專利名稱：Dcx和sparc雙基因共表達(dá)載體在制備放療增敏劑中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ー種基因藥物，尤其涉及DCX和SPARC雙基因共表達(dá)載體在制備放療增敏劑中的應(yīng) 用。
背景技術(shù)：
膠質(zhì)瘤是發(fā)生于神經(jīng)外胚層的腫瘤，故亦稱神經(jīng)外胚層腫瘤或神經(jīng)上皮腫瘤。腦膠質(zhì)瘤的基本治療手段是手術(shù)切除+放療和化療。隨著分子生物學(xué)、免疫生物學(xué)、腫瘤免疫學(xué)和醫(yī)學(xué)生物工程的發(fā)展，腦膠質(zhì)瘤治療的新方法新技術(shù)不斷出現(xiàn)，如細(xì)胞免疫治療、分子靶向治療、熱療等。在這些治療方法中，各種都有自身的局限性。腦膠質(zhì)瘤因其惡性程度對(duì)放射治療不甚敏感，一般認(rèn)為分化差的腫瘤較分化好的為高。放療的臨床效果也不是很令人滿意，一是受到放射劑量的限制，再者就是大多數(shù)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)射線具有抗性，加大照射劑量又會(huì)増加對(duì)周圍正常腦組織的輻射損傷。隨著基因技術(shù)的不斷深入研究，如何能利用基因有效治療膠質(zhì)瘤已成為當(dāng)今研究的熱點(diǎn)?；蛑委煹姆肿硬呗灾饕?xì)胞周期調(diào)節(jié)、自殺基因療法、免疫基因療法、抑癌基因治療、抗血管生成治療、以及生長(zhǎng)因子等。而且于同一載體上同時(shí)表達(dá)多個(gè)外源基因在生物學(xué)領(lǐng)域中具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值，尤其在針對(duì)腫瘤等疾病發(fā)生發(fā)展的各個(gè)環(huán)節(jié)設(shè)計(jì)多基因共表達(dá)載體的聯(lián)合基因治療更備受關(guān)注。因而構(gòu)建合適的載體獲得多個(gè)外源基因的高效轉(zhuǎn)移與表達(dá)具有重要意義。雙基因或多基因的構(gòu)建現(xiàn)主要采取兩種途徑一是將多個(gè)攜帶不同治療基因的獨(dú)立載體系統(tǒng)同時(shí)轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞表達(dá)多個(gè)基因[20]，優(yōu)點(diǎn)是可以自由調(diào)節(jié)各表達(dá)載體的比例，但是效率太低，載體的副作用明顯；ニ是在同一載體上實(shí)現(xiàn)多基因共表達(dá)，其實(shí)現(xiàn)多個(gè)基因共同表達(dá)的方式主要有在多個(gè)基因之間插入獨(dú)立啟動(dòng)子表達(dá)盒、內(nèi)部核糖體結(jié)合位(LRES)或連接2A序列、Furin切割序列等。與多個(gè)攜帶不同治療基因的獨(dú)立載體實(shí)現(xiàn)共表達(dá)相比，于同一載體上實(shí)現(xiàn)多基因共表達(dá)可提高轉(zhuǎn)移及表達(dá)效率。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的發(fā)明目的是提供ー種DCX和SPARC雙基因共表達(dá)載體在制備放療增敏劑中的應(yīng)用，以解決膠質(zhì)瘤對(duì)放療不敏感的問(wèn)題。為達(dá)到上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是DCX和SPARC雙基因共表達(dá)載體在制備放療增敏劑中的應(yīng)用。具體地，通過(guò)構(gòu)建DCX和SPARC雙基因共表達(dá)重組腺病毒載體，由重組腺病毒對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞進(jìn)行感染，增加G2期細(xì)胞的比例，以提高膠質(zhì)瘤細(xì)胞的放射敏感性。所述重組腺病毒載體的構(gòu)建方法是
(I)針對(duì)DCX和SPARC基因序列，制備PCR引物，所述PCR引物由 DCX 正義引物 GCAAGATCTATGAAAACACTCCCCCTTC、DCX 反義引物 TAAGGTACCTTACATGGAATCACCAAGCG、
SPARC 正義引物 TAAGCGGCCGCATGAGGGCCTGGATCTT 和
SPARC 反義引物 TAGCTCGAGTTAGATCACAAGATCCTTGT 構(gòu)成，在 DCX 兩端分別引入 BglII 和KpnI酶切位點(diǎn)，SPARC兩端分別引入NotI和XhoI酶切位點(diǎn)，擴(kuò)增得到DCX和SPARC目的片段；
