脂肪組織祖細(xì)胞在預(yù)防或治療肝炎中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及脂肪組織祖細(xì)胞在預(yù)防或治療肝炎中的應(yīng)用。具體地，脂肪組織祖細(xì)胞(即SVF)這類脂肪組織有核細(xì)胞具有極其優(yōu)異的預(yù)防或治療肝炎(尤其是乙型肝炎)的作用。給需要的對(duì)象施用本發(fā)明的藥物組合物，對(duì)于肝炎(尤其是乙型肝炎)有顯著的預(yù)防或治療作用，可以使多種表面抗原或抗體的定量下降，肝炎病毒DNA顯著減少，并減低AST和ALT，促進(jìn)了肝功能的修復(fù)。本發(fā)明還提供了一種預(yù)防和治療肝炎的方法。
【專利說明】脂肪組織祖細(xì)胞在預(yù)防或治療肝炎中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于干細(xì)胞及生物醫(yī)藥領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及脂肪組織祖細(xì)胞在預(yù)防或治療肝炎中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]乙型肝炎是世界上特別是我國(guó)的一種主要的疾病，其發(fā)病兇險(xiǎn)，進(jìn)展迅速，大部分患者預(yù)后不良，并且迅速出現(xiàn)大面積肝細(xì)胞壞死，從而導(dǎo)致肝功能嚴(yán)重受損，肝臟代謝、排泄和解毒的功能也有減退。乙型肝炎可以導(dǎo)致機(jī)體免疫能力下降，因此形成了惡性循環(huán)。
[0003]目前臨床上針對(duì)乙型肝炎的治療手段主要是血漿置換和肝移植，血漿置換費(fèi)用龐大且危險(xiǎn)性高，肝移植由于供體缺乏，很多患者在等待移植供體期間死亡。因此，及時(shí)有效的肝功能支持和促進(jìn)肝細(xì)胞再生是幫助肝功能衰竭患者無需肝移植而自行恢復(fù)的重要醫(yī)療手段。
[0004]干細(xì)胞治療是指將干細(xì)胞或由其分化產(chǎn)生的功能細(xì)胞植入病變部位以代償病變細(xì)胞喪失的功能，或?qū)⒓?xì)胞經(jīng)體外遺傳技術(shù)操作后用于疾病治療的方法。自肝細(xì)胞移植治療技術(shù)發(fā)展以來，治療細(xì)胞從最初的同種異體成熟肝細(xì)胞，發(fā)展到異種肝細(xì)胞、胎肝細(xì)胞、肝干細(xì)胞、骨髓干細(xì)胞、臍血干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞。其中肝內(nèi)的干細(xì)胞因取材困難、分離培養(yǎng)復(fù)雜而難以廣泛應(yīng)用；胎肝細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞由于胚胎的來源涉及倫理學(xué)等問題，被限制應(yīng)用。
[0005]脂肪組織通常被認(rèn)為是貯存能量及內(nèi)分泌器官，是軟組織填充和吸脂處理的必要組織。同時(shí)還被認(rèn)為是成體干細(xì)胞的有效來源，因?yàn)橹窘M織含有多種的祖細(xì)胞，可分化為多種譜系。脂肪組織中主要包含脂肪細(xì)胞、ASCs、血管內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)爭(zhēng)SCs被認(rèn)為是一種表現(xiàn)脂肪細(xì)胞和血管細(xì)胞的祖細(xì)膨目，它位于脂肪細(xì)胞之間、血管周圍或細(xì)胞外基質(zhì)中，可促進(jìn)脂肪組織的轉(zhuǎn)歸。
[0006]脂肪組織中的祖細(xì)胞(SVF)含有非常復(fù)雜的細(xì)胞成分，包括內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、血管周細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、前脂肪細(xì)胞和分化潛能確定的其它前體細(xì)胞等，這類脂肪組織中的有核細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)可獲得可塑性極強(qiáng)的脂肪組織來源的間充質(zhì)干細(xì)胞。但脂肪組織的轉(zhuǎn)歸是一個(gè)很漫長(zhǎng)的過程，成年人平均每年大約有10%左右的脂肪細(xì)胞被更新，而ASCs又存在于脂肪組織的間質(zhì)血管碎片中。
