p38-STAT1信號通路調(diào)節(jié)劑在制備調(diào)控HTRA1表達的產(chǎn)品中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種p38-STAT1信號通路調(diào)節(jié)劑劑在制備調(diào)控HTRA1表達的產(chǎn)品中的應(yīng)用，所述p38-STAT1信號通路調(diào)節(jié)劑包括激動劑和抑制劑，所述激動劑為干擾素γ和/或茴香霉素及其類似物，所述抑制劑磷酸激酶p38抑制劑或STAT1抑制劑；所述磷酸激酶p38抑制劑為SB203580及其類似物，或所述STAT1抑制劑為MTA及其類似物；所述絲氨酸蛋白酶HTRA1與炎癥性疾病及其相關(guān)疾病或與腫瘤形成或遷移有關(guān)的疾病有關(guān)。因此，本發(fā)明開發(fā)了新的針對調(diào)控HTRA1基因表達的方法來進行HTRA1相關(guān)疾病的治療，提供p38-STAT1信號通路調(diào)節(jié)劑的新用途，其p38-STAT1信號通路激動劑能夠抑制絲氨酸蛋白酶HTRA1表達，從而使HTRA1相關(guān)疾病得以治療。
【專利說明】P38-STAT1信號通路調(diào)節(jié)劑在制備調(diào)控HTRA1表達的產(chǎn)品中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域。本發(fā)明具體涉及一種信號通路調(diào)節(jié)劑的應(yīng)用，尤其涉及一種P38-STAT1信號通路調(diào)節(jié)劑在制備調(diào)控HTRAl表達的產(chǎn)品中的應(yīng)用，所述產(chǎn)品為藥物或試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]絲氨酸蛋白酶HTRAl(High temperature requirement Al)是一種分泌型蛋白酶。絲氨酸蛋白酶HTRAl能夠降解纖連蛋白、聚集蛋白聚糖、核心蛋白聚糖、纖維調(diào)節(jié)素等多種胞外基質(zhì)蛋白，并且參與調(diào)節(jié)TGF-P信號通路，因此其對于細(xì)胞粘附、運動以及胞外基質(zhì)的穩(wěn)態(tài)和代謝具有重要的調(diào)節(jié)作用。此外，有大量研究證實絲氨酸蛋白酶HTRAl與骨關(guān)節(jié)炎(0A)、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、老年性黃斑變性(AMD)以及腫瘤形成與遷移等許多人類疾病密切相關(guān)。
[0003]注射用重組人干擾素Y是一種臨床用藥，主要用于風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、骨髓增生異常綜合癥以及異位性皮炎和尖銳濕疣等疾病。
[0004]到目前為止，未有任何關(guān)于如何調(diào)節(jié)絲氨酸蛋白酶HTRAl基因表達的報道，也未有任何以HTRAl為靶點的臨床治療方案，更沒有通過干擾素Y抑制絲氨酸蛋白酶HTRAl表達的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]因此，本發(fā)明的目的是針對目前未能從絲氨酸蛋白酶HTRAl基因表達調(diào)控來進行絲氨酸蛋白酶HTRAl相關(guān)疾病的`治療的不足，提供一種P38-STAT1信號通路調(diào)節(jié)劑在制備調(diào)節(jié)絲氨酸蛋白酶HTRAl表達的產(chǎn)品中的應(yīng)用，所述產(chǎn)品為藥物或試劑盒，為絲氨酸蛋白酶HTRAl相關(guān)疾病治療藥物提供重要分子靶點。
[0006]針對上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案如下:
[0007]除非特別指明，本文中的“ IFN- Y ”均指“干擾素Y ”。
[0008]除非特別指明，本文中的“HTRA1 ”均指“絲氨酸蛋白酶HTRAl ”。
[0009]一方面，本發(fā)明提供一種P38-STAT1信號通路調(diào)節(jié)劑在制備調(diào)控絲氨酸蛋白酶HTRAl表達的藥物或試劑盒中的應(yīng)用。
[0010]優(yōu)選地，所述P38-STAT1信號通路調(diào)節(jié)劑包括激動劑和抑制劑。
[0011]優(yōu)選地，所述激動劑為干擾素Y和/或茴香霉素及其類似物，用于抑制絲氨酸蛋白酶HTRAl表達。
[0012]優(yōu)選地，所述抑制劑為SB203580和/或MTA及其類似物，用于上調(diào)絲氨酸蛋白酶HTRAl表達。
[0013]優(yōu)選地，所述絲氨酸蛋白酶HTRAl與炎癥性疾病及其相關(guān)疾病或與腫瘤形成或遷移有關(guān)的疾病有關(guān)。[0014]優(yōu)選地，所述炎癥性疾病及其相關(guān)疾病選自骨關(guān)節(jié)炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和老年性黃斑變性中的一種或多種。
[0015]優(yōu)選地，所述炎癥性疾病為風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
[0016]優(yōu)選地，所述與腫瘤形成或遷移有關(guān)的疾病為黑色素瘤。
[0017]再一方面，本發(fā)明提供一種P38-STAT1信號通路調(diào)節(jié)劑在制備用于治療絲氨酸蛋白酶HTRAl及其上游通路活化導(dǎo)致的HTRAl相關(guān)疾病的藥物或試劑盒中的應(yīng)用。
[0018]優(yōu)選地，所述p38-STATl信號通路調(diào)節(jié)劑包括激動劑和抑制劑。
[0019]優(yōu)選地，所述激動劑選自干擾素Y和/或茴香霉素及其衍生物。
[0020]優(yōu)選地，所述抑制劑為磷酸激酶p38抑制劑或STATl抑制劑。
[0021]優(yōu)選地，所述磷酸激酶p38抑制劑為SB203580及其類似物，或所述STATl抑制劑為MTA及其類似物。
[0022]優(yōu)選地，所述絲氨酸蛋白酶HTRAl相關(guān)疾病包括炎癥性疾病及其相關(guān)疾病或與腫瘤形成或遷移有關(guān)的疾病。