(2)雙酶切目的基因PCR產(chǎn)物和pAdTrack-CMV-polyA-promoter空載體轉(zhuǎn)移質(zhì)粒，用T4 DNA連接酶將其4°C連接過(guò)夜，構(gòu)建單、雙基因重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒載體pAdTrack-CMV-DCX-polyA+promoter, pAdTrack-CMV-polyA+promoter-SPARC,和 pAdTrack-DCX-poIyA-promo t er-SPARC ；
(3)將構(gòu)建的單、雙基因重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒用PmeI單酶切線性化后，與pAdEasy-Ι腺病毒骨架質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化BJ5183大腸桿菌，用PacI單酶切鑒定并轉(zhuǎn)化DH5 α大腸桿菌；· (4)將成功重組的 pAd-polyA+promoter、pAd-DCX-polyA+promoter>pAd-poIyA+promoter-SPARC 和 pAd-DCX-polyA+promoter-SPARC 在 DH5 α 大腸桿菌擴(kuò)增抽提，PacI酶切線性化后用脂質(zhì)體2000 (Iipofectamine 2000)轉(zhuǎn)染293Α細(xì)胞，所得腺病毒為 Ad-GFP, Ad-DCX, Ad-SPARC, Ad-DCX-SPARC。由于上述技術(shù)方案運(yùn)用，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有下列優(yōu)點(diǎn)
本發(fā)明提供了 DCX和SPARC雙基因共表達(dá)重組腺病毒載體，獲得的腺病毒Ad-DCX-SPARC具有感染細(xì)胞的能力，并且顯著提高了感染細(xì)胞中DCX和SPARC的表達(dá)水平，能夠有效提高膠質(zhì)瘤的放射敏感性。


圖I是本發(fā)明實(shí)施例中的雙基因連接方式示意 圖2是腺病毒構(gòu)建及包裝示意 圖3是實(shí)施例中PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳圖 4 是實(shí)施例中 PacI 單酶切鑒定 pAd-po I yA+pr omo ter、pAd-DCX-po I yA+pr omo t er >pAd-poIyA+promoter-SPARC>pAdTrack-DCX-polyA-promoter-SPARC ；
圖5是實(shí)施例中RT-PCR鑒定Ad-DCX-SPARC的表達(dá)；
圖6是實(shí)施例中重組腺病毒體外感染U251細(xì)胞熒光表達(dá)情況；
圖7是實(shí)施例中腺病毒感染后GFP陽(yáng)性細(xì)胞的比例；
圖8是實(shí)施例中重組腺病毒對(duì)U251生長(zhǎng)的影響；
圖9是實(shí)施例中重組腺病毒感染后照射對(duì)U251生長(zhǎng)的影響；
圖10是實(shí)施例中重組腺病毒對(duì)U251細(xì)胞周期的影響；
圖11實(shí)施例中重組腺病毒感染后照射對(duì)U251細(xì)胞凋亡的影響。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)ー步描述
實(shí)施例
一.構(gòu)建DCX和SPARC雙基因共表達(dá)重組腺病毒載體 技術(shù)流程
1、針對(duì)DCX和SPARC設(shè)計(jì)引物(表1)，在DCX兩端分別引入BglII和KpnI酶切位點(diǎn)，SPARC兩端分別引入NotI和XhoI酶切位點(diǎn)。以人cDNA文庫(kù)為模板，在Phusion高保真DNA聚合酶的作用下擴(kuò)增得到DCX和SPARC的目的片段，并進(jìn)行瓊脂糖電泳鑒定。表I. PCR 引物
細(xì)通
For GCAAGATCTATGMMCACTCOCCCTTC
Dd -
8ct TMGGTAGLTTACATGGAATCACCAAGCG
SPARC For TMGCGGODGCATCAGGGOCTGGATOT
Rct : TAGCrCKA&raCATaOAGATOCTTCT
2、雙酶切目的基因PCR產(chǎn)物和pAdTrack-CMV-polyA-promoter空載體轉(zhuǎn)移質(zhì)粒，用T4DNA連接酶將其4°C連接過(guò)夜(連接方式見(jiàn)圖I)。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a大腸桿菌，用LB瓊脂平板(含50 μ g/ml卡那霉素)篩選抗性克隆。在DNA序列測(cè)定后，將陽(yáng)性克隆保種備用。構(gòu)建的單、雙基因重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒載體為pAdTrack-CMV-DCX-polyA+promoter,pAdTrack-CMV-poIyA+promoter-SPARC, pAdTrack-DCX-poIyA-promoter-SPARC。