專利名稱：一種基于羊傳染性膿皰病毒b2l基因的dna疫苗載體及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種DNA疫苗載體及其制備方法和應(yīng)用，特別設(shè)計一種可用于預(yù)防羊傳染性膿皰的DNA疫苗載體及其制備方法和應(yīng)用，屬于生物藥物領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
羊傳染性膿皰(俗稱“羊口瘡”)是由痘病毒科，副痘病毒屬羊傳染性膿皰病毒(Orfvirus, 0RFV)引起的一種人畜共患傳染病。該病主要危害3 6月齡羔羊和部分成年羊，臨床癥狀表現(xiàn)為嘴唇、口黏膜部分皮膚紅疹、膿皰、潰瘍和結(jié)痂；羔羊表現(xiàn)為齒唇部破潰，不能吃奶,若繼發(fā)或混合感染其他病原微生物死亡率較高。本病可以通過傷口感染飼養(yǎng)人員 表現(xiàn)為手背、指間和前臂部皰疹和破潰。該病世界范圍內(nèi)發(fā)生且廣泛流行，因此，羊傳染性膿皰的爆發(fā)和流行不但嚴(yán)重危害羊產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展而且威脅人們的身體健康，是一種危害較為嚴(yán)重的人畜共患傳染病。臨床上尚無有效的藥物用于羊傳染性膿皰病的防治，疾病處于自限性時，通常使用抗生素阻止細菌繼發(fā)感染；處于并發(fā)癥時，常使用局部冷敷療法或切除法；疾病較為嚴(yán)重時，可進行必要的切除進行治療。目前，用于生產(chǎn)羊口瘡疫苗的毒株是在20年前制備的，隨著病毒的變異，保護效率不高。更為嚴(yán)重的是由于羊口瘡疫苗制作工藝復(fù)雜，市場需求量較其他動物疫苗小等原因，很多動物疫苗企業(yè)不愿意進行羊口瘡疫苗的生產(chǎn)，導(dǎo)致市場上無羊口瘡疫苗供應(yīng)。因此急需一種制作簡單能夠預(yù)防羊口瘡的新型疫苗來進行羊口瘡的防控。隨著養(yǎng)羊業(yè)規(guī)?；目焖侔l(fā)展，羊傳染性膿皰危害越來越嚴(yán)重，如何提高疫苗的免疫保護效率、降低生產(chǎn)成本、簡化免疫程序等成為迫切需要解決的問題，開發(fā)研制一種安全、高效、經(jīng)濟、實用的新型疫苗對羊傳染性膿皰病的防治意義重大。B2L基因編碼42kDa的蛋白，該蛋白是病毒囊膜的成分之一，可刺激機體產(chǎn)生強烈的抗體反應(yīng)，并刺激淋巴細胞釋放(是羊口瘡病毒的保護性抗原之一，誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)足以抵抗強毒的攻擊。真核表達載體PVAXl是在PcDNA3. I的基礎(chǔ)上開發(fā)的具有CMV啟動子和BGHpoly (A)信號序列，通過了食品與藥物管理局批準(zhǔn)的可用于DNA疫苗研究的載體。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種能夠有效用于羊傳染性膿皰病的防治的新型疫苗，本發(fā)明的疫苗不僅具有高的免疫保護效率，而且具有生產(chǎn)成本低，可大規(guī)模生產(chǎn)的特點，能基本滿足當(dāng)前對于羊傳染性膿皰病的防治的需要。為達到本發(fā)明所述的目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案本發(fā)明的一種基于羊傳染性膿皰病毒B2L基因的DNA疫苗載體，其特征在于所述的載體是通過將羊傳染性膿皰病毒的主要免疫原性基因B2L基因插入到真核表達載體PVAXl內(nèi)構(gòu)建得到的。
所述的用于基因疫苗的真核表達載體pVAXl是常用的基因疫苗載體，其特征是在其多克隆位點上游引入人巨細胞病毒的立即早期啟動子序列，在其多克隆位點下游引入可以有效終止轉(zhuǎn)錄和mRNA聚腺苷酸化的牛生長因子(BGH)聚腺苷酸化信號序列，真核表達載體pVAXl的載體圖譜如圖I所示。在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的B2L基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示。進一步的，本發(fā)明還提供了一種宿主細胞，其特征在于含有本發(fā)明所述的DNA疫苗載體。在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的宿主細胞為大腸桿菌DH5 a。再進一步的，本發(fā)明提供了一種構(gòu)建以上所述的DNA疫苗載體的方法，其特征在于包括以下步驟