[0007]目前本領(lǐng)域還沒有一種有效的治療肝炎的方法，因此迫切需要開發(fā)經(jīng)濟(jì)有效地預(yù)防或治療肝炎的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的就是提供脂肪組織祖細(xì)胞在治療乙肝中的應(yīng)用。
[0009]在本發(fā)明的第一方面，提供了一種脂肪組織祖細(xì)胞的用途，它被用于制備預(yù)防和/或治療肝炎的藥物組合物。
[0010]在另一優(yōu)選例中，所述的肝炎選自下組:病毒性肝炎、酒精性肝炎、自身免疫性肝炎、藥物性肝炎、或其組合。
[0011]在另一優(yōu)選例中，所述的病毒性肝炎選自下組:甲肝、乙肝、丙肝、丁肝、戊肝。
[0012]在另一優(yōu)選例中，所述的肝炎為乙肝。
[0013]在另一優(yōu)選例中，所述的脂肪組織祖細(xì)胞具有選自下組的任一或多種特征:
[0014]⑴30%以上的細(xì)胞具有表面抗原⑶29 ； [0015](ii)50%以上的細(xì)胞具有表面抗原⑶73 ；
[0016](iii)90%以上的細(xì)胞具有表面抗原⑶49d ；
[0017](iv)60%以上的細(xì)胞具有表面抗原⑶90。
[0018]在另一優(yōu)選例中，35%以上的細(xì)胞具有表面抗原⑶29。
[0019]在另一優(yōu)選例中，55%以上的細(xì)胞具有表面抗原⑶73。
[0020]在另一優(yōu)選例中，92%以上的細(xì)胞具有表面抗原⑶49d。
[0021]在另一優(yōu)選例中，65%以上的細(xì)胞具有表面抗原⑶90。
[0022]在另一優(yōu)選例中，所述的脂肪組織祖細(xì)胞具有選自下組的任一或多種特征:
[0023](V) 85%以下的細(xì)胞具有表面抗原⑶34 ；
[0024](vi) 15%以下的細(xì)胞具有表面抗原⑶45。
[0025]在另一優(yōu)選例中，80%以下的細(xì)胞具有表面抗原⑶34。
[0026]在另一優(yōu)選例中，12%以下的細(xì)胞具有表面抗原⑶45。
[0027]在另一優(yōu)選例中，所述的脂肪組織祖細(xì)胞分泌選自下組的細(xì)胞因子:干細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、血小板衍生因子(TOGF)、人轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β (TGF-β)、巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、白介素-2 (IL-2)、白介素-10 (IL-10)、或其
任意組合。
[0028]在另一優(yōu)選例中，脂肪組織祖細(xì)胞分泌的干細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)的濃度≥0.5ng/ml ο
[0029]在另一優(yōu)選例中，脂肪組織祖細(xì)胞分泌的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的濃度≥35pg/ml,較佳地≥40pg/mL.[0030]在另一優(yōu)選例中，脂肪組織祖細(xì)胞分泌的人轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β (TGF-β)的濃度^ 150pg/ml,較佳地 > 180pg/ml。
[0031]在另一優(yōu)選例中，脂肪組織祖細(xì)胞分泌的白介素-2(IL_2)的濃度≥15pg/ml，較佳地≥20pg/ml，更佳地≥30pg/ml。
[0032]在另一優(yōu)選例中，脂肪組織祖細(xì)胞分泌的白介素-1O(IL-1O)的濃度≥15pg/ml，較佳地≥20pg/ml,更佳地≥30pg/ml,最佳地≥40pg/ml。
[0033]在本發(fā)明的第二方面，提供了一種用于預(yù)防和/或治療肝炎的藥物組合物，所述的藥物組合物包括:有效量的脂肪組織祖細(xì)胞，以及藥學(xué)上可接受的載體。
[0034]在另一優(yōu)選例中，所述的藥學(xué)上可接受的載體包括(但并不限于):鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。
