專利名稱：鴨病毒性肝炎二價滅活疫苗的制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及鴨病毒性肝炎二價滅活疫苗的制備方法，屬于獸用生物制品領域。
背景技術：
鴨病毒性肝炎(duckviral hepatitis, DVH) 是由鴨肝炎病毒(duck hepatitisvirus, DHV)引起雛鴨的一種以肝臟為主要病理變化的急性、高度致死性、接觸性傳染病。臨床表現(xiàn)痙攣、抽搐和角弓反張等神經(jīng)癥狀，以肝臟腫脹和出血為特征性病變。I 3周齡的雛鴨易感，發(fā)病嚴重，傳播迅速，雛鴨通常出現(xiàn)癥狀后的I小時內(nèi)死亡，10日齡雛鴨感染后死亡率90% 95%，已經(jīng)成為嚴重危害養(yǎng)鴨業(yè)的主要疾病之一。鴨肝炎病毒(DHV)血清型DHV有4個獨立的血清型，I型、2型、3型和新型。范書才等(范書才，李虹，袁率珍等.新型鴨肝炎病毒的分離鑒定.中國預防獸醫(yī)學報，2009，10)通過試驗證明目前在我國同時存在I型和新型DHV流行。血清中和試驗表明，I型和新型之間缺乏交叉保護作用。在4個型的DHV中，I型與新型DHV流行最廣泛，毒力最強；對3周齡內(nèi)的雛鴨致死率可在80%以上。2型DHV僅在英國，3型僅在美國有報道；二者均呈散發(fā)性流行，致死率低(約20%)。對于鴨病毒性肝炎的預防和治療，目前除了加強消毒和疫苗免疫，為此我們進行了鴨病毒性肝炎二價滅活疫苗二價滅活疫苗的研制工作。研制結果表明，我們研制的二價滅活疫苗二價滅活疫苗效價高，安全性好，保護率高，為預防鴨病毒性肝炎病奠定了堅實的基礎。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是制備I型和新型鴨病毒性肝炎的兩種抗原，并進行合理配制成I型和新型鴨肝炎病毒油乳劑滅活疫苗，用此疫苗動物，可同時預防由I型和新型鴨肝炎病毒引起的鴨病毒性肝炎，此疫苗具有效價高、保護率高、安全性好等優(yōu)點。本發(fā)明所涉及的二價滅活疫苗含有鴨肝炎病毒I型YBHl株和新型YBHX株的滅活病毒，可同時預防由I型和新型鴨肝炎病毒引起的鴨病毒性肝炎。制備該二價滅活疫苗采用的技術手段選育的新毒株要經(jīng)過血清學、分子生物學等試驗進行大量的臨床病料分析鑒定工作，最后選出效價高、免疫原性好制苗用毒株——鴨肝炎病毒I型YBHl株和新型YBHX株。制備鴨病毒性肝炎二價滅活疫苗的主要步驟為用鴨肝炎病毒I型YBHl株和新型YBHX株作為疫苗生產(chǎn)毒株，分別接種雞胚和鴨胚，經(jīng)孵化、收獲死亡胚胚體和胚液、研磨、凍融后收取病毒液，再經(jīng)超濾濃縮、甲醛溶液滅活制成YBHl株滅活病毒液和YBHX株滅活病毒液，將其混合后加油佐劑經(jīng)乳化制成鴨病毒性肝炎二價滅活疫苗。本發(fā)明詳細描述一、生產(chǎn)用毒株
制苗免疫原用鴨肝炎病毒(duck hepatitis virus) I型YBHl株和新型YBHX株，均由青島易邦生物公程有限公司分離、鑒定、保管和供應。國內(nèi)分離株I型YBHl株和新型YBHX株(兩型毒株均是2008年從山東省某鴨場病死鴨的肝臟中分離)。以上2個毒株已于2012年08月15日送交北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心CGMCC No. 6441、CGMCC No. 6442。二、疫苗(免疫原)的制備I.制苗用病毒液的制備 (I)YBHl株毒液制備將生產(chǎn)用毒種YBHl株作100倍稀釋，尿囊腔接種10日齡SPF雞胚，每胚O. 2ml，36 37°C孵育，每日2次照胚檢查。接種后48 120小時內(nèi)死亡的雞胚，置2 8°C放置4 12小時后，收取尿囊液、羊水及胚體，胚體去掉頭和四肢。用胚液勻漿后、凍融3次，4000r/min離心30min，取上清混合于無菌容器中，置2 8°C保存。(2)YBHX株毒液制備將生產(chǎn)用毒種YBHX株100倍稀釋，尿囊腔接種12 13日齡易感鴨胚，每胚O. 2ml，36 37°C孵育，每日2次照胚檢查。接種后48 120小時內(nèi)死亡的鴨胚，置2 8°C 4 12小時，收取尿囊液、羊水及胚體(去掉頭和四肢)。