I(GGATCC)和Xho I (CTCGAG)酶切位點，所述的引物序列如下所示上游引物Pl TTTGGATCCATGTGGCCGTTCTCCTC下游引物P2 TTTCTCGAGTTAATTTATTGGTTTGC(2)用引物P1，P2，在高保真DNA聚合酶作用下，以羊傳染性膿皰病毒DNA為模板，擴增B2L基因，電泳檢測并純化回收該片段；(3)將步驟(2)得到的片段與pVAXl載體分別用限制性內(nèi)切酶BamH I和Xho I進行酶切，分別獲得帶有粘性末端的B2L基因片段和PVAXl質(zhì)粒片段；(4)將步驟(3)得到的兩段片段連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，鑒定正確后，通過小量提取或大量提取制備得到所述的DNA疫苗載體。在本發(fā)明中，優(yōu)選的，步驟(2)中的擴增條件為95°C預(yù)變性5min后進入循環(huán)，循環(huán)參數(shù)為 95°C lmin、57.5°C lmin、72°C lmin，35 個循環(huán)后 72°C延伸 lOmin。在本發(fā)明中，優(yōu)選的，擴增得到的B2L基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示。更進一步的，本發(fā)明還提出了所述的DNA疫苗載體在制備預(yù)防羊傳染性膿皰疾病疫苗中的應(yīng)用。最后，本發(fā)明提出了一種用于預(yù)防羊傳染性膿皰的DNA疫苗，其特征在于含有本發(fā)明所述的DNA疫苗載體。將本發(fā)明制備得到DNA疫苗用于動物免疫，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，注射了本發(fā)明的DNA疫苗的動物能夠有效抵抗羊傳染性膿皰病毒的感染，其免疫保護效率達90%以上，因此本發(fā)明的一種DNA疫苗在防治羊傳染性膿皰疾病方面將具有廣闊的應(yīng)用前景。


圖I為真核表達載體pVAXl的載體圖譜；圖2為B2L基因的PCR擴增電泳結(jié)果；M:DL2000DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1:PCR產(chǎn)物；2 ;空白對照圖3為pVAXl-B2L的PCR鑒定和酶切鑒定結(jié)果；M:DNA DL2000分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；I :PCR檢測結(jié)果；2:雙酶切鑒定結(jié)果；3:空白對照。
具體實施例方式
下面通過實驗并結(jié)合實施例對本發(fā)明做進一步說明，應(yīng)該理解的是，這些實施例僅用于例證的目的，決不限制本發(fā)明的保護范圍。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員理解，在本發(fā)明權(quán)利要求所限定的精神和范圍內(nèi)可對其進行許多改變，修改，甚至等效變更，但都將落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。實施例I 一種基于羊傳染性膿皰病毒B2L基因的DNA疫苗載體的制備一、通過基因工程技術(shù)克隆B2L基因I、引物的設(shè)計根據(jù)B2L基因完整編碼區(qū)設(shè)計一對引物，上下游引物Pl和P2分別引入BamH I(GGATCC)和 Xho T (CTCGAG)酶切位點。 上游引物PI : TTTGGATCCATGTGGCCGTTCTCCTC下游引物P2 : TTTCTCGAGTTAATTTATTGGTTTGC2、PCR 擴增 B2L 基因用引物P1，P2，在高保真DNA聚合酶作用下，以羊傳染性膿皰病毒DNA為模板，擴增B2L基因。擴增條件為95°C預(yù)變性5min后進入循環(huán)，循環(huán)參數(shù)為95°C lmin,57. 5°C lmin、72°C lmin, 35個循環(huán)后72°C延伸lOmin。反應(yīng)結(jié)束后于I. 0%的瓊脂糖凝膠中檢測大小為1137bp的擴增DNA片段。擴增結(jié)果見圖2所示。3、B2L基因擴增片段的酶切及回收經(jīng)電泳檢測后大小合適的DNA片段和pVAXl載體(購自Invitrogen公司)各I微克，分別加入10單位的限制性內(nèi)切酶BamH I和Xho I，混于50微升的反應(yīng)緩沖液中，于37°C酶切I小時，經(jīng)常規(guī)的瓊脂糖凝膠電泳分離和膠中DNA回收方法(按J.薩姆布魯克，D. W.拉塞爾著，黃培堂等譯“分子克隆實驗指南”，第三版，387-399頁，404-407頁2002年8月，科學(xué)出版社出版，北京)分別獲得粘性末端的B2L基因片段和PVAXl質(zhì)粒片段。4、B2L基因片段與pVAXl質(zhì)粒片段連接將純化后的B2L基因片段與真核表達載體pVAXl質(zhì)粒片段連接，目的基因片段與質(zhì)粒載體片段按摩爾比3:1混合，10 μ I反應(yīng)體系如下