[0035]在另一優(yōu)選例中，所述的藥物組合物為皮下注射試劑。
[0036]在另一優(yōu)選例中，所述的皮下注射試劑中脂肪組織祖細(xì)胞的濃度為0.1-100X104個(gè)/ml，較佳地為1-10 X IO4個(gè)/ml，更佳地為2-5 X IO5個(gè)/ml。
[0037]在本發(fā)明的第三方面，提供了一種預(yù)防和/或治療肝炎的方法，包括步驟:給需要的對(duì)象施用脂肪組織祖細(xì)胞、或含有脂肪組織祖細(xì)胞的藥物組合物。
[0038]在另一優(yōu)選例中，所述的對(duì)象為人或非人哺乳動(dòng)物。
[0039]在另一優(yōu)選例中，所述的非人哺乳動(dòng)物為鼠、兔、牛、羊、豬等。
[0040]在另 一優(yōu)選例中，所述方法包括步驟:給需要的對(duì)象靜脈回輸所述的脂肪組織祖細(xì)胞，或含有脂肪組織祖細(xì)胞的藥物組合物。
[0041]應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實(shí)施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在
此不再一一累述。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0042]下列附圖用于說明本發(fā)明的具體實(shí)施方案，而不用于限定由權(quán)利要求書所界定的本發(fā)明范圍。
[0043]圖1顯示了用流式細(xì)胞儀法對(duì)制備的脂肪組織祖細(xì)胞進(jìn)行表面抗原標(biāo)記表達(dá)的分析結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0044]本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，首次意外地發(fā)現(xiàn)，脂肪組織祖細(xì)胞具有極其優(yōu)異的預(yù)防或治療肝炎(尤其是乙型肝炎)的作用。具體地，給需要的對(duì)象施用本發(fā)明的含有脂肪組織祖細(xì)胞的藥物組合物，對(duì)于肝炎有顯著的預(yù)防或治療作用，可以使多種表面抗原下降，病毒DNA顯著減少，并減低ALT，促進(jìn)肝功能的修復(fù)。本發(fā)明還提供了一種預(yù)防和治療肝炎的方法以及含有脂肪組織祖細(xì)胞的藥物組合物。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
[0045]術(shù)語
[0046]如本文所用，術(shù)語“以上”和“以下”包括本數(shù)，例如“95%以上“指≥95%, “0.2%以下”指≤0.2%。
[0047]肝炎
[0048]如本文所用，術(shù)語“肝炎”任選自下組:病毒性肝炎、酒精性肝炎、自身免疫性肝炎、藥物性肝炎、或其組合。本發(fā)明所述的肝炎優(yōu)選為病毒性肝炎，病毒性肝炎可以選自下組:甲肝、乙肝、丙肝、丁肝、戊肝。
[0049]在本發(fā)明中，所述的肝炎優(yōu)選為乙肝。
[0050]脂肪
[0051]自體脂肪是整形和抗衰老治療的優(yōu)良來源，脂肪組織材料可以來源于腰部、臀部、腹部、大腿、上臂等部位。本領(lǐng)域技術(shù)人員可采用通用的技術(shù)方法獲得自體脂肪組織，包括(但不限于)抽吸、手術(shù)分離等方法。
[0052]在本發(fā)明中，脂肪組織或脂肪原料沒有特別限制，可以是來源于動(dòng)物或人的任何部位的脂肪組織，優(yōu)選人的脂肪組織。較佳地，脂肪組織可以是腰部、臀部、腹部、大腿、上臂等部位的組織。
[0053]脂肪組織祖細(xì)胞
[0054]間質(zhì)血管碎片(SVF,Stromal Vascular fraction)
[0055]如本文所用，術(shù)語“脂肪組織祖細(xì)胞”、“ SVF “、“脂肪組織有核細(xì)胞”或“間質(zhì)血管碎片”可以互換使用。