[0023]優(yōu)選地，所述炎癥性疾 病及其相關(guān)疾病選自骨關(guān)節(jié)炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和老年性黃斑變性中的一種或多種。
[0024]優(yōu)選地，所述炎癥性疾病為風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
[0025]優(yōu)選地，所述腫瘤形成或遷移有關(guān)的疾病為黑色素瘤。
[0026]還一方面，本發(fā)明提供一種用于調(diào)控絲氨酸蛋白酶HTRAl表達的藥物組合物，所述藥物組合物含有有效量的P38-STAT1信號通路調(diào)節(jié)劑和藥學(xué)上可接受的載體。
[0027]優(yōu)選地，所述p38-STATl信號通路調(diào)節(jié)劑包括激動劑和抑制劑。
[0028]更優(yōu)選地，所述激動劑為干擾素Y和/或茴香霉素及其類似物。
[0029]優(yōu)選地，所述抑制劑為磷酸激酶p38抑制劑或STATl抑制劑。
[0030]優(yōu)選地，所述磷酸激酶p38抑制劑為SB203580及其類似物。
[0031]優(yōu)選地，所述STATl抑制劑為MTA及其類似物。
[0032]優(yōu)選地，，所述有效量的干擾素Y及其類似物的濃度為0-100ng/ml。
[0033]優(yōu)選地，干擾素Y及其類似物的濃度為100ng/ml ；
[0034]優(yōu)選地,所述有效量的茴香霉素的濃度為1-10 PM。
[0035]優(yōu)選地，所述SB203580的有效濃度為10 ii M ;或MTA的濃度為10 U M。
[0036]本發(fā)明通過試驗證實了 p38-STATl信號通路調(diào)節(jié)劑能夠調(diào)控HTRAl的基因表達，其中激動劑能夠通過抑制HTRAl的基因表達，從而有效治療RA，此外還揭示P38-STAT1信號通路激動劑能夠用于治療骨關(guān)節(jié)炎(0A)、老年性黃斑變性(AMD)和黑色素瘤等HTRAl相關(guān)疾病，拓寬了重組干擾素Y的應(yīng)用范圍，而P38-STAT1信號通路抑制劑能夠上調(diào)HTRAl的基因表達，從而為HTRAl相關(guān)疾病治療藥物提供了新藥物靶分子。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0037]以下，結(jié)合附圖來詳細(xì)說明本發(fā)明的實施方案，其中:
[0038]圖1表明干擾素Y能夠顯著降低小鼠成纖維細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中HTRAl基因表達，其中，圖1a為不同濃度分別為0、l、10、50、100ng/ml的干擾素、處理后的成纖維細(xì)胞中HTRAl基因表達的試驗結(jié)果，圖1b為以濃度為100ng/ml的干擾素Y處理不同時間后的成纖維細(xì)胞中HTRAl基因表達的試驗結(jié)果，圖1c為不同濃度分別為0、l、10、50、100ng/ml的干擾素Y處理后的巨噬細(xì)胞中HTRAl基因表達的試驗結(jié)果，圖1d為以濃度為100ng/ml的干擾素Y處理不同時間后的巨噬細(xì)胞中HTRAl基因表達的試驗結(jié)果，縱坐標(biāo)表示以未用干擾素Y處理的細(xì)胞中HTRAl mRNA表達水平為基準(zhǔn)，在干擾素、處理過程中細(xì)胞中HTRAlmRNA表達水平；
[0039]圖2表明干擾素Y抑制小鼠關(guān)節(jié)和大腸部位HTRAl基因表達，縱坐標(biāo)表示以未用任何物質(zhì)處理的樣品中HTRAl mRNA表達水平為基準(zhǔn)，在干擾素Y處理過程中樣品中HTRAl mRNA表達水平，圖中，LPS表示脂多糖，其中，圖2a顯示干擾素、抑制小鼠關(guān)節(jié)部位的HTRAl基因表達，I為加干擾素Y處理后小鼠關(guān)節(jié)部位的HTRAl mRNA表達，2為加干擾素Y處理后小鼠關(guān)節(jié)部位的HTRAl蛋白表達，圖中，LPS表示脂多糖，GAPDH表示磷酸甘油醛脫氫酶，作為內(nèi)參；
[0040]圖2b顯示干擾素Y抑制小鼠大腸部位的HTRAl基因表達，I為加干擾素Y處理后小鼠大腸部位的HTRAl mRNA表達，2為加干擾素、處理后大腸部位的HTRAl蛋白表達，圖中，LPS表示脂多糖，GAPDH表示磷酸甘油醛脫氫酶，作為內(nèi)參；
[0041]圖2c顯示干擾素Y敲除小鼠關(guān)節(jié)部位HTRAl基因表達升高，I為加干擾素Y處理后小鼠關(guān)節(jié)部位的HTRAl mRNA表達，2為加干擾素、處理后小鼠關(guān)節(jié)部位的HTRAl蛋白表達，圖中LPS表示脂多糖，GAPDH表示磷酸甘油醛脫氫酶，IFN- Y KO或KO表示IFN- y基因敲除的小鼠，B6表示野生型B6小鼠，對照表示未注射LPS的小鼠(IFN- y KO和野生型B6小鼠);
[0042]圖2d顯示干擾素Y敲除小鼠大腸部位HTRAl基因表達升高，I為加干擾素Y處理后小鼠大腸部位的HTRAl mRNA表達，2為加干擾素、處理后大腸部位的HTRAl蛋白表達，GAPDH表示磷酸甘油醛脫氫酶，IFN- y KO表示IFN- y基因敲除的小鼠，B6表示野生型B6小鼠，對照表示未注射LPS的小鼠(IFN- y KO和野生型B6小鼠)；
[0043]圖3表明干擾素Y抑制小鼠關(guān)節(jié)HTRAl表達及關(guān)節(jié)炎病征，其中，圖3a顯示野生型和干擾素、基因敲除小鼠誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎的患病率，圖中，B6表示誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎的野生型B6小鼠，IFN-Y KO表示誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎的IFN-Y基因敲除小鼠；
[0044]圖3b顯示野生型和干擾素Y基因敲除小鼠誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎后小鼠后肢的表型，圖中，WT是指野生型B6小鼠，WT CIA是指誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎的野生型B6小鼠，IFN- y KO表示IFN- y基因敲除小鼠，IFN- y KO CIA是指誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎的IFN-Y基因敲除小鼠；