3、將構(gòu)建的單、雙基因重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒用PmeI單酶切線性化后，與pAdEasy-Ι腺病毒骨架質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化BJ5183大腸桿菌，用LB瓊脂平板(含50 μ g/ml卡那霉素)篩選抗性克隆。用PacI單酶切鑒定并轉(zhuǎn)化DH5a大腸桿菌。4、將成功重組的 pAd-po I yA+promoter、pAd-DCX-po I yA+pr omo t er >pAd-po I yA+pr omo t er-SPARC 和 pAd-DCX-polyA+promoter-SPARC 在 DH5 a 大腸桿菌擴(kuò)增抽提，PacI酶切線性化后用Iipofectamine 2000轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞，2周后觀察細(xì)胞形態(tài)變化，腺病毒構(gòu)建及包裝總體步驟如圖2所示，所得腺病毒命名為Ad-GFP，Ad-DCX, Ad-SPARC, Ad-DCX-SPARC。5、在半數(shù)細(xì)胞脫壁后，收獲細(xì)胞和上清液，反復(fù)凍融3次，釋放腺病毒Ad-GFP，Ad-DCX, Ad-SPARC, Ad-DCX-SPARC。將獲得的病毒再感染293A細(xì)胞，抽提總RNA進(jìn)行RT-PCR鑒定雙基因的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果
(I)引入限制性酶切位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物的瓊脂糖電泳如圖3所示，DCX為1326bp，SPARC為 912bp。(2)重組 Ad-GFP, Ad-DCX, Ad-SPARC, Ad-DCX-SPARC 用 PacI 單酶切后，瓊脂糖電泳鑒定抗卡那霉素小片段(4. 5kb)的釋放，如圖4所示。(3)轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞2周后出現(xiàn)細(xì)胞空斑，收獲腺病毒Ad_GFP，Ad-DCX, Ad-SPARC,Ad-DCX-SPARC,再次感染293A細(xì)胞，觀察細(xì)胞病變情況，RT-PCR檢測(cè)雙基因的表達(dá)，PCR產(chǎn)物如圖5所示，可見(jiàn)Ad-DCX-SPARC感染的細(xì)胞中DCX和SPARC的表達(dá)水平顯著提高。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明成功構(gòu)建了 DCX和SPARC雙基因共表達(dá)的重組腺病毒，獲得的腺病毒Ad-DCX-SPARC具有感染細(xì)胞的能力，并且顯著提高了感染細(xì)胞中DCX和SPARC的表達(dá)水平。ニ、構(gòu)建的DCX和SPARC雙基因功能實(shí)驗(yàn)方法
I重組腺病毒的大量擴(kuò)增
將第一部分構(gòu)建獲得的pAd-po lyA+promoter(以下簡(jiǎn)稱為Ad-GFP)、pAd-DCX-polyA+promoter (以下簡(jiǎn)稱 Ad-DCX) > pAd-polyA+promoter-SPARC (以
下簡(jiǎn)稱 Ad-SPARC)和 pAd-DCX-polyA+promoter-SPARC(以下簡(jiǎn)稱 Ad-DCX-SPARC)腺病毒再分別多輪感染QBI-293A細(xì)胞中進(jìn)行大量繁殖，待出現(xiàn)細(xì)胞病變效應(yīng)明顯，熒光顯著增強(qiáng)時(shí)，收集細(xì)胞并反復(fù)凍融3次，2000r/min離心5min，取病毒上清，于_80°C保存。2.重組腺病毒的效價(jià)檢測(cè)
將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的QBI-293A細(xì)胞胰酶消化后，調(diào)整細(xì)胞濃度為I X IO5個(gè)/mL，在96孔板上按每孔100 μ L接種細(xì)胞，培養(yǎng)24h后，將上述獲得的Ad-GFP、Ad-DCX、Ad-SPARC和Ad-DCX-SPARC 重組腺病毒作 I (Γ1、I (Γ2、I (Γ3、I (Γ4、I (Γ5、I (Γ6、I (T7、I (Γ8、I (Γ9、I (Γ1。`、I (Γ11 稀釋后，每個(gè)稀釋度按每孔100 μ L接種3孔，370C，5%C02細(xì)胞培養(yǎng)箱里培養(yǎng)18h后，熒光顯微鏡下，進(jìn)行熒光計(jì)數(shù)，按病毒效價(jià)(pfu/mL)=(每孔熒光數(shù)X 10)/稀釋度公式計(jì)算腺病毒效價(jià)。3.重組腺病毒對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的感染效率