[0056]脂肪組織祖細(xì)胞是從脂肪組織中分離得到的一種具有多向分化潛能的干細(xì)胞。脂肪組織祖細(xì)胞能夠在體外穩(wěn)定增殖且衰亡率低，它取材容易、體內(nèi)儲(chǔ)備量大、適宜大規(guī)模培養(yǎng)、對(duì)機(jī)體損傷小、來源廣泛、適宜自體移植。脂肪組織祖細(xì)胞是干細(xì)胞輔助脂肪移植中最重要的組分。通過膠原酶消化，從脂肪組織中分離的多種細(xì)胞混合物形成的細(xì)胞團(tuán)就叫做間質(zhì)血管碎片。間質(zhì)血管碎片中含有豐富的間充質(zhì)細(xì)胞，可分化為多種譜系的細(xì)胞，是再生醫(yī)學(xué)、組織工程等最理想的種子細(xì)胞，
[0057]本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠使用通用的方法進(jìn)行脂肪組織祖細(xì)胞的分離和純化。
[0058]如本文所用，術(shù)語“分離方法”、“本發(fā)明方發(fā)明方法”、“脂肪組織祖細(xì)胞的分離方法”可以互換使用，都指從原始的脂肪組織中獲得分離的脂肪組織祖細(xì)胞的方法和過程。對(duì)于獲得的脂肪組織祖細(xì)胞的脂肪細(xì)胞材料，首先進(jìn)行洗滌，除去血細(xì)胞；脂肪破碎，消化；去除未消化的組織，獲得含脂肪組織祖細(xì)胞的濾液；離心得到脂肪組織祖細(xì)胞。得到的脂肪組織祖細(xì)胞可以用于進(jìn)一步傳代、培養(yǎng)或凍存。[0059]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，分離脂肪組織祖細(xì)胞可以包括步驟(但不限于):將吸脂后的脂肪用PBS反復(fù)沖洗兩次，然后在37°C條件下用膠原酶消化30min，1200g離心IOmin后即獲得高密度的SVF碎片，其中主要包括間質(zhì)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和壁細(xì)胞。另外，脂肪組織祖細(xì)胞中也包括一些血管來源的細(xì)胞，如白細(xì)胞和紅細(xì)胞等，各種細(xì)胞之間具有協(xié)同效應(yīng)。
[0060]脂肪組織祖細(xì)胞的抗原檢測(cè)
[0061]用本發(fā)明使用的脂肪組織祖細(xì)胞具有很高的純度，基本上不含有其他類型的細(xì)胞或干細(xì)胞。這可通過細(xì)胞表面抗原的檢測(cè)加以驗(yàn)證。
[0062]脂肪組織祖細(xì)胞具有多種特異性抗原和受體，主要有⑶3、⑶13、D29、⑶34、⑶45、CD49e、CD59、CD73、CD90、CD105、HLA-ABC 等。
[0063]⑶34抗原是一種高度糖基化I型跨膜蛋白，它選擇性的表達(dá)于人類造血干細(xì)胞(HSC)，祖細(xì)胞(PC)和血管內(nèi)皮細(xì)胞(EC)表面，帶有CD34的脂肪組織祖細(xì)胞在總干細(xì)胞的比例優(yōu)選為≤0.2%，更佳地，≤0.2%。
[0064]⑶45存在于所有造血細(xì)胞的表面，包括造血干細(xì)胞和破骨細(xì)胞。帶有⑶45的脂肪組織祖細(xì)胞在總干細(xì)胞的比例優(yōu)選為< 0.1%。
[0065]⑶29、⑶73、⑶49d、⑶90等主要存在于脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞表面。
[0066]帶有⑶29的脂肪組織祖細(xì)胞在總干細(xì)胞的比例優(yōu)選為> 30%,更佳地> 32%，最佳地≥35%。
[0067]帶有⑶73的脂肪組織祖細(xì)胞在總干細(xì)胞的比例優(yōu)選為> 50%,更佳地> 60%,最佳地≥70%ο
[0068]帶有⑶49d的脂肪組織祖細(xì)胞在總干細(xì)胞的比例優(yōu)選為> 85%，更佳地> 90%,最佳地≥ 95%。
[0069]帶有⑶90的脂肪組織祖細(xì)胞在總干細(xì)胞的比例優(yōu)選為> 55%，更佳地> 60%,最佳地≥65%。
[0070]本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員可以使用通用的方法檢測(cè)脂肪組織祖細(xì)胞的純度和分化程度，如流式細(xì)胞儀法。檢測(cè)時(shí)，加入不同的與有針對(duì)性的特異抗體，抗體可以是完整的單克隆或多克隆抗體，也可以是具有免疫活性的抗體片段，如Fab’或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子(Ladner等人,美國(guó)專利N0.4，946，778);或嵌合抗體,如具有鼠抗體結(jié)合特異性但仍保留來自人的抗體部分的抗體。加入抗體與細(xì)胞表面的抗原結(jié)合一定時(shí)間，用流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞進(jìn)行自動(dòng)分析和分選。