[0045]圖3c顯示野生型和干擾素Y基因敲除小鼠誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎后小鼠前后后肢關(guān)節(jié)HE染色的照片，圖中，WT是指野生型B6小鼠，WT CIA是指誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎的野生型B6小鼠，IFN-Y KO表示IFN-Y基因敲除小鼠，IFN-Y CIA是指誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎的IFN-Y基因敲除小鼠；
[0046]圖3d顯示野生型和干擾素Y基因敲除小鼠誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎的HTRAl表達的抑制，其中I為HTRAl表達的結(jié)果，圖中，WT是指野生型B6小鼠，WT CIA是指誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎的野生型B6小鼠，IFN- y KO表示IFN- y基因敲除小鼠，IFN- y KO CIA是指誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎的IFN- y基因敲除小鼠；2為蛋白印跡結(jié)果，圖中，對照為未誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎的小鼠，CIA表示誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎后的小鼠，其中，B6表示B6小鼠，KO表示IFN- y基因敲除小鼠，縱坐標(biāo)表示以野生型B6小鼠中HTRAl mRNA表達水平為基準(zhǔn)，在誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎的過程中小鼠中HTRAl mRNA表達水平；
[0047]圖3e顯示對誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎的野生型小鼠注射干擾素Y后的患病率，圖中，CIA對照是指誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎(CIA)的野生型B6小鼠；CIA+IFN-Y是指誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎(CIA)，同時注射干擾素的野生型B6小鼠，CIA+LPS是指誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎(CIA)，同時注射LPS的野生型B6小鼠，CIA+IFN- y +LPS是指誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎(CIA)，同時注射干擾素和LPS的野生型B6小鼠；
[0048]圖3f顯示對誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎的野生型小鼠注射干擾素Y后的小鼠后肢的表型，圖中，Con是指誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎(CIA)的野生型B6小鼠，IFN-Y是指誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎(CIA)，同時注射干擾素治療的野生型B6小鼠，LPS是指誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎(CIA)，同時注射LPS的野生型B6小鼠，IFN- y +LPS是指誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎(CIA)，同時注射干擾素和LPS的野生型B6小鼠；
[0049]圖3g顯示對誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎的野生型小鼠注射干擾素Y后的小鼠前后后肢關(guān)節(jié)HE染色的照片，圖中，Con是指誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎(CIA)的野生型B6小鼠，IFN-Y是指，同時注射干擾素的野生型B6小鼠，LPS是指誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎(CIA)，同時注射LPS的野生型B6小鼠，IFN- y +LPS是指誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎(CIA)，同時注射干擾素和LPS的野生型B6小鼠；
[0050]圖3h顯示對誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎的野生型小鼠注射干擾素Y后小鼠中的HTRAl表達，其中I為HTRAl mRNA表達的結(jié)果，2為蛋白印跡結(jié)果，圖中，對照是指野生型B6小鼠(未誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎)，CIA是指誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎(CIA)的野生型B6小鼠，CIA+IFN-y+LPS是指誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎(CIA)，同時注射干擾素和LPS的野生型B6小鼠，CIA+LPS是指誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎(CIA)，同時注射LPS的野生型B6小鼠，CIA+IFN- y +LPS是指誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎(CIA)，同時注射干擾素和LPS的野生型B6小鼠縱坐標(biāo)表示以野生型B6小鼠(未誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎)中的HTRAl mRNA的表達為標(biāo)準(zhǔn)，在誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎和注射干擾素Y的過程中小鼠中的HTRAl mRNA的表達，GAPDH表示磷酸甘油醛脫氫酶，作為內(nèi)參；