將經(jīng)0. 25%胰酶消化分散的人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251用10%FBS DMEM完全培養(yǎng)基懸浮，計(jì)數(shù)后調(diào)整細(xì)胞濃度為I X IO5個(gè)/ml，每孔100 μ L接種于96孔培養(yǎng)板，37°C，5%C02培養(yǎng)過(guò)夜。次日Ad-GFP空載體腺病毒和Ad-DCX、Ad-SPARC、Ad-DCX-SPARC單、雙基因重組腺病毒體外分別以1、5、10、25、50、75、100、200 MOI不同劑量感染膠質(zhì)瘤細(xì)胞，各分為5組細(xì)胞對(duì)照組、空載體Ad-GFP、單基因Ad-DCX、單基因Ad-SPARC和雙基因Ad-DCX-SPARC組感染24h后在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞中GFP綠色熒光表達(dá)情況，以判斷重組腺病毒不同感染劑量對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的感染效率，g在篩選最佳感染劑量進(jìn)行重組腺病毒感染。三、通過(guò)增加DCX-SPARC雙基因表達(dá)聯(lián)合放療的體外實(shí)驗(yàn)，探討對(duì)腦膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移的影響及作用機(jī)制。I.流式細(xì)胞儀檢測(cè)GFP陽(yáng)性細(xì)胞的比例
將U251腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞每孔100萬(wàn)接種于六孔板中，37°C，5%C02培養(yǎng)過(guò)夜。次日Ad-GFP空載體腺病毒和Ad-DCX、Ad-SPARC、Ad-DCX-SPARC單、雙基因重組腺病毒體外分別以20M0I不同劑量感染膠質(zhì)瘤細(xì)胞，感染24h后，收集細(xì)胞后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)GFP陽(yáng)性細(xì)胞的比例。2.重組腺病毒對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的影響
將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的U251細(xì)胞用0. 25%胰酶消化后，用完全培養(yǎng)基懸浮制成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)調(diào)整細(xì)胞濃度為3X IO4個(gè)/ml，每孔100 μ L接種于96孔板，待細(xì)胞貼壁后，將Ad-GFP空載體腺病毒和Ad-DCX、Ad-SPARC、Ad-DCX-SPARC單、雙基因重組腺病毒以20M0I劑量感染細(xì)胞，每組均設(shè)5個(gè)平行孔。37°C，5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)若干天，每孔加入20 μ LMTT (5mg/mL), 37°C繼續(xù)培養(yǎng)4h后在加入DMS0150 μ L/孔，于37°C充分溶解后，在酶標(biāo)儀570nm下測(cè)定吸光值(0D值)，以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，天數(shù)為橫坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)活力圖。3.重組腺病毒感染后對(duì)照射后U251細(xì)胞生長(zhǎng)的影響
將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的U251細(xì)胞用0. 25%胰酶消化后，用完全培養(yǎng)基懸浮制成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)調(diào)整細(xì)胞濃度為5X IO4個(gè)/ml，每孔100 μ L接種于96孔板，待細(xì)胞貼壁后，將Ad-GFP空載體腺病毒和Ad-DCX、Ad-SPARC、Ad-DCX-SPARC單、雙基因重組腺病毒以20M0I劑量感染U251細(xì)胞后48h進(jìn)行X射線照射(4、8Gy)，MTT檢測(cè)2天后細(xì)胞的生長(zhǎng)活力。4.細(xì)胞周期分析