[0071]脂肪組織祖細(xì)胞的細(xì)胞分泌因子的檢測(cè)
[0072]本發(fā)明的脂肪組織祖細(xì)胞能分泌多種細(xì)胞因子，如干細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、血小板衍生因子(TOGF)、人轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β (TGF-β)、巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、白介素-2 (IL-2)、白介素-10 (IL-10)等。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以使用常規(guī)方法對(duì)分泌的細(xì)胞因子進(jìn)行檢測(cè)。如使用常規(guī)的ELISA法。
[0073]本發(fā)明使用的所述的脂肪組織祖細(xì)胞分泌選自下組的細(xì)胞因子:干細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、血小板衍生因子(TOGF)、人轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β (TGF-β)、巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、白介素-2 (IL-2)、白介素-10 (IL-10)、或其組合。
[0074]在另一優(yōu)選例中，脂肪組織祖細(xì)胞分泌的干細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)的濃度≥0.5ng/ml ο
[0075]在另一優(yōu)選例中，脂肪組織祖細(xì)胞分泌的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的濃度≥35pg/ml,較佳地≥40pg/mL.[0076]在另一優(yōu)選例中，脂肪組織祖細(xì)胞分泌的人轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β (TGF-β)的濃度≥150pg/ml,較佳地 ≥ 180pg/ml。
[0077]在另一優(yōu)選例中，脂肪組織祖細(xì)胞分泌的白介素-2(IL_2)的濃度≥15pg/ml，較佳地≥20pg/ml，更佳地≥30pg/ml。
[0078]在另一優(yōu)選例中，脂肪組織祖細(xì)胞分泌的白介素-1O(IL-1O)的濃度≥15pg/ml,較佳地≥20pg/ml,更佳地≥30pg/ml,最佳地≥40pg/ml。
[0079]藥物組合物
[0080]本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，它含有有效量的脂肪組織祖細(xì)胞，以及藥學(xué)上可接受的載體。
[0081]通常，可將脂肪組織祖細(xì)胞配制于無毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受的水性載體介質(zhì)中，如生理鹽水中，其中pH通常約為5-8，較佳地，pH約為7-8。
[0082]如本文所用，術(shù)語“有效量”或“有效劑量”是指可對(duì)人和/或動(dòng)物產(chǎn)生功能或活性的且可被人和/或動(dòng)物所接受的量。
[0083]如本文所用，“藥學(xué)上可接受的”的成分是適用于人和/或哺乳動(dòng)物而無過度不良副反應(yīng)(如毒性、刺激和變態(tài)反應(yīng))的，即具有合理的效益/風(fēng)險(xiǎn)比的物質(zhì)。術(shù)語“藥學(xué)上可接受的載體”指用于治療劑給藥的載體，包括各種賦形劑和稀釋劑。
[0084]本發(fā)明的藥物組合物含有安全有效量的脂肪組織祖細(xì)胞以及藥學(xué)上可接受的載體。這類載體包括(但并不限于):鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。通常藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配，本發(fā)明的藥物組合物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。所述的藥物組合物宜在無菌條件下制造。活性成分的給藥量是治療有效量。本發(fā)明的藥物制劑還可制成緩釋制劑。