[0051]圖4表明干擾素Y通過活化蛋白激酶p38 STATl通路抑制HTRAl表達，其中，圖4a顯示磷酸激酶p38抑制劑(SB203580)處理的巨噬細(xì)胞系RAW264.7中HTRAl mRNA的表達，圖中，DMSO表示體積比濃度為1%。的DMSO處理的巨噬細(xì)胞系RAW264.7，作為對照，SB203580表示SB203580處理的巨噬細(xì)胞系RAW264.7，IFN-y表示IFN-Y處理的巨噬細(xì)胞系 RAW264.7，IFN- y +SB203580 表示 IFN- y` 和 SB203580 處理的巨噬細(xì)胞系 RAW264.7，縱坐標(biāo)表示以DMSO處理的巨噬細(xì)胞系RAW264.7中的HTRAl mRNA的表達為標(biāo)準(zhǔn)，在加干擾素Y或SB203580處理的過程中RAW264.7中的HTRAl mRNA的表達；
[0052]圖4b表示磷酸激酶p38抑制劑在干擾素Y抑制HTRAl基因表達中的作用，圖中，對照為巨噬細(xì)胞系RAW264.7，p38 shRNA為p38基因RNA干擾的RAW264.7細(xì)胞，I為未加干擾素Y處理的巨噬細(xì)胞系RAW264.7，2為加干擾素、處理的巨噬細(xì)胞系RAW264.7，3為未加干擾素Y處理的p38 shRNA為p38基因RNA干擾的RAW264.7細(xì)胞,4為加干擾素Y處理的p38 shRNA為p38基因RNA干擾的RAW264.7細(xì)胞，縱坐標(biāo)表示以巨噬細(xì)胞系RAW264.7中的HTRAl mRNA的表達為標(biāo)準(zhǔn)，在加干擾素、處理的過程中RAW264.7或p38 shRNA中的HTRAl mRNA 的表達；
[0053]圖4c表示茴香霉素處理的巨噬細(xì)胞系RAW264.7中HTRAl mRNA的表達，圖中，DMSO表示體積比濃度為I %。的DMSO處理的巨噬細(xì)胞系RAW264.7，作為對照，I y M表示I PM茴香霉素處理的巨噬細(xì)胞系RAW264.7，IOii M表示10 y M茴香霉素處理的巨噬細(xì)胞系RAW264.7，+SP600125是指在10 y M茴香霉素+SP600125處理的巨噬細(xì)胞系RAW264.7，縱坐標(biāo)表示以DMSO處理的巨噬細(xì)胞系RAW264.7中的HTRAl mRNA的表達為標(biāo)準(zhǔn)，在加茴香霉素或SP600125處理的過程中RAW264.7中的HTRAl mRNA的表達；[0054]圖4d表示顯示STATl抑制劑(MTA)處理的巨噬細(xì)胞系RAW264.7中HTRAl mRNA的表達，圖中，對照表示體積比濃度為1%。的DMSO處理的巨噬細(xì)胞系RAW264.7 ；IFN-y表示IFN- y處理的巨噬細(xì)胞系RAW264.7 ；IFN- y +MTA表示IFN- y和MTA處理的巨噬細(xì)胞系RAW264.7 ；MTA表示MTA處理的巨噬細(xì)胞系RAW264.7，縱坐標(biāo)表示以對照中HTRAl mRNA的表達為基準(zhǔn)，在加干擾素Y或MTA處理的過程中巨噬細(xì)胞系RAW264.7中HTRAl mRNA的表達；
[0055]圖4e表示STATl在干擾素Y抑制HTRAl基因表達中的作用，圖中，對照為巨噬細(xì)胞系RAW264.7，STATl shRNA為STATl基因RNA干擾的RAW264.7細(xì)胞，I為未加干擾素Y處理的巨噬細(xì)胞系RAW264.7，2為加干擾素、處理的巨噬細(xì)胞系RAW264.7，3為未加干擾素Y處理的STATl基因RNA干擾的RAW264.7細(xì)胞，4為加干擾素Y處理的STATl基因RNA干擾的RAW264.7細(xì)胞，縱坐標(biāo)表示以未加干擾素Y處理的巨噬細(xì)胞系RAW264.7中HTRAlmRNA的表達為基準(zhǔn)，在加干擾素Y處理的過程中巨噬細(xì)胞系RAW264.7或STATl shRNA中HTRAl mRNA 的表達；
[0056]圖5為通過流式細(xì)胞儀分選p38 RNA干擾細(xì)胞系和STATl RNA干擾細(xì)胞系的結(jié)果，其中，圖5a為流式細(xì)胞儀分選p38干擾細(xì)胞系的流式細(xì)胞儀分選結(jié)果，圖5b為STATlRNA干擾細(xì)胞系的流式細(xì)胞儀分選結(jié)果，圖中，Ml為流式細(xì)胞儀分選的GFP陽性(GFP+)細(xì)胞系；
[0057]圖6為干擾素Y降低風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者滑膜液細(xì)胞的HTRAl表達水平。其中，圖6a表示干擾素Y處理來自8位關(guān)節(jié)炎患者的滑膜液細(xì)胞24小時后，HTRAl mRNA的表達水平，圖中左邊的點表示對照，右邊的點表示干擾素Y處理后的患者的HTRAl mRNA的表達水平，縱坐標(biāo)表示以對照中HTRAl mRNA的表達水平為基準(zhǔn)，干擾素、處理后的患者的HTRAlmRNA的表達水平；
[0058]圖6b顯示磷酸激酶p38抑制劑(SB203580)處理的滑膜液細(xì)胞中HTRAl mRNA的表達，圖中，DMSO表示體積比濃度為1%。的DMSO處理的滑膜液細(xì)胞，作為對照，SB203580表示SB203580處理的滑膜液細(xì)胞，IFN- y表示IFN- y處理的滑膜液細(xì)胞，IFN- y +SB203580表示IFN- y和SB203580處理的滑膜液細(xì)胞，縱坐標(biāo)表示以DMSO處理的滑膜液細(xì)胞中的HTRAl mRNA的表達為標(biāo)準(zhǔn)，在加干擾素、或SB203580處理的過程中滑膜液細(xì)胞中的HTRAlmRNA的表達；
