)胞癌、頭頸癌、食管癌、精原細(xì)胞瘤、肝癌、肺腺細(xì)胞癌、前列腺癌和非何金氏淋巴瘤，以及它們的耐藥性腫瘤中的至少一種。
[0051]以上詳細(xì)描述了本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，但是，本發(fā)明并不限于上述實施方式中的具體細(xì)節(jié)，在本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思范圍內(nèi)，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行多種簡單變型，這些簡單變型均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0052]以下通過實施例對本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)的說明。本發(fā)明的實施例中，所用大豆卵磷脂購自上海滬宇生化試劑有限公司，商品號為LE030A，CAS號為8002-43-5 ;所用蛋黃卵磷脂購自上海滬宇生化試劑有限公司，商品號為P0051 ;所用膽固醇購自湖北康寶泰精細(xì)化工有限公司，CAS號為57-88-5。所用二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇2000購自genzyme公司，商品號為LP-R4-039, CAS號為147867-65-0 ;所用蒽環(huán)類抗生素為鹽酸阿霉素(ADR)，購自北京華奉聯(lián)博科技有限公司，CAS號為25316-40-9 ;所用白藜蘆醇(Res)購自湖北興銀河化工有限公司，CAS號為501-36-0。
[0053]實施例1
[0054]本實施例用于制備復(fù)合載藥脂質(zhì)體:ADR+Res脂質(zhì)體_1。
[0055](I)將4X 10_2mol大豆卵磷脂、10_2mol膽固醇、2X 10_3mol 二硬脂?；字Ｒ掖及?甲氧基聚乙二醇2000與150ml的無水乙醇混合，溶解后加入1.2X 10_3mol白藜蘆醇，得到第一混合溶液，
[0056](2)蒸發(fā)去除第一混合溶液中的無水乙醇，形成薄膜，
[0057](3)將3X 10_4mol蒽環(huán)類抗生素與5ml生理鹽水混合，加入所述薄膜中超聲得到復(fù)合載藥脂質(zhì)體，即ADR+Res脂質(zhì)體-1。
[0058]所述超聲的條件包括:頻率為350W，超聲18s，間隔8s，超聲15次。
[0059]實施例2[0060]本實施例用于制備復(fù)合載藥脂質(zhì)體:ADR+Res脂質(zhì)體_2。
[0061](I)將4X 10_2mol大豆卵磷脂、10_2mol膽固醇、2X 10_3mol 二硬脂?；字Ｒ掖及?甲氧基聚乙二醇2000與200ml的無水乙醇混合，溶解后加入3.6X 10_3mol白藜蘆醇，得到第一混合溶液，
[0062](2)蒸發(fā)去除第一混合溶液中的無水乙醇，形成薄膜，
[0063](3)將3X 10_4mol蒽環(huán)類抗生素與4ml生理鹽水混合，加入所述薄膜中超聲得到復(fù)合載藥脂質(zhì)體，即ADR+Res脂質(zhì)體_2。
[0064]所述超聲的條件包括:頻率為400W，超聲15s，間隔5s，超聲10次。
[0065]對比例I
[0066]根據(jù)實施例2的方法制備蒽環(huán)類抗生素載藥脂質(zhì)體(ADR脂質(zhì)體)，不同的是，不加入白藜蘆醇。
[0067]對比例2
[0068]根據(jù)實施例2的方法制備白藜蘆醇載藥脂質(zhì)體(Res脂質(zhì)體)，不同的是，不加入蒽環(huán)類抗生素。
[0069]對比例3