[0085]本發(fā)明所述脂肪組織祖細(xì)胞的有效量可隨給藥的模式和待治療的疾病的嚴(yán)重程度等而變化。優(yōu)選的有效量的選擇可以由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員根據(jù)各種因素來確定(例如通過臨床試驗(yàn))。所述的因素包括但不限于:所述藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)例如生物利用率、代謝、半衰期等；患者所要治療的疾病的嚴(yán)重程度、患者的體重、患者的免疫狀況、給藥的途徑等。
[0086]本發(fā)明的藥物組合物優(yōu)選為皮下注射試劑。在另一優(yōu)選例中，所述的皮下注射試劑中脂肪組織祖細(xì)胞的濃度為0.1-100X 104個(gè)/ml，較佳地為1-10X IO4個(gè)/ml，更佳地為2X IO5 個(gè)/ml。
[0087]本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn):
[0088](I)脂肪組織祖細(xì) 胞對(duì)于肝炎(特別是乙肝)有顯著的預(yù)防或治療作用；
[0089](2)脂肪組織祖細(xì)胞使乙肝細(xì)胞多種表面抗原下降，病毒DNA顯著減少，并減低谷丙轉(zhuǎn)氨酶ALT ；
[0090](3)脂肪組織祖細(xì)胞可以促進(jìn)肝功能的修復(fù)。
[0091]下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如 Sambrook 等人，分子克隆:實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的條件,或按照制造廠商所建議的條件。
[0092]實(shí)驗(yàn)試劑及耗材
[0093]無菌手術(shù)器械及耗材
[0094]無菌長(zhǎng)柄手術(shù)鑷子、無菌100微米濾網(wǎng)、滅菌40微米濾網(wǎng)、離心管
[0095]無菌試劑
[0096]DMEM (無血清培養(yǎng)基)
[0097]I型膠原酶(現(xiàn)配現(xiàn)用):(λ 1%膠原酶I配制方法:稱取0.1g膠原酶I粉末溶解于100ml未加任何因子的培養(yǎng)基中，用之前37°C預(yù)熱。
[0098]氯化鈉注射液
[0099]實(shí)施例1
[0100]脂肪組織祖細(xì)胞的分離
[0101]1.接收脂肪組織
[0102]用75%的酒精擦拭無菌的接收脂肪組織的采集瓶外壁；無菌針管從人體吸取深層脂肪組織，Ih內(nèi)將其移至接收容器內(nèi)。
[0103]2.分裝脂肪組織
[0104]每一 50ml離心管分裝脂肪組織20ml，IOml移液管于脂肪采集瓶吸取下層紅色液體，棄掉，將剩余的上層脂肪混勻后進(jìn)行分裝。
[0105]3.洗滌脂肪組織
[0106]洗滌脂肪組織，除去血細(xì)胞。向離心管中加入20ml氯化鈉注射液，擰緊蓋子，劇烈晃動(dòng)3分鐘以充分洗滌脂肪組織，接著靜止3-5分鐘，使不同相分離，吸去下層水相；重復(fù)以上操作三次，直到下層液較為清澈。
[0107]4.膠原酶I消化
[0108]加入等量新配制的預(yù)熱(提前半小時(shí)于37°C的振蕩培養(yǎng)箱預(yù)熱)的膠原酶I溶液，封口膜封口，劇烈晃動(dòng)培養(yǎng)瓶5~10秒，置于振蕩培養(yǎng)箱中，370C，IOOrpm,消化40分鐘，每隔15分鐘劇烈晃動(dòng)培養(yǎng)瓶5~10秒，直到組織看起來較為平滑。
[0109]5.分離脂肪組織祖細(xì)胞(SVF)[0110]將消化后的組織用無菌100目濾網(wǎng)分裝到50ml的離心管中，室溫1500rpm離心5分鐘，得到的沉淀即為脂肪組織祖細(xì)胞。
[0111]6.凈化沉淀