[0059]圖6c顯示STATl抑制劑(MTA)處理的滑膜液細(xì)胞中HTRAl mRNA的表達，圖中，DMSO表示體積比濃度為1%。的DMSO處理的滑膜液細(xì)胞，作為對照，MTA表示MTA處理的滑膜液細(xì)胞，IFN- y表示IFN- y處理的滑膜液細(xì)胞，IFN- y +MTA表示IFN- y和MTA處理的滑膜液細(xì)胞，縱坐標(biāo)表示以DMSO處理的滑膜液細(xì)胞中的HTRAl mRNA的表達為標(biāo)準(zhǔn)，在加干擾素Y或MTA處理的過程中滑膜液細(xì)胞中的HTRAl mRNA的表達；
[0060]圖7為通過試驗證明的干擾素Y通過活化P38激酶，進而活化轉(zhuǎn)錄因子STATl的"[目號通路不意圖；
[0061]圖8為p38-STATl信號通路圖。
【具體實施方式】
[0062]除非特別指明，以下實施例中所用的小鼠品種為B6野生型小鼠(購自北京大學(xué)實驗動物中心)，IFN-y基因敲除小鼠為B6背景，購自美國JACKSON實驗室(The JacksonLaboratory,公司網(wǎng)址:http://www.jax.0rg/), IFN- y基因敲除小鼠貨號為002287 ;小鼠詳細(xì)信息請參考 http://jaxmice.jax.0rg/strain/002287, html。
[0063]除非特別指明，以下實施例中所用的試劑均為分析純級試劑，且可從正規(guī)渠道商購獲得。
[0064]實施例1干擾素Y能夠在體外降低絲氨酸蛋白酶HTRAl的表達
[0065]通過常規(guī)方法獲取小鼠(購自北京大學(xué)實驗動物中心，品種為B6小鼠)成纖維細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，具體為常規(guī)方法處死實驗小鼠，剖開小鼠腹壁，用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗小鼠腹腔，并收集沖洗液，1700rpm離心5分鐘，沉淀即為小鼠腹腔巨噬細(xì)胞。將12.5天-14.5天孕鼠無菌條件下取出子宮，并取出小鼠胚胎，減去頭部和四肢，PBS洗滌3次；將小鼠軀干剪成約I立方毫米小塊，加入胰酶，培養(yǎng)箱中孵育15分鐘，反復(fù)吹打，加入細(xì)胞培養(yǎng)基終止消化反應(yīng)，1700rpm離心5分鐘，棄上清，加入新鮮培養(yǎng)基，將沉底物重懸，并移至培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-7天，PBS沖洗兩次，胰酶-EDTA消化、傳代，該細(xì)胞即為小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)。
[0066]將上述兩種細(xì)胞移至培養(yǎng)板中培養(yǎng)，經(jīng)貼壁純化后，使用濃度梯度分別為0、1、10、50、100ng/ml干擾素、(購自美國P印rotech公司)處理細(xì)胞24小時及濃度為IOOng/ml干擾素Y處理不同時間后，分別使用TRIzol試劑盒(購自美國Invitrogen公司)，按照試劑盒說明書操作，提取細(xì)胞總RNA (參考文獻:01son J H;Xiang X;et al.Allurin, a21—kDa sperm chemoattractant from Xenopus egg jelly, is related to mammaliansperm-binding proteins.Proc Natl Acad Sci USA.2001 Sep25;98(20):11205-10.);然后，再按照試劑盒說明書操作將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，具體為取上述提取的I微克總RNA，加入
0.5微升Oligo dT (購自日本TAKARA公司)，I微升RNA酶抑制劑，AMV逆轉(zhuǎn)錄酶以及AMV緩沖液(均購自日本TAKARA公司`)，用水將體積補至25微升。將反應(yīng)物置于42°C水浴鍋孵育I小時，所得反應(yīng)產(chǎn)物即cDNA。
[0067]然后按照試劑盒說明書操作，使用Realtime-PCR試劑盒(購自日本TAKARA公司)，檢測成纖維細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中HTRAl基因表達。具體為以提取的cDNA為模板，PCR反應(yīng)程序為95°C 3分鐘；95°C 30秒；58°C 30秒；72°C 30秒，循環(huán)數(shù)為35。PCR反應(yīng)在實時定量PCR儀中進行(CFX96，購自美國Biorad公司)，擴增HTRAl mRNA的基因編碼序列(SEQID NO:1)中的一部分序列(SEQ ID N0:2)，實驗結(jié)果以每個樣品的轉(zhuǎn)磷酸核糖基酶(HPRT，phosphor ibosy I transferase)為內(nèi)參進行比對得出。
[0068]HTRAl檢測引物及擴增產(chǎn)物序列:
[0069]上游引物(HtralSense):5' -CAAGGATGTGGATGAAAAGGC-3' (SEQ IDN0:3)
[0070]下游引物(HtralReverse):5 ' -ATGATAGCGTCTGTCTGAATGTAGTC-3 ' (SEQ IDN0:4)
[0071]擴增 產(chǎn)物為:caagga tgtggatgaa aaggcggaca ttgcgcttat caagattgaccaccagggaaagctgccagt cctgctgctc ggccgctcct cagagctgag acctggagaa tttgtagttgccattggaagccccttttct cttcaaaaca cagtcaccac tgggatcgtc agcaccaccc agcgaggcggcaaagagctgggacttcgga actccgatat ggactacatt cagacagacg ctatcat (SEQ ID NO:2)
[0072]HPRT檢測引物及擴增產(chǎn)物序列:[0073]上游引物(HPRTSense):5' -AGTACAGCCCCAAAATGGTTAAG-3' (SEQID NO:7)
[0074]下游引物(HPRTReverse):5' -CTTAGGCTTTGTATTTGGCTTTTC-3' (SEQ ID NO:8)
