專利名稱：Dc-cik細胞治療組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細胞免疫領(lǐng)域，具體地說是提供了一種DC-CIK細胞治療組合物，其是從臍帶血中分別擴增獲得高效的DC和CIK細胞，并共培養(yǎng)得到DC-CIK細胞，最終制備為細胞治療產(chǎn)品，用于臨床治療乳腺癌等多種惡性腫瘤。
背景技術(shù)：
細胞因子誘導(dǎo)的殺傷細胞(cytokineinduced killer cells, CIK cells)是介導(dǎo)細胞毒活性最強的免疫效應(yīng)細胞，兼具有T淋巴細胞的高度的殺瘤活性和NK細胞非主要組織相容性復(fù)合物(MHC)的限制性殺瘤效應(yīng)。CIK細胞同時表達CD3和CD56兩種膜蛋白分子，具有增殖速度快，殺瘤活性高，殺瘤譜廣等優(yōu)點，被認為是腫瘤過繼免疫治療的新希望。樹突狀細胞(Dendritic cells, DC)是體內(nèi)功能最強的抗原遞呈細胞(Antigenpresenting cell, APC)，能夠刺激初始的T淋巴細胞增殖，啟動免疫應(yīng)答；還能夠呈遞抗原給MHC-I類限制性CD8+和MHC-II類限制性CD4+T淋巴細胞，誘導(dǎo)特異性免疫反應(yīng)，被稱為“天然免疫佐劑”，因此在誘導(dǎo)免疫應(yīng)答中具有獨特的地位。近年來，以DC為基礎(chǔ)的免疫治療在臨床應(yīng)用中得到越來越廣泛的關(guān)注，是國內(nèi)外研究的熱點。DC-CIK細胞(或DC/CIK細胞)是指與DC共培養(yǎng)的CIK細胞。將CIK和同源DC細胞共培養(yǎng)后即可獲得DC-CIK細胞。共培養(yǎng)既可促進DC的成熟，更能促進ClK細胞的增殖，并加強其抗腫瘤活性。DC是機體免疫應(yīng)答的始動者，能夠誘導(dǎo)持久有力的特異性抗腫瘤免疫反應(yīng),CIK細胞可通過非特異性免疫殺傷作用清除腫瘤患者體內(nèi)微小殘余病灶，所以負載腫瘤抗原的DC與CIK細胞的有機結(jié)合(即DC-CIK細胞)能產(chǎn)生特異性和非特異性的雙重抗 腫瘤效應(yīng)。Marten實驗研究表明DC和CIK細胞共培養(yǎng)可以同時促進DC和CIK細胞的增殖和免疫功能。張嵩等的動物實驗研究表明化療后應(yīng)用DC-CIK細胞可有效抑制腫瘤細胞生長，甚至使腫瘤完全消失；而且DC-CIK細胞的抗腫瘤效應(yīng)對集體免疫系統(tǒng)功能不產(chǎn)生危害，在當前對腫瘤特異性抗原了解相對較少的情況下，應(yīng)用DC-CIK細胞作為腫瘤放化療和手術(shù)后的輔助治療有重要的臨床意義。趙春華等研究表明與DC共培養(yǎng)可使CIK細胞獲得更高的增殖速率和更強的體內(nèi)外抗腫瘤活性，DC-CIK細胞可以作為一種臨床有效的抗白血病免疫治療策略。童春容等臨床研究顯示=DC-CIK細胞治療具有明顯清除微小殘留白血病細胞防止復(fù)發(fā)的作用，并且靜脈輸注安全?，F(xiàn)有技術(shù)中的DC制備方法大多采用病人的外周血單個核細胞，存在細胞數(shù)目少，抗原遞呈能力差等缺點?，F(xiàn)有技術(shù)中的CIK細胞制備方法也大多采用病人的外周血單個核細胞，先加入IFN- Y，24小時后再加入其他細胞因子如IL-2、IL-I α繼續(xù)培養(yǎng)，這種方法制備出的CIK細胞存在繁殖能力差、細胞活性低等問題
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明通過細胞來源的選擇、培養(yǎng)方案的優(yōu)化、腫瘤特異性抗原提取和選擇等方面的改進，提供了一種新的DC-CIK細胞治療組合物及其制備方法，解決了現(xiàn)有DC-CIK細胞治療組合物中DC細胞數(shù)目少、抗原遞呈能力差，以及CIK細胞增殖能力差、殺瘤活性低的問題。本發(fā)明提供了一種細胞治療組合物，其包括治療有效量的樹突狀細胞(DC)和CIK細胞。其中，所述DC和CIK細胞均來源于臍帶血單個核細胞，優(yōu)選地，它們從同一份臍帶血單個核細胞樣品貼壁培養(yǎng)后分離的貼壁細胞和懸浮細胞分別培養(yǎng)得到。