用胚液勻漿、凍融3次，4000r/min離心30min，取上清混合于無菌容器中，置2 8°C保存。2.濃縮將收獲的YBHl株和YBHX株病毒液在2 8°C條件下，用超濾濃縮機分別濃縮至原體積的1/3，按現(xiàn)行《中國獸藥典》(中國獸藥典委員會.中國人民共和國獸藥典二〇一〇年版三部.中國農(nóng)業(yè)出版社，2011，本發(fā)明以下簡稱“現(xiàn)行《中國獸藥典》”)規(guī)定進行無菌檢驗，應無菌生長，并留樣備測毒價。每O. 2ml病毒含量均應不低于IO6 3ELD5tlt5濃縮后的胚液隨即進行滅活。3.滅活分別將濃縮后的YBHl株與YBHX株病毒液導入滅活罐內(nèi)，計量加入10%(體積比)甲醛溶液，開啟攪拌機攪拌，使其充分混合，甲醛溶液的最終濃度為O. 2%。加甲醛溶液后導入另一滅活罐中，以避免罐口附近粘附的病毒未能接觸滅活劑。37°C滅活16小時(以罐內(nèi)溫度達到37°C開始計時)后取出，置2 8°C保存，應不超過3個月。4.鴨病毒性肝炎二價滅活疫苗半成品檢驗(I)無菌檢驗取滅活的濃縮胚液，按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進行無菌檢驗。(2)病毒含量測定I)濃縮后YBH株病毒含量測定將濃縮后的病毒液用滅菌生理鹽水作10倍系列稀釋，取10_4、10_5、10_6、10_7 4個稀釋度，分別尿囊腔接種10日齡SPF雞胚5枚，每胚O. 2ml。同時設接種生理鹽水對照5枚，每胚O. 2ml。置36 37°C繼續(xù)孵育，每日照胚2次，觀察168小時。以雞胚死亡并出現(xiàn)尿囊膜水腫增厚，頭、頸、背部等全身出血性病變判為感染，計算 ELD50。2)濃縮后YBHX株病毒含量測定將濃縮后的病毒液用滅菌生理鹽水作10倍系列稀釋，取10_4、10_5、10_6、10_7 4個稀釋度，分別尿囊腔接種12 13日齡易感鴨胚5枚，每胚O. 2ml。同時設生理鹽水對照，每胚O. 2ml。置36 37°C繼續(xù)孵育，每日照胚2次，觀察168小時。以鴨胚死亡并出現(xiàn)尿囊膜水腫增厚，頭、頸、背部等全身出血性病變判為感染，計算 ELD50。(3)滅活檢驗分別將YBHl株和YBHX株滅活后的病毒液尿囊腔接種10日齡SPF雞胚和12 13日齡易感鴨胚各10枚，每胚O. 2ml，置36 37°C繼續(xù)孵育，連續(xù)觀察168小時。5.滅活疫苗的制備經(jīng)過檢驗合格后的半成品抗原進行疫苗制備(以下配制中各液體成分按體積比計)。油相制備取獸用白油94份，硬脂酸鋁2份，置于油相制備罐中加熱至80°C后，再加司本一 80 6份，至溫度達到115°C時，維持30min，冷卻后備用。水相制備將滅活檢驗合格的YBHl株和YBHX株病毒液適當比例混合，使每O. 2ml水相中含YBHl株和YBHX株病毒含量均不低于106_ 1ELD500取滅菌后的吐溫_80 4份，加入配液罐中，同時加混合抗原液96份，開動攪拌電機攪拌20 30min，使吐溫-80完全溶解。乳化取油相3份放于高速剪切機內(nèi)，開動電機慢速轉(zhuǎn)動攪拌，同時徐徐加入水相I份，以10000r/min,乳化5分鐘。乳化后,取IOml,以3000r/min離心15分鐘，管底析出的水相彡O. 5ml。三、疫苗成品檢驗I.性狀(I)外觀疫苗應為乳白色乳劑，無雜質(zhì)并且外包裝應合格。(2)劑型為油包水型。取一清潔吸管，吸取少量疫苗滴入冷水中，除第I滴外，均應不擴散。(3)穩(wěn)定性吸取疫苗IOml加入離心管中，以3000rpm離心15分鐘，管底析出的水相應不超過O. 5ml。(4)黏度按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進行，應符合規(guī)定。2.裝量檢查按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進行，應符合規(guī)定。