[0075]擴增產(chǎn)物為HPRT mRNA的基因編碼序列(SEQ ID NO: 10)中的部分序列:agtacagccc caaaatggtt aaggttgcaa gcttgctggt gaaaaggacc tctcgaagtgttggatacaggccagacttt gttggatttg aaattccaga caagtttgtt gttggatatg cccttgactataatgagtac ttcagggatt tgaatcacgt ttgtgtcatt agtgaaactg gaaaagccaa atacaaagcctaag (SEQID N0:9)
[0076]結(jié)果如圖1所示，顯示通過Realtime-PCR技術(shù)證實干擾素、能夠顯著降低小鼠和人成纖維細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中HTRAl基因表達，且具有時間與劑量依賴性。
[0077]實施例2干擾素Y能夠在體內(nèi)降低絲氨酸蛋白酶HTRAl的表達
[0078]通過常規(guī)方法對小鼠(野生型B6小鼠，購自北京大學(xué)實驗動物中心)和干擾素Y基因敲除小鼠(該小鼠為野生型B6小鼠背景，購自美國JACKSON實驗室(The JacksonLaboratory,公司網(wǎng)址:http://www.jax.0rg/), IFN- y基因敲除小鼠貨號為002287 ;小鼠詳細(xì)信息請參考http://jaxmice.jax.0rg/strain/002287, html)分別進行干擾素、腹腔注射(5 ii g/小鼠/天，共注射5天)，其中LPS腹腔注射劑量為IOOng/小鼠/5天，5天后手術(shù)獲取小鼠關(guān)節(jié)部位及大腸部位，提取組織RNA并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA (操作方法同實施例1)，再以提取的cDNA為模板，使用Realtime-PCR試劑盒(購自日本TAKARA公司)，按照說明書操作，檢測小鼠關(guān)節(jié)部位和大腸部位的樣品中HTRAl基因表達。
[0079]同時提取獲取的鼠關(guān)節(jié)部位及大腸部位的組織蛋白質(zhì)，采用免疫雜交印記(Western-Blot)( 一抗為HTRAl特異性抗體購自美國Santa Cruz公司)檢測HTRAl蛋白水平，具體方法如下:
[0080]1.將200微升預(yù)冷細(xì)胞裂解液RIPA (購自北京賽弛生物科技公司)到裝有關(guān)節(jié)或大腸組織的1.5毫升離心管中，反復(fù)吹打，充分裂解細(xì)胞，置于冰上15分鐘；13000rpm離心15分鐘；再將將收取的蛋白樣品用北京賽弛生物科技公司BCA蛋白濃度檢測試劑盒定量細(xì)胞裂解液的蛋白濃度，調(diào)節(jié)各樣品的蛋白濃度一致，然后加入6X上樣緩沖液，沸水浴中煮5-10分鐘；2.13000rpm，4°C離心10分鐘，取上清；3.每孔加入等量的樣品(約30微克)，聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白質(zhì)，95V穩(wěn)壓電泳2-2.5小時，再經(jīng)電轉(zhuǎn)移將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上；4.轉(zhuǎn)好PVDF膜經(jīng)5%脫脂牛奶/TBST (TBS + 0.05%Tween20)封閉(室溫，I小時)，加HTRAl或內(nèi)參GAPDH (磷酸甘油醛脫氫酶)的特異性抗體，4°C溫和振蕩過夜，傾倒去除游離一抗后，室溫TBST洗滌三次，每次15分鐘，再與辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗室溫振蕩孵育I小時，最后再用PBST洗滌三次，于Millipore公司的顯色底物孵育3分鐘，于暗室曝光顯影。
[0081]結(jié)果如圖2所示，表明動物體內(nèi)實驗也證實，腹腔注射重組干擾素Y (5y g/小鼠/天)能顯著降低小鼠大腸及關(guān)節(jié)部位HTRAl的表達；與之相反，干擾素Y敲除HTRAl的小鼠HTRAl的表達相應(yīng)升高。
[0082]實施例3干擾素Y降低關(guān)節(jié)炎病征
[0083]為了證實干擾素、對HTRAl基因表達抑制作用的臨床意義，我們建立小鼠關(guān)節(jié)炎模型(Collagen-1nduced Arthritis, CIA),以下試驗中所用的小鼠為野生型B6小鼠和干擾素Y基因敲除的B6小鼠。[0084]小鼠關(guān)節(jié)炎模型(CIA)的建立:將雞II型膠原(購自美國Sigma公司)與完全弗氏佐劑(購自美國Sigma公司)充分乳化，使其濃度為lmg/ml，再使用該乳化劑分別于第I天和第21天，以IOOiU/小鼠的量對實驗小鼠進行皮下注射，并在第18天開始監(jiān)測小鼠四肢關(guān)節(jié)腫脹程度；同時在用野生型B6小鼠和干擾素Y基因敲除的B6小鼠誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎的過程中注射干擾素(5 y g/小鼠/天，共注射5天)或LPS (脂多糖，其為革蘭氏陰性菌壁成分，能激活免疫細(xì)胞，注射量為100 u g/小鼠，僅在第一天注射一次);在第50天將實驗小鼠處死，并進行關(guān)節(jié)部位的HE染色檢測(參考文獻:Damo Xu, Hu1-Rong Jiang, et al.1L-33Exacerbates Autoantibody-1nduced Arthritis.J.1mmunol.2010; 184; 2620-2626)和進行HTRAl基因表達檢測。HTRAl基因表達檢測分別采用實時定量PCR (Realtime-PCR)(具體操作方法同實施例1)和蛋白質(zhì)雜交印跡(Western-Blot)技術(shù)(具體操作方法同實施例2)。
[0085]結(jié)果如圖3所示，表明腹腔注射重組干擾素Y能顯著降低小鼠關(guān)節(jié)部位HTRAl的表達，進而降低關(guān)節(jié)炎病征；與之相反，干擾素Y基因敲除的小鼠HTRAl的表達相應(yīng)升高，關(guān)節(jié)炎病征更為嚴(yán)重。
[0086]實施例4干擾素Y通討P38-STAT1通路抑制HTRAl的某閔表汰