本發(fā)明的細胞治療組合物使用特殊的方法制備得到，該方法包括如下步驟(I)將臍帶血單個核細胞用含有臍帶血血漿的培養(yǎng)基貼壁培養(yǎng)過夜后，吸出懸浮細胞，向貼壁細胞中加入含有rhGM-CSF、rhIL-4、SCF和Flt3_L的上述培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)； 隔天半量換液，并補加rhGM-CSF和rhIL-4以保持培養(yǎng)基中其濃度不變；于培養(yǎng)的第5天加 入腫瘤特異性抗原刺激，第6天加入rhTNF- α，再繼續(xù)培養(yǎng)2_3天；(2)向步驟(I)中吸出的懸浮細胞用含有臍帶血血漿的培養(yǎng)基懸浮后加入rhIFN- Y，培養(yǎng)24h后，轉(zhuǎn)入細胞培養(yǎng)瓶中，并加入rhIL_2、rhIL-1 α、SCF和Flt3_L，繼續(xù)培養(yǎng)10天；隔天半量換液，并補加rhIL-2以保持培養(yǎng)基中其濃度不變；(3)將步驟(I)得到的DC與步驟(2)得到的CIK細胞混合，混合后培養(yǎng)條件不變，繼續(xù)培養(yǎng)3-7天獲得成熟的DC-CIK細胞；共培養(yǎng)過程中隔天半量換液，并補加rhIL-2以保持培養(yǎng)基中其濃度不變。其中，培養(yǎng)DC和CIK細胞所用的培養(yǎng)基選自完全RPMI-1640培養(yǎng)基、GT-T551培養(yǎng)基或AM-V培養(yǎng)基，優(yōu)選GT-T551培養(yǎng)基；培養(yǎng)基中含O. 3-10%臍帶血血漿，優(yōu)選含O. 6%臍帶血血漿，最優(yōu)選地，所述臍帶血血漿為自體臍帶血血漿。在一個特定的實施方案中，所述腫瘤特異性抗原為乳腺癌細胞系ZR-751提取的抗原蛋白。在另一個特定的實施方案中，加入的細胞因子rhGM-CSF、rhIL_4、SCF, Flt3_L、rhTNF- α、rhIFN-Y、rhIL_2 和 rhIL-1 α 的終濃度分別為 30ng/mL、10ng/mL、5ng/mL、3ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、50ng/mL 和 5ng/mL,腫瘤特異性抗原的終濃度為 5μ g/mL。在本發(fā)明的第二方面，提供了一種細胞治療試劑盒，其包含本發(fā)明的細胞治療組合物。在本發(fā)明的第三方面，還提供了一種細胞治療組合物的制備方法，包括如下步驟( I)將臍帶血單個核細胞用含有臍帶血血漿的培養(yǎng)基貼壁培養(yǎng)2h后，吸出懸浮細胞，向貼壁細胞中加入含有rhGM-CSF、rhIL-4、SCF和Flt3_L的上述培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)；隔天半量換液，并補加rhGM-CSF、rhIL-4以保持培養(yǎng)基中其濃度不變；于培養(yǎng)的第5天加入腫瘤特異性抗原刺激，第6天加入rhTNF- α，再繼續(xù)培養(yǎng)2-3天；(2)向步驟(I)中吸出的懸浮細胞用含有臍帶血血漿的培養(yǎng)基懸浮后加入rhIFN- Y，培養(yǎng)24h后，轉(zhuǎn)入細胞培養(yǎng)瓶中，并加入rhIL_2、rhIL-1 α、SCF和Flt3_L，繼續(xù)培養(yǎng)10天；隔天半量換液，并補加rhIL-2以保持培養(yǎng)基中其濃度不變； (3)將步驟(I)得到的DC與步驟(2)得到的CIK細胞混合，混合后培養(yǎng)條件不變，繼續(xù)培養(yǎng)3-7天獲得成熟的DC-CIK細胞；共培養(yǎng)過程中隔天半量換液，并補加rhIL-2以保持培養(yǎng)基中其濃度不變。其中，培養(yǎng)DC和CIK細胞所用的培養(yǎng)基選自完全RPMI-1640培養(yǎng)基、GT-T551培養(yǎng)基或AM-V培養(yǎng)基，優(yōu)選GT-T551培養(yǎng)基；培養(yǎng)基中含O. 3-10%臍帶血血漿，優(yōu)選含O. 6%臍帶血血漿，最優(yōu)選地，所述臍帶血血漿為自體臍帶血血漿。在一個特定的實施方案中，所述腫瘤特異性抗原為乳腺癌細胞系ZR-751提取的抗原蛋白。