[0070]根據(jù)實施例2的方法，將4X l(T2mol大豆卵磷脂、l(T2mol膽固醇和2X l(T3mol 二硬脂?；字Ｒ掖及?甲氧基`聚乙二醇2000與200ml的無水乙醇混合，制得長循環(huán)脂質(zhì)體。
[0071]實施例3
[0072]本實施例用于制備復(fù)合載藥脂質(zhì)體:ADR+Res脂質(zhì)體_3。
[0073](I)將8X l(T2mol的大豆卵磷脂、2X l(T2mol膽固醇、2X l(T3mol的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇2000與100ml的氯仿混合，溶解后加入6X 10_3mol白藜蘆醇，得到第一混合溶液，
[0074](2)蒸發(fā)去除第一混合溶液中的氯仿，形成薄膜，
[0075](3)將3X 10_4mol蒽環(huán)類抗生素與3ml純水混合，加入所述薄膜中超聲得到復(fù)合載藥脂質(zhì)體，即ADR+Res脂質(zhì)體_3。
[0076]所述超聲的條件包括:頻率為300W，超聲20s，間隔10s，超聲20次。
[0077]實施例4
[0078]本實施例用于制備復(fù)合載藥脂質(zhì)體:ADR+Res脂質(zhì)體_4。
[0079](I)將0.4mol蛋黃卵磷脂、0.1mol膽固醇、2X 10_2mol 二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇2000與100ml的無水乙醇混合，溶解后加入1.2 X IO^mol白藜蘆醇，得到第一混合溶液，
[0080](2)蒸發(fā)去除第一混合溶液中的無水乙醇，形成薄膜，
[0081](3)將3X 10_4mol蒽環(huán)類抗生素與2ml生理鹽水混合，加入所述薄膜中超聲得到復(fù)合載藥脂質(zhì)體，即ADR+Res脂質(zhì)體_4。
[0082]所述超聲的條件包括:頻率為500W，超聲10s，間隔5s，超聲12次。
[0083]測試?yán)齀
[0084]用透射電鏡(型號為Tecnai G2F20U-TWIN)對ADR+Res脂質(zhì)體_3進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖1a所示，由圖1a可以看出，復(fù)合載藥脂質(zhì)體形成了較為均一的直徑為50-80nm的顆粒。[0085]用納米粒度及Zeta電位分析儀(型號為Zetasizer Nano ZS)對液態(tài)ADR+Res脂質(zhì)體-3粒徑進(jìn)行進(jìn)一步的檢測，結(jié)果如圖1b所示，由圖1b可以進(jìn)一步看出，復(fù)合載藥脂質(zhì)體形成了較為均一的顆粒。
[0086]測試?yán)?
[0087]本測試?yán)糜谠诩?xì)胞水平上檢測本發(fā)明的復(fù)合載藥脂質(zhì)體的活性。
[0088]細(xì)胞實驗1:在96孔板中接種A549敏感細(xì)胞(人肺腺癌細(xì)胞)，接種量為5000個細(xì)胞/孔，細(xì)胞貼壁后加藥，根據(jù)藥物的不同分為5組，分別是:
[0089](I)生理鹽水組；
[0090](2)脂質(zhì)體組(單獨加入對比例3制得的長循環(huán)脂質(zhì)體)；
[0091](3)蒽環(huán)類抗生素脂質(zhì)體組(加入對比例I制得的ADR脂質(zhì)體)，其中，蒽環(huán)類抗生素在培養(yǎng)基中的終濃度為5 μ g/ml ；
[0092](4)白藜蘆醇脂質(zhì)體組(加入對比例2制得的Res脂質(zhì)體)，其中，白藜蘆醇在培養(yǎng)基中的終濃度為lSyg/ml ；
[0093](5)同時包裹蒽環(huán)類抗生素和白藜蘆醇的脂質(zhì)體組(ADR+Res脂質(zhì)體)，其中，包括4個小組，分別加入實施例1-4制得的ADR+Res脂質(zhì)體-1、ADR+Res脂質(zhì)體-2、ADR+Res脂質(zhì)體-3和ADR+Res脂質(zhì)體_4，其中，各組中蒽環(huán)類抗生素在培養(yǎng)基中的終濃度均為5 μ g/ml,而白藜蘆醇的終濃度分別是5,15, 25, 50 μ g/ml,每個濃度6個重復(fù)孔；