[0087]為了研究干擾素Y抑制HTRAl基因表達的分子機制，我們采用了通路激動劑/抑制劑和RNA干擾等技術(shù)。
[0088]為研究干擾素Y抑制HTRAl基因表達的分子機制，采用巨噬細(xì)胞系RAW264.7(購自美國模式培養(yǎng)物集存庫，ATCC)為研究對象。使用干擾素Y (注射濃度為100ng/ml)和P38抑制劑SB20358 0 (購自德國Merk公司，貨號為559389)(注射濃度為IOyM)或STATl抑制劑MTA (購自美國Sigma公司，貨號為D5011)(注射濃度為10 y M)，及茴香霉素(注射濃度為I U M、10 ii M)處理RAW264.7細(xì)胞，24小時后收取細(xì)胞并提取RNA，采用實時定量PCR(Realtime-PCR)試劑盒(購自日本TAKARA公司)，按照說明書操作，檢測HTRAl基因表達，具體操作方法同實施例1。
[0089]為了進一步證實p38和STATl在干擾素Y抑制HTRAl基因表達中的作用，我們制備了 p38和STATl的RNA干擾細(xì)胞系(p38 shRNA和STATlshRNA)，具體方法是:將p38和STATl 的目標(biāo)干擾序列(STATl 干擾序列為 5' -GCC GAG AAC ATA CCA GAGAAT-3' (SEQ IDN0:5) ;p38 干擾序列為 5' -GAA CTT CGC AAA TGT ATT T-3' (SEQ ID N0:6))通過酶切方法嵌入逆轉(zhuǎn)錄病毒載體質(zhì)粒中(所使用的載體質(zhì)粒為LentiLox 3.7,購自美國Addgene公司)。然后將上述逆轉(zhuǎn)錄病毒載體分別與psPAX2和pMD2.G (均購自Addgene公司)共轉(zhuǎn)染至293細(xì)胞(購自美國模式培養(yǎng)物集存庫，ATCC)中，48小時后收集培養(yǎng)上清，并用此上清加入到RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)液中，培養(yǎng)48小時后，流式細(xì)胞儀分選GFP陽性細(xì)胞，即為p38RNA干擾和STATl RNA干擾細(xì)胞系(結(jié)果如圖5所示)，再加干擾素Y分別處理p38和STATlRNA干擾細(xì)胞系，并用未加干擾素Y處理的p38和STATl RNA干擾細(xì)胞系作為對照。
[0090]結(jié)果如圖4所示，圖4a表明干擾素、能夠抑制HTRAl基因的表達，且在SB203580(磷酸激酶P38的抑制劑)的共同作用下，抑制作用減弱；圖413表明干擾素Y在p38 RNA干擾細(xì)胞系中抑制HTRAl基因的表達減弱；圖4c表明茴香霉素也能夠抑制HTRAl基因的表達，并且在SP600125 (SP600125為磷酸激酶JNK抑制劑，購自美國Invivogen公司，貨號tlrl-sp60)的作用下，抑制作用加強；圖4d表明干擾素Y能夠抑制HTRAl基因的表達，且在MTA(轉(zhuǎn)錄因子STATl抑制劑，能夠抑制其轉(zhuǎn)錄活性，購自美國SIGMA公司，貨號為D5011)的共同作用下，抑制作用減弱！圖知表明干擾素Y在STATl RNA干擾細(xì)胞系中抑制HTRAl基因的表達減弱。[0091]因而，如圖7所示，結(jié)果證實干擾素Y與細(xì)胞表面干擾素Y受體結(jié)合，將活化信號傳遞給細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的磷酸激酶P38，活化p38激酶，進而活化轉(zhuǎn)錄因子STATl?；罨腟TATl能夠從細(xì)胞質(zhì)進入細(xì)胞核，并結(jié)合在HTRAl基因轉(zhuǎn)錄啟動區(qū)，從而抑制HTRAl基因轉(zhuǎn)錄。
[0092]實施例5干擾素Y抑制人滑膜液細(xì)胞中HTRAl的基因表達
[0093]為了確定干擾素、是否對風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的HTRAl基因表達具有同樣的抑制的作用，我們使用濃度為100ng/ml的干擾素Y處理了 8位風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的關(guān)節(jié)滑膜液細(xì)胞(取自北京大學(xué)人民醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，并由患者提供簽署了知情同意書)，然后通過Realtime-PCR方法檢測細(xì)胞內(nèi)HTRAl mRNA表達水平。干擾素Y處理時間為24小時，RNA提取及檢測方法同實施例1，試驗結(jié)果以每個樣品的轉(zhuǎn)磷酸核糖基酶(HPRT，phosphor ibosy I transferase)為內(nèi)參進行比對得出。人HTRAl以及HPRT檢測引物及擴增產(chǎn)物序列如下:
[0094]人HTRAl檢測弓丨物及擴增產(chǎn)物序列:
[0095]上游引物(HtralSense):5 ' -CAAGGATGTGGATGAGAAAGCAGACA-3 ' (SEQ IDN0:11)
[0096]下游引物(HtralReverse):5 ' -ATGATGGCGTCGGTCTGGATGTAGTC-3 ' (SEQ IDNO:12)
[0097]擴增產(chǎn)物為HTRAl mRNA的基因編碼序列(SEQ ID NO: 13)中的部分序列:caaggatgtggatgaga aagcagacat cgcactcatc aaaattgacc accagggcaagctgcctgtc ctgctgcttggccgctcctc agagctgcgg ccgggagagt tcgtggtcgc catcggaagcccgttttccc ttcaaaacacagtcaccacc gggatcgtga gcaccaccca gcgaggcggcaaagagctgg ggctccgcaa ctcagacatggactacatcc agaccgacgc catcat (SEQ IDN0:14)
[0098]人HPRT檢測弓丨物及擴增產(chǎn)物序列:
[0099]上游引物(HPRTSense):5' -CAGTATAATCCAAAGATGGTCAA-3' (SEQ ID NO: 15)
[0100]下游引物(HPRTReverse):5' -TTAGGCTTTGTATTTTGCTTTTCC-3' (SEQ ID NO: 16)