在另一個特定的實施方案中，加入的細胞因子rhGM-CSF、rhIL_4、SCF, Flt3_L、rhTNF- α、rhIFN-Y、rhIL_2 和 rhIL-1 α 的終濃度分別為 30ng/mL、10ng/mL、5ng/mL、3ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、50ng/mL 和 5ng/mL,腫瘤特異性抗原的終濃度為 5 μ g/mL。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，該方法包括下列步驟(I)采用密度梯度離心法，用Ficoll人淋巴細胞分離液分離新鮮人臍帶血，得到單個核細胞，加入含O. 6%自體臍帶血血漿的GT-T551培養(yǎng)基5mL，貼壁過夜；(2)吸出懸浮細胞，向貼壁細胞中加入含O. 6%自體臍帶血血漿的GT-T551培養(yǎng)基5mL，并加入 rhGM-CSF 30ng/mL、rhIL_410ng/mL、SCF 5ng/mL 和 Flt3_L 3ng/mL，置 37°C5% CO2孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)；隔天半量換液，并補加rhGM-CSF和rhIL_4以保持培養(yǎng)基中其濃度不變；(3)于培養(yǎng)的第5天加入乳腺癌細胞系ZR-751提取的抗原蛋白5 μ g/mL刺激，第6天加入rhTNF- a 10ng/mL,再繼續(xù)培養(yǎng)2-3天得到DC ；(4)將步驟(2)中吸出的懸浮細胞用含有O. 6%自體臍帶血血漿和80U/ml慶大霉素的GT-T551培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度為I X IO6個/ml接種于6孔板內(nèi)，每孔2ml，并加入rhIFN-Y50ng/ml，放置 37°C，5% CO2 孵育箱中培養(yǎng)；(5)培養(yǎng)24h后，轉(zhuǎn)入細胞培養(yǎng)瓶中，并加入50ng/mL rhIL_2、5ng/mL rhIL-1 α、5ng/mLSCF和3ng/mL Flt3_L，在37°C、5%C02培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)；隔天半量換液，并補加rhIL-2以保持培養(yǎng)基中其濃度不變；在37°C、5%C02培養(yǎng)箱中總共培養(yǎng)11天得到CIK細胞；(6)將步驟(3)得到的DC與步驟(5)得到的CIK細胞混合，混合后培養(yǎng)條件不變，繼續(xù)培養(yǎng)3-7天獲得成熟的DC-CIK細胞；共培養(yǎng)過程中隔天半量換液，并補加rhIL-2以保持培養(yǎng)基中其濃度不變。采用本方明的方法制備細胞治療組合物，得到的CIK細胞純度高，增殖能力強；DC純度高，抗原遞呈能力強，并能有效促進CIK細胞增殖，并增強其殺瘤活性；DC-CIK細胞相比單純的CIK細胞，⑶3+⑶56+細胞百分比更高，對腫瘤細胞的殺傷活性也顯著更高。


圖I不同培養(yǎng)時間DC的形態(tài)。A C分別為培養(yǎng)第1、7、9天細胞在倒置顯微鏡下的形態(tài)，放大倍率均為20 X。圖2不同培養(yǎng)時間DC的流式細胞分析結(jié)果。A C分別為培養(yǎng)第1、7、9天的DC。圖3不同培養(yǎng)時間DC中⑶I α、HLA-DR、⑶80、⑶83、⑶86陽性細胞的比例。圖4Α培養(yǎng)第I天的CIK細胞在倒置顯微鏡下的形態(tài)，放大倍率為20 X。圖4Β培養(yǎng)第7天的CIK細胞在倒置顯微鏡下的形態(tài)，放大倍率為10 X。圖4C培養(yǎng)第14天的CIK細胞在倒置顯微鏡下的形態(tài)，放大倍率為IOX。
圖5A培養(yǎng)第I天的CIK細胞的姬姆薩染色形態(tài)，放大倍率為20 X。圖5B培養(yǎng)第14天的CIK細胞的姬姆薩染色形態(tài)，放大倍率為20 X。圖6臍帶血來源CIK細胞的生長曲線。第一組采用本發(fā)明的方法(實施例4)；第二組在上述培養(yǎng)體系中不添加SCF和Flt3-L ;第三組在上述培養(yǎng)體系中，不添加rhIL-Ι α ;第四組在上述培養(yǎng)體系中，換用添加相應(yīng)比例的胎牛血清；第五組在上述培養(yǎng)體系中，每天補加rhIL-2。