取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，每組三個(gè)平行樣，60mm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)過(guò)夜，隔日將Ad-GFP空載體腺病毒和Ad-DCX、Ad-SPARC、Ad-DCX-SPARC單、雙基因重組腺病毒以20M0I劑量感染細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)48h后檢測(cè)細(xì)胞周期分布。各組細(xì)胞用胰酶消化，制備單細(xì)胞懸液，1000rpm，5min離心，棄上清，PBS洗2次以去除細(xì)胞碎片，200 μ L PBS重懸細(xì)胞，緩慢加入70%冷こ醇2mL，吹打均勻，4°C固定過(guò)夜，1000rpm，5min離心，棄上清，PBS洗2遍，カロ2(^g/mL RNase 37°C水浴消化30min，再以2 (^g/mL的PI (碘化丙啶)染色液置4°C避光染30min,上機(jī)檢測(cè)。5、照射后細(xì)胞凋亡檢測(cè)
取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，每組三個(gè)平行樣，隔日將Ad-GFP空載體腺病毒和Ad-DCX、Ad-SPARC、Ad-DCX-SPARC單、雙基因重組腺病毒以20M0I劑量感染細(xì)胞，48h后對(duì)各組細(xì)胞進(jìn)行X射線照射(8Gy)。繼續(xù)培養(yǎng)48h后細(xì)胞用O. 25%胰酶消化并收集，制備單細(xì)胞懸液，IOOOrpm, 5min離心，棄上清，預(yù)冷的PBS洗2次，重懸細(xì)胞于I XBinding Buffer中，調(diào)整細(xì)胞濃度為IXlOfVmL,取IOOyL的細(xì)胞懸液分別加入5μ L PE Annexin V和
5μ L7-AAD.室溫避光作用15min，加入400 μ LI XBinding Buffer, Ih內(nèi)上機(jī)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果
I聞效價(jià)腺病韋的獲得
Ad-GFP、Ad-DCX、Ad-SPARC、Ad-DCX-SPARC腺病毒粗提液經(jīng)過(guò)多輪感染293A細(xì)胞和擴(kuò)增后，獲得了高滴度和高純度的Ad-GFP、Ad-DCX、Ad-SPARC、Ad-DCX-SPARC腺病毒，其效價(jià)分別為109 ；109 ；109 ；109 (pfu/ml)。2.激光共聚焦顯微鏡觀察重組腺病毒體外感染U251細(xì)胞熒光表達(dá)情況
將 Ad-GFP、Ad-DCX、Ad-SPARC 和 Ad-DCX-SPARC 腺病毒分別以 1，5，10，20，50，100，200M0I不同劑量感染U251細(xì)胞。感染24h后，在激光共聚焦顯微鏡下觀察空載腺病毒和不同劑量重組腺病毒對(duì)U251細(xì)胞的感染情況。結(jié)果顯示(圖6)在20M0I時(shí)，U251細(xì)胞中GFP表達(dá)的細(xì)胞可達(dá)95%以上，故20M0I為這幾種腺病毒的最佳感染劑量。3.流式細(xì)胞儀檢測(cè)腺病毒感染后GFP陽(yáng)性細(xì)胞的比例
流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示空白對(duì)照組，空載體腺病毒和Ad-DCX、Ad-SPARC、Ad-DCX-SPARC單、雙基因重組腺病毒以20M0I的劑量感染U251細(xì)胞后，表達(dá)GFP的細(xì)胞比例分別為
I.49%, 98. 81%, 99. 52%, 95. 02%, 98. 96%。4.重組腺病毒感染后對(duì)U251細(xì)胞生長(zhǎng)的影響
空載體腺病毒和Ad-DCX、Ad-SPARC、Ad-DCX-SPARC單、雙基因重組腺病毒以20M0I的劑量感染U251細(xì)胞后，MTT檢測(cè)0-6天細(xì)胞的生長(zhǎng)活力，并繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，由圖8可見(jiàn)，Ad-DCX、Ad-SPARC、Ad-DCX-SPARC 在 20M0I 均有明顯的抑制作用，并且 Ad-DCX-SPARC 明顯強(qiáng)于Ad-DCX和Ad-SPARC，與空白對(duì)照組和Ad-GFP組比較呈顯著性差異(P〈0. 05)。5.重組腺病毒感染后對(duì)照射后U251細(xì)胞生長(zhǎng)的影響
空載體腺病毒和Ad-DCX、Ad-SPARC、Ad-DCX-SPARC單、雙基因重組腺病毒以20M0I的劑量感染U251細(xì)胞后48h進(jìn)行X射線照射(4、8Gy)，MTT檢測(cè)2天后細(xì)胞的生長(zhǎng)活力，由圖9可見(jiàn)，Ad-DCX、Ad-SPARC、Ad-DCX-SPARC在照射后對(duì)細(xì)胞的抑制作用隨照射劑量增加而更為明顯，并且Ad-DCX-SPARC明顯強(qiáng)于Ad-DCX和Ad-SPARC，與空白對(duì)照組和Ad-GFP組比較呈顯著性差異(P〈0. 05)。6.重組腺病毒對(duì)U251細(xì)胞周期的影響