2X反應(yīng)緩沖液5 μ
P VAX I質(zhì)粒片段I μ
B2L基因片段Ιμ
T4DNA連接酶I μ I
超純水補至LO μ 5、大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞的制備將_80°C凍存的菌種DH5 a溶解，于LB平板劃線活化，37°C培養(yǎng)過夜，挑取單菌落，接種于5mL LB培養(yǎng)液中，置37°C恒溫搖床中于200rpm培養(yǎng)過夜；次日按體積比1/100轉(zhuǎn)種于IOOml LB培養(yǎng)液中，置37°C恒溫搖床中于200rpm培養(yǎng)2_3h，待菌液濃度OD6tltl為O. 6 O. 8時，在無菌條件下將細菌轉(zhuǎn)移到一個無菌的用冰預(yù)冷的大離心管中，4°C、4000rpm、離心IOmin,棄上清液，盡量流盡殘留培養(yǎng)液；加20mL冰預(yù)冷的O. lmol/L CaCl2重懸沉淀，冰浴30min ;于4°C 6000r/min離心IOmin0棄上清；用4mL冰預(yù)冷的O. lmol/L CaCl2重懸沉淀，置4°C冰箱放置過夜；次晨加入ImL無菌甘油，吹打混勻，每100 μ I分裝于I. 5ml的離心管中，置于_80°C冰箱保存?zhèn)溆谩?、連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化將B2L基因片段與pVAXl質(zhì)粒片段的連接產(chǎn)物各5 μ I分別加入含有100 μ I大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞的離心管中，冰浴O. 5h ;放 入42°C水浴熱激90s，迅速取出冰浴3min，加入LB培養(yǎng)液400μ 1，37°C恒溫搖床培養(yǎng)Ih ;取出200-400 μ I涂布于含卡那霉素的LB平板上。倒置平板，置于37°C恒溫培養(yǎng)箱培育14h ；7、質(zhì)粒提取挑取平板上的單菌落6個，分別接種到5mL含卡那霉素的LB培養(yǎng)液中，37°C 200r/min振搖培養(yǎng)過夜，根據(jù)《分子克隆》堿裂解法小量提取質(zhì)粒。( I)質(zhì)粒小量提取試劑的配制溶液I:25mmol/L Tris · Cl (pH 8. O), 10mmol/L EDTA (PH 8.0)，在 IOlbf/in2 (6. 895 X 10V)高壓蒸汽滅菌15min后置4°C保存?zhèn)溆?，使用前加RNAse。溶液11:0. 2mol/L NaOH, 1%SDS,臨用前配制。溶液III 5mol/L乙酸鉀，冰醋酸11. 5ml，超純水28. 5ml，調(diào)pH值至4. 8。貯存于
4°C備用。(2)小量提取質(zhì)粒分別取約3ml菌液置離心管中，12000r/min離心lmin，收集菌體，加入100 μ I預(yù)冷的溶液I，渦旋至菌體充分懸浮；加入新鮮配制的溶液II 200 μ 1，顛倒混勻，冰浴5min ；加入預(yù)冷的溶液III 150 μ I,混勻后冰浴5min, 12000r/min離心5min,上清轉(zhuǎn)移至另一離心管中，加入等量異丙醇室溫沉淀lOmin, 12000r/min離心IOmin,棄上清，沉淀重懸于200 μ I TE中，加100 μ I即1/2倍體積冰預(yù)冷的7. 5moI/LNH4Ac,混勻后冰浴IOmin,40C 12000r/min離心lOmin。將上清轉(zhuǎn)移至另一離心管中，加I倍體積的異丙醇或2倍體積的無水乙醇室溫沉淀30min, 12000r/min離心5min,沉淀用75%冷乙醇漂洗后,抽干,溶于含20 μ g/ml RNA酶的ddH20或TE (pH 8. O)中，37°C溫育lh，取樣電泳檢查，其余置_20°C冰箱保存?zhèn)溆谩?、鑒定重組質(zhì)粒(I)PCR擴增鑒定以挑選的菌落質(zhì)粒DNA為模板，P1、P2為引物，進行PCR擴增鑒定。