具體實施例方式實施例I臍帶血單個核細胞的分離自體臍帶血血漿的制備I.無菌采集足月順產(chǎn)胎兒斷臍后的臍帶血一份，枸櫞酸抗凝，置離心管內(nèi)離心15 分鐘。2.吸取上清大約30ml，放入離心管內(nèi)，繼續(xù)離心15分鐘，收集上清血漿。3.將收集到的血漿放入56°C水浴30分鐘，滅活補體。4.離心除去管中絮狀沉淀物，將上清移至新的離心管中分裝凍存?zhèn)溆?。臍帶血單個核細胞的分離I.將分離完上層血漿的臍帶血，混勻按照I: I的比例與生理鹽水混勻，再按6:1的比例與6. 0% (w/v)的羥乙基淀粉(HESpan)混勻，室溫靜置30分鐘，待紅細胞自然沉降至界限分明，沉降紅細胞。2.吸出上清，置50ml離心管中，25°C、1800rpm離心5分鐘。3.在15ml的離心管中加入5ml Ficoll人淋巴細胞分離液，再緩緩沿管壁加入5ml細胞懸液，250C、1800rpm離心25分鐘，分離出單個核細胞。4.收集界面單個核細胞，用PBS洗滌。5.用PBS懸浮細胞計數(shù)，備用。實施例2 DC的制備I.將分離得到的單個核細胞接種到T25細胞培養(yǎng)瓶中，置37°C CO2孵箱中貼壁過夜，分離懸浮細胞并轉(zhuǎn)移至新的T25細胞培養(yǎng)瓶。2.向貼壁的細胞中加入含O. 6%自體臍帶血血漿的GT-T551培養(yǎng)基(日本TAKARA原裝進口無血清淋巴細胞、樹突狀細胞培養(yǎng)基，由寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司提供)5mL，并加Λ rhGM-CSF 30ng/mL、rhIL_410ng/mL、5ng/mL SCF 和 3ng/mL Flt3_L，置 37°C 5%(02孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)。3.隔天半量換液，補加含rhGM-CSF和rhIL-4的完全培養(yǎng)基，使細胞因子的濃度保持不變。4.于培養(yǎng)的第5天加入乳腺癌細胞系ZR-751提取的抗原蛋白5 μ g/mL刺激，第6天加入rhTNF- a 10ng/mL,繼續(xù)培養(yǎng)1-4天。5.分別取培養(yǎng)第1、7、9天的細胞，在倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，如圖I所示。隨著培養(yǎng)過程的進行，細胞由典型的球形單個核細胞形態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)镈C形態(tài)。實施例3 DC的免疫表型檢測分別取培養(yǎng)第1、7、9天的細胞，用無鈣鎂PBS洗2次后，各取lX105/mL，分別加入相應(yīng)的FCM管中。加入待檢測單克隆抗體包括⑶I α、HLA-DR、⑶80、⑶83、⑶86抗體各5μ 1，4°C避光孵育30分鐘，每10分鐘搖晃I次，使細胞與抗體充分接觸。用PBS洗2次，并重懸在400μ I的PBS中，采用流式細胞儀FASCSCalibur (BD Biosciences)檢測，結(jié)果見圖2、表I、圖3。表I不同培養(yǎng)時間DC的免疫表型
權(quán)利要求
1.一種細胞治療組合物，包括治療有效量的樹突狀細胞(DC)和CIK細胞。
2.權(quán)利要求I所述的細胞治療組合物，其中所述DC和CIK細胞均來源于臍帶血單個核細胞。
3.權(quán)利要求2所述的細胞治療組合物，其中DC和CIK細胞分別從同一份臍帶血單個核細胞的貼壁細胞和懸浮細胞培養(yǎng)得到。