[0101]擴增產(chǎn)物為HPRT mRNA的基因基因編碼序列(SEQ ID NO: 17)中的部分序列:
cagtataatc caaagatggt caaggtcgca agcttgctgg tgaaaaggac cccacgaagt gttggatataagccagactt tgttggattt gaaattccag acaagtttgt tgtaggatat gcccttgactataatgaatacttcagggat ttgaatcatg tttgtgtcat tagtgaaact ggaaaagcaa aatacaaagcctaa (SEQ IDNO:18)
[0102]結(jié)果如圖6a所示，在8位風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的關(guān)節(jié)滑膜液細(xì)胞中，干擾素Y均能顯著降低其HTRAl基因表達水平。
[0103]此外，為研究干擾素Y在人類細(xì)胞中抑制HTRAl基因表達的分子機制，還使用濃度為100ng/ml的干擾素Y和濃度為10 ii M的p38抑制劑SB203580(購自德國Merk公司，貨號為559389)或濃度為IOii M的STATl抑制劑MTA(購自美國Sigma公司，貨號為D5011)處理滑膜液細(xì)胞，24小時后收取細(xì)胞并提取RNA，采用實時定量PCR (Realtime-PCR)試劑盒(購自日本TAKARA公司)，按照說明書操作，檢測HTRAl基因表達，具體操作方法同實施例1，具體引物設(shè)計同上。
[0104]結(jié)果表明干擾素Y對風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的HTRAl基因表達具有同樣的抑制的作用，并且這種抑制作用是通過活化P38-S`TAT1通路實現(xiàn)的。
【權(quán)利要求】
1.p38-STATl信號通路調(diào)節(jié)劑在制備調(diào)控絲氨酸蛋白酶HTRAl表達的藥物或試劑盒中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述P38-STAT1信號通路調(diào)節(jié)劑包括激動劑和抑制劑，優(yōu)選地，所述激動劑為干擾素Y和/或茴香霉素及其類似物；或優(yōu)選地，所述抑制劑為磷酸激酶P38抑制劑或STATl抑制劑及其類似物； 更優(yōu)選地，所述磷酸激酶P38抑制劑為SB203580，或所述STATl抑制劑為MTA。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述絲氨酸蛋白酶HTRAl與炎癥性疾病及其相關(guān)疾病或與腫瘤形成或遷移有關(guān)的疾病有關(guān)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述炎癥性疾病及其相關(guān)疾病選自骨關(guān)節(jié)炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和老年性黃斑變性中的一種或多種。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述炎癥性疾病為風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述與腫瘤形成或前移有關(guān)的疾病為黑色素瘤。
7.p38-STATl信號通路激動劑或抑制劑在制備用于治療絲氨酸蛋白酶HTRAl及其上游通路活化導(dǎo)致的HTRAl相關(guān)疾病的藥物或試劑盒中的應(yīng)用。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述P38-STAT1信號通路調(diào)節(jié)劑包括激動劑和抑制劑，優(yōu)選地，所述調(diào)節(jié)劑選自干擾素Y和/或茴香霉素及其類似物；或優(yōu)選地，所述抑制劑為SB203580及其類似物。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，所述HTRAl相關(guān)疾病包括炎癥性疾病及其相關(guān)疾病或與腫瘤形成或遷移有關(guān)的疾病。`
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于，所述炎癥性疾病及其相關(guān)疾病選自骨關(guān)節(jié)炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和老年性黃斑變性中的一種或多種，優(yōu)選地，所述炎癥性疾病為風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于，所述與腫瘤形成或遷移有關(guān)的疾病為黑色素瘤。
12.—種用于調(diào)控絲氨酸蛋白酶HTRAl表達的藥物組合物，所述藥物組合物含有有效量的p38-STATl信號通路調(diào)節(jié)劑和藥學(xué)上可接受的載體，優(yōu)選地，所述P38-STAT1信號通路調(diào)節(jié)劑包括激動劑和抑制劑，更優(yōu)選地，所述激動劑為干擾素Y和/或茴香霉素及其類似物； 或優(yōu)選地，所述抑制劑為磷酸激酶P38抑制劑或STATl抑制劑；還優(yōu)選地，所述磷酸激酶p38抑制劑為SB203580，或所述STATl抑制劑為MTA。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的用于調(diào)控絲氨酸蛋白酶HTRAl表達的藥物組合物，其特征在于，所述有效量的干擾素Y及其類似物的濃度為0-100ng/ml，優(yōu)選地，干擾素Y及其類似物的濃度為100ng/ml ； 或優(yōu)選地，所述有效量的茴香霉素的濃度為1-10 u M ;或優(yōu)選地，所述SB203580的有效濃度為10 ii M ;或MTA的濃度為10 u Mo
【文檔編號】A61K31/40GK103656643SQ201210359360
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2012年9月24日 優(yōu)先權(quán)日:2012年9月24日
【發(fā)明者】趙勇, 侯玉柱 申請人:中國科學(xué)院動物研究所