擴增產(chǎn)物于1%的瓊脂糖凝膠電泳中檢測，陽性質(zhì)粒命名為PVAX1-B2L。鑒定結(jié)果見圖3中第I泳道。(2)酶切鑒定取經(jīng)PCR鑒定為陽性的質(zhì)粒5 μ 1，分別用限制性內(nèi)切酶BamH I和Xho I雙酶切2h ;于1%的瓊脂糖凝膠電泳中檢測，以DNA分子標(biāo)準(zhǔn)及擴增產(chǎn)物為對照，酶切后產(chǎn)生兩個片段，一個與載體片段大小一致，一個與擴增片段大小一致。鑒定結(jié)果見圖3中第2泳道。(3)序列測定；隨意選取3個陽性克隆測序，測序結(jié)果與報道的序列一致，其中B2L基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示，從而獲得基因疫苗載體PVAX1-B2L。二、質(zhì)粒pVAXl-B2L的大量制備(I)將含有質(zhì)粒重組pVAXl-B2L的菌菌液轉(zhuǎn)接種于75mL LB培養(yǎng)液，37°C 200r/min培養(yǎng)過夜,6000r/min 5min,收集細胞沉淀,用3mL溶液I (50mmol/L葡萄糖，10mmol/LEDTA, 25mmol/L Tris-Cl (pH8. 0)，高壓蒸汽滅菌后置4°C保存?zhèn)溆?懸浮(吹散或渦旋)。(2)加入 6mL 溶液 II (O. 2mol/LNa0H, 1%SDS，現(xiàn)配現(xiàn)用)，冰浴 7-lOmin。(3)加入4. 5mL溶液III (3mol/L乙酸鉀，冰醋酸調(diào)pH值至4. 8)，冰浴7-lOmin。4 °C 10000r/min 10_15min。(4)取上清，加O. 6倍體積的異丙醇，混勻，-20 V 30min或室溫5min。室溫，10000r/min 6-15min。(5)棄上清，用75%乙醇漂洗一次，真空抽干或自然干燥，加I. 5mL TE (10. Ommol/L Tris-HCl, I. 0mmol/L EDTA)懸浮(洗壁 20min 左右)。(6)加 1.5ml 即 I 倍體積冰預(yù)冷的 5mol/LNH4Ac,混勻。4°C 10000r/min IOmin0 (7)將上清轉(zhuǎn)移至7mL的離心管，加I倍體積(3mL)的異丙醇混勻，_20°C作用30mino 12000r/m 15min。(8)棄上清，用75%乙醇漂洗一次，真空抽干或自然干燥，加500 μ L TE懸浮(洗壁20min左右)，并轉(zhuǎn)移至I. 5mL的離心管。(9) 40 μ g/ml RNA 酶，37°C lh，去除 RNA。(10)加 I 倍體積的 13% 的 PEG8000 (含 I. 6mol/L NaCl)，混勻，-20。。30min (可以過夜)。離心，棄上清，用400 μ L TE重溶。(11)加等體積酚仿異戊醇抽提2次，氯仿異戊醇抽提I次。(12)加100 μ I 10mol/LNH4Ac,充分混勻后，加入2倍體積的無水乙醇，_20°C沉淀30min。4°C 12000r/min 離心 5-lOmin。(13)棄上清，用75%乙醇漂洗一次，真空抽干或自然干燥，加50 μ L ΤΕ*Η20重溶，置-20°C備用。三、質(zhì)粒濃度的測定利用分光光度計測定大提質(zhì)粒的濃度，且保證0D260/280比值在I. 8 2. O之間。四、基因疫苗載體的制備與貯存用磷酸鹽緩沖液(PBS pH7. 4)將其稀釋到I μ g/μ 1，或制備成凍干制劑貯存，用前溶解于生理鹽水中。實施例2 DNA疫苗載體的免疫效果驗證I、用于動物免疫的DNA疫苗的制備將大量提取的DNA疫苗質(zhì)粒溶解于磷酸鹽緩沖液(PBS ρΗ7. 4)后和常規(guī)氫氧化鋁疫苗佐劑等體積混合，充分震蕩后，使DNA質(zhì)粒在疫苗的終濃度為lmg/mL，放置4度冰箱，保質(zhì)期12個月。2、動物免疫試驗利用本發(fā)明制備得到的DNA疫苗載體制備得到的DNA疫苗，在多個不同地區(qū)的羊場進行了免疫效果實驗，將其中發(fā)生羊口瘡疾病的三個羊場的患病情況統(tǒng)計如下試驗組I2011年3月，安徽肥東縣某羊場有80只羔羊分兩組，一組40只免疫本發(fā)明疫苗，肌肉注射ImL/只，另一組不做任何免疫設(shè)為對照組，免疫一個月后，該羊場發(fā)生羊口瘡，結(jié)果免疫組40只羔羊只有3只發(fā)生輕微的口瘡癥狀，免疫保護率92. 5%，而對照組則全部發(fā)病。