4.權(quán)利要求I所述的細胞治療組合物，其通過以下步驟制備得到 (1)將臍帶血單個核細胞用含有臍帶血血漿的培養(yǎng)基貼壁培養(yǎng)過夜后，吸出懸浮細胞，向貼壁細胞中加入含有rhGM-CSF、rhIL-4、SCF和Flt3_L的上述培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)；隔天半量換液，并補加rhGM-CSF和rhIL-4以保持培養(yǎng)基中其濃度不變；于培養(yǎng)的第5天加入腫瘤特異性抗原刺激，第6天加入rhTNF- α，再繼續(xù)培養(yǎng)2-3天； (2)向步驟(I)中吸出的懸浮細胞用含有臍帶血血漿的培養(yǎng)基懸浮后加入rhIFN-Y，培養(yǎng)24h后，轉(zhuǎn)入細胞培養(yǎng)瓶中，并加入rhIL-2、rhIL-1 a、SCF和Flt3_L，繼續(xù)培養(yǎng)IOd ；隔天半量換液，并補加rhIL-2以保持培養(yǎng)基中其濃度不變； (3 )將步驟(I)得到的DC與步驟(2 )得到的CIK細胞混合，混合后培養(yǎng)條件不變，繼續(xù)培養(yǎng)3-7天獲得成熟的DC-CIK細胞；共培養(yǎng)過程中隔天半量換液，并補加rhIL-2以保持培養(yǎng)基中其濃度不變。
5.權(quán)利要求4所述的細胞治療組合物，其中培養(yǎng)DC和CIK細胞所用的培養(yǎng)基選自完全RPMI-1640培養(yǎng)基、GT-T551培養(yǎng)基或AM-V培養(yǎng)基。
6.權(quán)利要求5所述的細胞治療組合物，其中，培養(yǎng)DC和CIK細胞所用的培養(yǎng)基為GT-T551培養(yǎng)基。
7.權(quán)利要求4所述的細胞治療組合物，其中，培養(yǎng)DC和CIK細胞所用的培養(yǎng)基中含O.3-10%臍帶血血漿。
8.權(quán)利要求7所述的細胞治療組合物，其中，所述培養(yǎng)基中含O.6%臍帶血血漿。
9.權(quán)利要求3-8任一項所述的細胞治療組合物，其中，所述臍帶血血漿為自體臍帶血血漿。
10.權(quán)利要求4所述的細胞治療組合物，其中，所述腫瘤特異性抗原為乳腺癌細胞系ZR-751提取的抗原蛋白。
11.權(quán)利要求4所述的細胞治療組合物，其中，加入的細胞因子rhGM-CSF、rhIL-4、SCF、Flt3-L、rhTNF-a、rhIFN-Y、rhIL-2 和 rhIL-1 α 的終濃度分別為 30ng/mL、10ng/mL、5ng/mL、3ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、50ng/mL 和 5ng/mL,腫瘤特異性抗原的終濃度為 5 μ g/mL。
12.—種細胞治療試劑盒，包含權(quán)利要求1-11任一項所述細胞治療組合物。
13.權(quán)利要求I所述細胞治療組合物的制備方法，包括下列步驟 (1)將臍帶血單個核細胞用含有臍帶血血漿的培養(yǎng)基貼壁培養(yǎng)過夜后，吸出懸浮細胞，向貼壁細胞中加入含有rhGM-CSF、rhIL-4、SCF和Flt3_L的上述培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)；隔天半量換液，并補加rhGM-CSF和rhIL-4以保持培養(yǎng)基中其濃度不變；于培養(yǎng)的第5天加入腫瘤特異性抗原刺激，第6天加入rhTNF- α，再繼續(xù)培養(yǎng)2-3天； (2)將步驟(I)中吸出的懸浮細胞用含有臍帶血血漿的培養(yǎng)基懸浮后加入rhIFN-Y，培養(yǎng)24h后，轉(zhuǎn)入細胞培養(yǎng)瓶中，并加入rhIL-2、rhIL-la、SCF和Flt3_L，繼續(xù)培養(yǎng)10天；隔天半量換液，并補加rhIL-2以保持培養(yǎng)基中其濃度不變；(3 )將步驟(I)得到的DC與步驟(2 )得到的CIK細胞混合，混合后培養(yǎng)條件不變，繼續(xù)培養(yǎng)3-7天獲得成熟的DC-CIK細胞；共培養(yǎng)過程中隔天半量換液，并補加rhIL-2以保持培養(yǎng)基中其濃度不變。
14.權(quán)利要求13所述的制備方法，其中培養(yǎng)DC和CIK細胞所用的培養(yǎng)基選自RPMI-1640培養(yǎng)基、GT-T551培養(yǎng)基或AM-V培養(yǎng)基。
15.權(quán)利要求14所述的制備方法，其中，培養(yǎng)DC和CIK細胞所用的培養(yǎng)基為GT-T551培養(yǎng)基。
16.權(quán)利要求13所述的制備方法，其中，培養(yǎng)DC和CIK細胞所用的培養(yǎng)基中含O.3-10%臍帶血血衆(zhòng)。