[0094]其中，(2)組中的脂質(zhì)體加入量和(5)組中加入ADR+Res脂質(zhì)體_2的脂質(zhì)體加入量相同。在加藥24h，48h，72h后用MTS試劑盒檢測OD值。
[0095]細(xì)胞實驗2:根據(jù)與細(xì)胞實驗I相同的方法進(jìn)行檢測，不同的是，接種A549蒽環(huán)類抗生素抗性細(xì)胞。
[0096]細(xì)胞實驗的結(jié)果如圖2a-2b、3a_3b和4a_4b所示。
[0097]圖2a和圖2b為處理24小時后的結(jié)果，其中，縱軸表示測得的OD值，其反映出存活細(xì)胞的數(shù)量，各組柱狀圖反映出生理鹽水組、脂質(zhì)體組、蒽環(huán)類抗生素脂質(zhì)體組、白藜蘆醇脂質(zhì)體組，以及ADR+Res脂質(zhì)體-1至ADR+Res脂質(zhì)體_4中的一組的測試結(jié)果(橫軸表示白藜蘆醇在培養(yǎng)基中的終濃度，從左至右依次為ADR+Res脂質(zhì)體-1至ADR+Res脂質(zhì)體-4的測試結(jié)果)。圖2a為對A549敏感細(xì)胞的檢測結(jié)果，圖2b為對蒽環(huán)類抗生素耐藥性肺腺癌細(xì)胞(A549抗性細(xì)胞)的檢測結(jié)果。圖2a中，加入不同濃度的白藜蘆醇的ADR+Res脂質(zhì)體-1至ADR+Res脂質(zhì)體-4對肺腺癌細(xì)胞的抑制活性與單獨使用蒽環(huán)類抗生素的抑制活性接近，甚至在加入低濃度的白藜蘆醇時，ADR+Res脂質(zhì)體-1至ADR+Res脂質(zhì)體-4的抑制活性還差于單獨使用蒽環(huán)類抗生素的效果。但是從圖2b中可以看出，蒽環(huán)類抗生素脂質(zhì)體對于蒽環(huán)類抗生素耐藥性腫瘤細(xì)胞幾乎不再具有抑制活性，而根據(jù)本發(fā)明的復(fù)合載藥脂質(zhì)體ADR+Res脂質(zhì)體-1至ADR+Res脂質(zhì)體-4均具有明顯的癌細(xì)胞抑制活性。并且，隨著白藜蘆醇濃度的增加，其抑制活性越來越顯著。
[0098]圖3a和圖3b為處理48小時后的結(jié)果，其中，圖3a為對A549敏感細(xì)胞的檢測結(jié)果，圖3b為對A549抗性細(xì)胞的檢測結(jié)果。圖3a和圖3b與圖2a和圖2b的結(jié)果類似，加入不同濃度的白藜蘆醇的ADR+Res脂質(zhì)體-1至ADR+Res脂質(zhì)體-4對肺腺癌細(xì)胞的抑制活性與單獨使用蒽環(huán)類抗生素的抑制活性接近，但是，蒽環(huán)類抗生素脂質(zhì)體對于蒽環(huán)類抗生素耐藥性腫瘤細(xì)胞幾乎不再具有抑制活性，而根據(jù)本發(fā)明的ADR+Res脂質(zhì)體-1至ADR+Res脂質(zhì)體-4均具有明顯的癌細(xì)胞抑制活性。[0099]圖4a和圖4b為處理72小時后的結(jié)果，其中，圖4a為對A549敏感細(xì)胞的檢測結(jié)果，圖4b為對A549抗性細(xì)胞的檢測結(jié)果。圖4a和圖4b與上述兩組圖的結(jié)果也類似，相比于圖3a和圖3b，圖4a和圖4b中的存活細(xì)胞的數(shù)目進(jìn)一步下降。
[0100]由上述結(jié)果可以看出，本發(fā)明的復(fù)合載藥脂質(zhì)體特別適合于抑制蒽環(huán)類抗生素抗性腫瘤細(xì)胞的發(fā)展和繁殖，并且具有明顯的濃度依賴性和時間依賴性，在處理72小時后，仍有明顯的抗腫瘤活性，說明本發(fā)明的復(fù)合載藥脂質(zhì)體的抗腫瘤活性持久。
[0101]測試?yán)?