[0112]離心后，脂肪組織祖細(xì)胞沉積于離心管底部，用移液管自上而下小心除去上層油脂和下層的膠原酶溶液。注意:在脂肪組織祖細(xì)胞沉淀上方留下少量的溶液，以免擾動(dòng)沉淀細(xì)胞。適量生理鹽水重懸細(xì)胞，吹散，室溫1500rpm離心5分鐘。45ml生理鹽水懸浮細(xì)胞，，再次室溫1500rpm離心5分鐘，離心后加IOml生理鹽水懸浮。再經(jīng)過40目篩過濾后得到細(xì)胞混合液。
[0113]實(shí)施例2
[0114]脂肪組織祖細(xì)胞的鑒定
[0115]1.脂肪組織祖細(xì)胞的流式檢測(cè)
[0116]通過酶消化法將細(xì)胞收集到離心管中，細(xì)胞懸液調(diào)整密度為I X IO5HiL-1，800r/min(120g)，離心5min，棄掉上清，用4°C的冷D-Hanks沖洗重懸細(xì)胞，再次將細(xì)胞懸液以800r/min,離心5min,之后棄去上清。然后用D-Hanks將細(xì)胞重懸至ImL,加入抗體5~10 μ L，避光，冰上放置30min。用D-Hanks沖洗，離心，棄上清，重復(fù)該沖洗過程2~3次，確保將未結(jié)合抗體除凈最后，加入約200至300 μ L的D-Hanks制成懸液，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。
[0117]脂肪組織祖細(xì)胞的流式檢測(cè)結(jié)果見表1。
[0118]表1
[0119]
【權(quán)利要求】
1.一種脂肪組織祖細(xì)胞的用途，其特征在于，它被用于制備預(yù)防和/或治療肝炎的藥物組合物。
2.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的肝炎選自下組:病毒性肝炎、酒精性肝炎、自身免疫性肝炎、藥物性肝炎、或其組合。
3.如權(quán)利要求 1所述的用途，其特征在于，所述的脂肪組織祖細(xì)胞具有選自下組的任一或多種特征: (i)30%以上的細(xì)胞具有表面抗原⑶29 ； (?)50%以上的細(xì)胞具有表面抗原⑶73 ； (iii)90%以上的細(xì)胞具有表面抗原⑶49d； (iv)60%以上的細(xì)胞具有表面抗原⑶90。
4.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的脂肪組織祖細(xì)胞具有選自下組的任一或多種特征: (V) 85%以下的細(xì)胞具有表面抗原CD34 ； (vi) 15%以下的細(xì)胞具有表面抗原⑶45。
5.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的脂肪組織祖細(xì)胞分泌選自下組的細(xì)胞因子:干細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、血小板衍生因子(TOGF)、人轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β (TGF-β)、巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、白介素-2(IL-2)、白介素-10 (IL-10)、或其任意組合。
6.一種用于預(yù)防和/或治療肝炎的藥物組合物，其特征在于，所述的藥物組合物包括:有效量的脂肪組織祖細(xì)胞，以及藥學(xué)上可接受的載體。
7.如權(quán)利要求6所述的藥物組合物，其特征在于，所述的藥物組合物為皮下注射試劑。
8.一種預(yù)防和/或治療肝炎的方法，其特征在于，包括步驟:給需要的對(duì)象施用脂肪組織祖細(xì)胞、或施用含有脂肪組織祖細(xì)胞的藥物組合物。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述的對(duì)象為人或非人哺乳動(dòng)物。
10.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，包括步驟:給需要的對(duì)象靜脈回輸所述的脂肪組織祖細(xì)胞，或含有脂肪組織祖細(xì)胞的藥物組合物。
【文檔編號(hào)】A61K39/00GK103655614SQ201210350363
【公開日】2014年3月26日 申請(qǐng)日期:2012年9月19日 優(yōu)先權(quán)日:2012年9月19日
【發(fā)明者】曹衛(wèi), 呂偉麟, 趙彬彬, 卡尤姆, 黃國(guó)濤 申請(qǐng)人:臻景生物技術(shù)（上海）有限公司, 臻景生物技術(shù)（無錫）有限公司