17.權(quán)利要求16所述的制備方法，其中，所述培養(yǎng)基中含O.6%臍帶血血漿。
18.權(quán)利要求13-17任一項所述的制備方法，其中，所述臍帶血血漿為自體臍帶血血漿。
19.權(quán)利要求13所述的制備方法，其中，所述腫瘤特異性抗原為乳腺癌細胞系ZR-751提取的抗原蛋白。
20.權(quán)利要求13所述的制備方法，其中，加入的細胞因子rhGM-CSF、rhIL_4、SCF,Flt3-L、rhTNF-α、rhIFN-Y、rhIL-2 和 rhIL-1 α 的終濃度分別為 30ng/mL、10ng/mL、5ng/mL、3ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、50ng/mL 和 5ng/mL,腫瘤特異性抗原的終濃度為 5 μ g/mL。
21.權(quán)利要求13所述的制備方法，包括下列步驟 (1)采用密度梯度離心法，用Ficoll人淋巴細胞分離液分離新鮮人臍帶血，得到單個核細胞，加入含O. 6%自體臍帶血血漿的GT-T551培養(yǎng)基5mL，貼壁過夜； (2)吸出懸浮細胞，向貼壁細胞中加入含O.6%自體臍帶血血漿的GT-T551培養(yǎng)基5mL，并加入 rhGM-CSF 30ng/mL、rhIL_4 10ng/mL、SCF 5ng/mL 和 Flt3_L3ng/mL，置 37°C 5% CO2孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)；隔天半量換液，并補加rhGM-CSF和rhIL-4以保持培養(yǎng)基中其濃度不變； (3)于培養(yǎng)的第5天加入乳腺癌細胞系ZR-751提取的抗原蛋白5μ g/mL刺激，第6天加入rhTNF- a 10ng/mL,再繼續(xù)培養(yǎng)2-3天得到DC ； (4)將步驟(2)中吸出的懸浮細胞用含有O.6%自體臍帶血血漿的GT-T551培養(yǎng)基調(diào)整細胞密度為I X IO6個/ml接種于6孔板內(nèi)，每孔2ml，并加入rhIFN- y 50ng/ml，放置37°C，5% CO2孵育箱中培養(yǎng)； (5)培養(yǎng)24h后，轉(zhuǎn)入細胞培養(yǎng)瓶中，并加入50ng/mLrhIL_2、5ng/mL rhIL-1 a、5ng/mL SCF和3ng/mL Flt3_L，在37°C、5%C02培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)；隔天半量換液，并補加rhIL_2以保持培養(yǎng)基中其濃度不變；在37°C、5%C02培養(yǎng)箱中總共培養(yǎng)11天得到CIK細胞； (6)將步驟(3)得到的DC與步驟(5)得到的CIK細胞混合，混合后培養(yǎng)條件不變，繼續(xù)培養(yǎng)3-7天獲得成熟的DC-CIK細胞；共培養(yǎng)過程中隔天半量換液，并補加rhIL-2以保持培養(yǎng)基中其濃度不變。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種臍帶血來源的DC-CIK細胞治療組合物，其中，DC和CIK細胞來源于同一份臍帶血單個核細胞。本發(fā)明還提供了DC-CIK細胞治療組合物的制備方法，采用本方明的方法制備細胞治療組合物，得到的CIK細胞純度高，增殖能力強；DC純度高，抗原遞呈能力強，有效促進CIK細胞增殖并增強其殺瘤活性；DC-CIK細胞相比單純的CIK細胞，CD3+CD56+細胞百分比更高，對腫瘤細胞的殺傷活性也顯著更高。
文檔編號A61K35/44GK102861107SQ20121034739
公開日2013年1月9日 申請日期2012年9月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月18日
發(fā)明者裴雪濤, 吳明遠, 史高娜, 李會, 劉大慶, 南雪, 吉海杰, 李娜, 陳琳, 習佳飛 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院野戰(zhàn)輸血研究所, 北京和澤普瑞生物科技有限公司