3.無菌檢驗按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進行，應符合規(guī)定。4.安全檢驗用21 35日齡SPF雞10只，每只頸部皮下注射疫苗2. 0ml，同時設對照5只，在相同的條件下飼養(yǎng)，連續(xù)觀察14日，記錄試驗雞采食、飲水及臨床情況。應不出現(xiàn)由疫苗引起的任何局部和全身不良反應。5.效力檢驗用21 35日齡SPF雞10只，每只頸部皮下注射疫苗，O. 5ml/只，另取5只同日齡雞不免疫作對照，免后21日，采血分離血清，分別測定鴨肝炎I型和新型中和抗體效價。免疫組抗體效價，應均不低于1:64，對照組應均為陰性。本發(fā)明所涉及微生物本發(fā)明涉及鴨肝炎病毒(duck hepatitis virus)YBHl株和YBHX株，以上2個毒株已于2012年08月15日送交北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號=YBHl株為CGMCC No. 6441，YBHX 株為 CGMCC No. 6442。本發(fā)明的積極意義本發(fā)明涉及鴨病毒性肝炎二價滅活疫苗的生產(chǎn)方法。本發(fā)明從優(yōu)勢流行菌株中篩選出免疫原性良好的鴨肝炎病毒I型YBHl株和新型YBHX株疫苗制備菌株，分別接種雞胚和鴨胚，分別收獲死亡胚胚體和胚液，經(jīng)研磨、凍融后收取病毒液，經(jīng)超濾濃縮、甲醛溶液滅活后，加油佐劑混合乳化制成疫苗。此疫苗能同時預防由I型和新型鴨肝炎病毒引起的鴨病毒性肝炎，具有高效、安全性好、保護率高等優(yōu)點。實施例以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的保護范圍。實施例I(一)疫苗(免疫原)制備I制苗用病毒液的制備YBHl株病毒液制備將生產(chǎn)用毒種YBHl株作100倍稀釋，尿囊腔接種10日齡SPF雞胚100枚，每胚O. 2ml, 36 37°C孵育,每日2次照胚檢查。接種后48 120小時內(nèi)死亡的雞胚，置2 8°C放置4 12小時后，收取尿囊液、羊水及胚體，胚體去掉頭和四肢。用胚液勻漿后、凍融3次，4000r/min離心30min，取上清混合于無菌容器中，置2 8°C保存。(參見表I)。·
YBHX株病毒液制備將生產(chǎn)用毒種YBHX株100倍稀釋，尿囊腔接種12 13日齡易感鴨胚100枚，每胚O. 2ml，36 37°C孵育，每日2次照胚檢查。接種后48 120小時內(nèi)死亡的鴨胚，置2 8°C 4 12小時，收取尿囊液、羊水及胚體(去掉頭和四肢)。用胚液勻漿、凍融3次，4000r/min離心30min，取上清混合于無菌容器中，置2 8°C保存。(參見表I)。表I毒液的制備
權利要求
1.一種鴨病毒性肝炎二價滅活疫苗，其特征在于該滅活疫苗含有鴨病毒性肝炎病毒I型YBHl株和新型YBHX株的滅活病毒，可同時預防由I型和新型鴨肝炎病毒引起的鴨病毒性肝炎。
2.權利要求I所述鴨病毒性肝炎二價滅活疫苗的制備方法，其特征在于 (1)鴨肝炎病毒I型YBHl株和新型YBHX株已于2012年08月15日送交北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心 CGMCC No. 6441、CGMCC No. 6442 ； (2)用鴨肝炎病毒I型YBHl株和新型YBHX株作為疫苗生產(chǎn)毒株，分別接種雞胚和鴨胚，經(jīng)孵化、收獲死亡胚胚體和胚液、研磨、凍融后收取病毒液，再經(jīng)超濾濃縮、甲醛溶液滅活制成YBHl株滅活病毒液和YBHX株滅活病毒液，將其混合后加油佐劑經(jīng)乳化制成鴨病毒性肝炎二價滅活疫苗。
全文摘要
本發(fā)明涉及鴨病毒性肝炎二價疫苗的生產(chǎn)方法。本發(fā)明從優(yōu)勢流行菌株中篩選出免疫原性良好的鴨病毒性肝炎1型YBH1株和新型YBHX株疫苗制備菌株，分別接種雞胚和鴨胚，分別收獲死亡胚胚體和胚液，經(jīng)研磨、凍融后收取病毒液，經(jīng)超濾濃縮、甲醛溶液滅活后，加油佐劑混合乳化制成疫苗。此疫苗免疫動物能同時預防由1型和新型鴨肝炎病毒引起的鴨病毒性肝炎，具有高效、安全性好、保護率高等優(yōu)點。
文檔編號A61P31/14GK102908618SQ20121033756
公開日2013年2月6日 申請日期2012年9月12日 優(yōu)先權日2012年9月12日
發(fā)明者徐保娟, 宮曉, 郭偉偉, 王龍, 孫健, 胡瀟 申請人:青島易邦生物工程有限公司