試驗組22011年9月山東東營某羊場100只羊分兩組，一組50只免疫本發(fā)明疫苗，肌肉注射ImL/只，另一組不做任何免疫設(shè)為對照組，免疫后45天，該羊場發(fā)生羊口瘡，結(jié)果免疫組50只羔羊只有I只發(fā)生輕微的口瘡癥狀，免疫保護率98. 0%，而對照組則50只羊有48只表現(xiàn)為不同程度的口瘡癥狀。試驗組32012年3月甘肅永昌某羊場有40只羊分兩組，一組20只免疫本發(fā)明疫苗，肌肉注射ImL/只，另一組不做任何免疫設(shè)為對照組，免疫后60天，該羊場發(fā)生羊口瘡，結(jié)果免疫組20只羔羊只有2只發(fā)生輕微的口瘡癥狀，免疫保護率90. 0%，而對照組的20只羊其中19只 表現(xiàn)為不同程度的口瘡癥狀。
權(quán)利要求
1.一種基于羊傳染性膿皰病毒B2L基因的DNA疫苗載體,其特征在于所述的疫苗載體是通過將羊傳染性膿皰病毒主要免疫原性基因B2L基因插入到真核表達載體pVAXl內(nèi)構(gòu)建得到的。
2.如權(quán)利要求I所述的DNA疫苗載體，其特征在于所述的B2L基因的核苷酸序列如SEQID NO. I 所示。
3.一種宿主細胞，其特征在于含有權(quán)利要求I或2所述的DNA疫苗載體。
4.如權(quán)利要求3所述的宿主細胞，其特征在于其為大腸桿菌DH5ci。
5.一種構(gòu)建權(quán)利要求I或2所述的DNA疫苗載體的方法，其特征在于包括以下步驟 (1)根據(jù)B2L基因完整編碼區(qū)設(shè)計一對引物，上下游引物Pl和P2分別引入BamHI(GGATCC)和Xho I (CTCGAG)酶切位點，所述的引物序列如下所示上游引物 PI : TTTGGATCCATGTGGCCGTTCTCCTC下游引物 P2 TTTCTCGAGTTAATTTATTGGTTTGC (2)用引物P1，P2，在高保真DNA聚合酶作用下，以羊傳染性膿皰病毒DNA為模板，擴增B2L基因，電泳檢測并純化回收該片段； (3)將步驟(2)得到的片段與pVAXl載體分別用限制性內(nèi)切酶BamHI和Xho I進行酶切，分別獲得帶有粘性末端的B2L基因片段和PVAXl質(zhì)粒片段； (4 )將步驟(3 )得到的兩段片段連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，鑒定正確后，通過小量提取或大量提取制備得到所述的DNA疫苗載體。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于步驟(2)中的擴增條件為95°C預(yù)變性5min后進入循環(huán)，循環(huán)參數(shù)為95°C lmin、57.5°C lmin、72°C lmin，35個循環(huán)后72°C延伸lOmin。
7.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于擴增得到的B2L基因的核苷酸序列如SEQIDNO. I所示。
8.權(quán)利要求I或2所述的DNA疫苗載體在制備預(yù)防羊傳染性膿皰疾病藥物中的應(yīng)用。
9.一種用于預(yù)防羊傳染性膿皰的DNA疫苗，其特征在于含有權(quán)利要求I或2所述的DNA疫苗載體。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種基于羊傳染性膿皰病毒B2L基因的DNA疫苗載體及其制備方法和應(yīng)用，屬于生物藥物領(lǐng)域。本發(fā)明的一種基于羊傳染性膿皰病毒B2L基因的DNA疫苗載體，其特征是將羊傳染性膿皰病毒主要免疫原性基因B2L插入到真核表達載體pVAX1內(nèi)經(jīng)大量制備后得到的。將本發(fā)明的制備得到DNA疫苗用于動物免疫，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，注射了本發(fā)明的DNA疫苗的動物能夠有效抵抗羊傳染性膿皰病毒的感染，其免疫保護效率達90%以上，因此本發(fā)明的一種DNA疫苗在防治羊傳染性膿皰疾病方面將具有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號A61K48/00GK102888422SQ20121036130
公開日2013年1月23日 申請日期2012年9月25日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月25日
發(fā)明者劉湘濤, 張克山, 劉永杰, 孔漢金, 尚佑軍, 田宏, 尹雙輝, 逯忠新 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所