用流式細(xì)胞儀分析了各重組腺病毒感染后細(xì)胞周期分布的變化。結(jié)果顯示(圖10):Ad-DCX、Ad-SPARC、Ad-DCX-SPARC單、雙基因組均出現(xiàn)了 G2期細(xì)胞比例的增加(即G2期阻滯的出現(xiàn))(P〈0. 05)，G2 期細(xì)胞的比例分別達(dá)至Ij 19. 043%, 18. 044%, 22. 413%,且 Ad-DCX-SPARC雙基因組G2期阻滯更為顯著，與空白對(duì)照(G2期細(xì)胞比例10. 984)和Ad-GFP組(G2期細(xì)胞比例11. 296)相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p〈0. 05)，G2-M期放射敏感性最高，故増加這兩種基因的表達(dá)比增加單個(gè)基因的表達(dá)更能夠增加膠質(zhì)瘤細(xì)胞的放射敏感性，提高治療效果。7.重組腺病毒感染后照射對(duì)U251細(xì)胞凋亡的影響
檢測(cè)重組腺病毒感染后細(xì)胞輻照前后細(xì)胞凋亡的情況。結(jié)果表明(圖ll)，8Gy照后48h時(shí)細(xì)胞的凋亡率均較OGy組增加。而且，感染了 Ad-DCX, Ad-SPARC和Ad-DCX-SPARC細(xì)胞的凋亡率均高于空白對(duì)照組和空載腺病毒組(P〈0. 01), Ad-DCX-SPARC組凋亡率尤為顯著，表明增加DCX和SPARC的表達(dá)可提高輻射誘導(dǎo)的U-87MG細(xì)胞凋亡。
權(quán)利要求
1.DCX和SPARC雙基因共表達(dá)載體在制備放療增敏劑中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的應(yīng)用，其特征在于通過(guò)構(gòu)建DCX和SPARC雙基因共表達(dá)重組腺病毒載體實(shí)現(xiàn)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述重組腺病毒載體的構(gòu)建方法是 (1)針對(duì)DCX和SPARC基因序列，制備PCR引物，所述PCR引物由DCX 正義引物 GCAAGATCTATGAAAACACTCCCCCTTC、DCX 反義引物 TAAGGTACCTTACATGGAATCACCAAGCG、SPARC 正義引物 TAAGCGGCCGCATGAGGGCCTGGATCTT 和 SPARC 反義引物 TAGCTCGAGTTAGATCACAAGATCCTTGT 構(gòu)成，在 DCX 兩端分別引入 BglII 和KpnI酶切位點(diǎn)，SPARC兩端分別引入NotI和XhoI酶切位點(diǎn)，擴(kuò)增得到DCX和SPARC目的片段； (2)雙酶切目的基因PCR產(chǎn)物和pAdTrack-CMV-polyA-promoter空載體轉(zhuǎn)移質(zhì)粒，用T4 DNA連接酶將其4°C連接過(guò)夜，構(gòu)建單、雙基因重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒載體pAdTrack-CMV-DCX-polyA+promoter,pAdTrack-CMV-polyA+promoter-SPARC,和 pAdTrack-DCX-poIyA-promo t er-SPARC ； (3)將構(gòu)建的單、雙基因重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒用PmeI單酶切線性化后，與pAdEasy-Ι腺病毒骨架質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化BJ5183大腸桿菌，用PacI單酶切鑒定并轉(zhuǎn)化DH5 α大腸桿菌； (4)將成功重組的 pAd-polyA+promoter、pAd-DCX-polyA+promoter>pAd-poIyA+promoter-SPARC 和 pAd-DCX-polyA+promoter-SPARC 在 DH5 α 大腸桿菌擴(kuò)增抽提，PacI酶切線性化后用脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染293Α細(xì)胞，所得腺病毒為Ad_GFP，Ad-DCX, Ad-SPARC, Ad-DCX-SPARC。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了DCX和SPARC雙基因共表達(dá)載體在制備放療增敏劑中的應(yīng)用。通過(guò)構(gòu)建DCX和SPARC雙基因共表達(dá)重組腺病毒載體能夠有效提高膠質(zhì)瘤的放療敏感性。
文檔編號(hào)A61P35/00GK102836442SQ20121034034
公開(kāi)日2012年12月26日 申請(qǐng)日期2012年9月14日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月14日
發(fā)明者劉芬菊, 徐媛媛, 蔣昕, 俞家華 申請(qǐng)人:蘇州大學(xué)