[0102]本測試?yán)糜谠趧游锼缴蠙z測本發(fā)明的載藥脂質(zhì)體對蒽環(huán)類抗生素耐藥的肺腺癌的抑制活性。
[0103]動物實驗:通過皮下注射分別將A549藥物敏感及抗性細(xì)胞接種至16gBalb/c的裸鼠中，IO7個細(xì)胞/只，當(dāng)腫瘤長至3mm時打藥，將藥物敏感瘤小鼠及抗性瘤小鼠分別隨機(jī)分為5組:
[0104](I)生理鹽水組，
[0105](2)脂質(zhì)體組(注射對比例3制得的脂質(zhì)體)，
[0106](3)蒽環(huán)類抗生素脂質(zhì)體組(注射對比例I制得的ADR脂質(zhì)體，注射量為8mg/kg體重)，
[0107](4)白藜蘆醇脂質(zhì)體組(注射對比例2制得的Res脂質(zhì)體，注射量為20mg/kg體重)，
[0108](5)同時包裹蒽環(huán)類抗生素和白藜蘆醇的脂質(zhì)體組(注射實施例2制得的ADR+Res脂質(zhì)體)，每天腹腔注射，蒽環(huán)類抗生素注射量為8mg/kg體重，白藜蘆醇注射量為20mg/kg體重。
[0109]其中，(2)組中的脂質(zhì)體注射量與(5)組相同。注射2周后取出腫瘤照相，結(jié)果如圖5a，5b所示(每組三個平行實驗)。
[0110]由圖5a可以看出，與生理鹽水組相比，單獨使用白藜蘆醇脂質(zhì)體對腫瘤無明顯抑制作用，使用本發(fā)明的ADR+Res脂質(zhì)體-2與單獨使用蒽環(huán)類抗生素脂質(zhì)體則都可以顯著抑制肺腺癌的增長，但是本發(fā)明的ADR+Res脂質(zhì)體-2產(chǎn)生的抑制效果更加顯著。由圖5b可以看出，與生理鹽水組相比，單獨使用蒽環(huán)類抗生素脂質(zhì)體和單獨使用白藜蘆醇脂質(zhì)體雖然對蒽環(huán)類抗生素耐藥的肺腺癌細(xì)胞產(chǎn)生了一定的抑制作用，但是本發(fā)明的ADR+Res脂質(zhì)體-2對蒽環(huán)類抗生素耐藥的肺腺腫瘤產(chǎn)生的抑制作用更加顯著。
[0111]動物實驗結(jié)果進(jìn)一步證明了本發(fā)明的載藥脂質(zhì)體對敏感性及耐藥性腫瘤均具有強(qiáng)的抑制活性。
【權(quán)利要求】
1.一種復(fù)合載藥脂質(zhì)體，其特征在于，該復(fù)合載藥脂質(zhì)體包括長循環(huán)脂質(zhì)體和包裹于其中的藥物活性組分，所述長循環(huán)脂質(zhì)體為脂質(zhì)體表面被二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇2000修飾的脂質(zhì)體，所述藥物活性組分為蒽環(huán)類抗生素和白藜蘆醇。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的復(fù)合載藥脂質(zhì)體，其中，所述藥物活性組分中，蒽環(huán)類抗生素和白藜蘆醇的摩爾比為1:0.01-100，優(yōu)選為1:1-80O
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的復(fù)合載藥脂質(zhì)體，其中，所述蒽環(huán)類抗生素為阿霉素或鹽酸阿霉素。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的復(fù)合載藥脂質(zhì)體，其中，所述長循環(huán)脂質(zhì)體與藥物活性組分的摩爾比為1:0.001-0.5。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的復(fù)合載藥脂質(zhì)體，其中，所述長循環(huán)脂質(zhì)體中，脂質(zhì)體與二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇2000的摩爾比為1:0.01-1。
6.一種復(fù)合載藥脂質(zhì)體的制備方法，其特征在于，該方法包括，利用薄膜-超聲法，將脂質(zhì)體源、二硬脂?；字Ｒ掖及?甲氧基聚乙二醇2000和藥物活性組分制成所述復(fù)合載藥脂質(zhì)體，所述藥物活性組分為蒽環(huán)類抗生素和白藜蘆醇。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中，所述藥物活性組分中，蒽環(huán)類抗生素和白藜蘆醇的摩爾比為1:0.01-100，優(yōu)選為1:1-80O
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的方法，其中，所述蒽環(huán)類抗生素為阿霉素或鹽酸阿霉素。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中，所述脂質(zhì)體源、二硬脂?；字Ｒ掖及?甲氧基聚乙二醇2000和藥物活性組分的摩爾比為1:0.01-1:0.001-0.5。`
10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中，所述薄膜-超聲法中的超聲條件包括，頻率為100-800W，超聲時間為5-30S，間隔時間為2-20S，循環(huán)次數(shù)為5-30次。
11.由權(quán)利要求6-10中任意一項所述的方法制得的復(fù)合載藥脂質(zhì)體。
12.權(quán)利要求1-5和11中任意一項所述的復(fù)合載藥脂質(zhì)體在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的應(yīng)用，其中，所述腫瘤為耐藥性腫瘤。
【文檔編號】A61K31/05GK103655474SQ201210335727
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2012年9月11日 優(yōu)先權(quán)日:2012年9月11日
【發(fā)明者】孟潔, 楊先達(dá), 王琛 申請人:國家納米科學(xué)中心