專利名稱：新的抑癌基因unc5d及其編碼蛋白的新應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一個(gè)新的潛在抑癌基因及其編碼蛋白的新應(yīng)用，具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及UNCro作為一個(gè)新的潛在抑癌基因及其編碼蛋白的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
UNC5D屬于UNC5受體家族成員。UNC5受體家族在1997年被報(bào)到是神經(jīng)生長(zhǎng)因子netrin-1的受體，該家族中除UNCOT外，其它成員還包括UNC5A、UNC5B、UNC5C。而UNCOT在UNC5家族中是發(fā)現(xiàn)最晚的。Netrin-1及其受體最初是被發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中起重要作用，因其能夠調(diào)控神經(jīng)纖維的定向遷移。近年來(lái)，Netrin-1及其受體在腫瘤發(fā)生中的作用越來(lái)越受到重視。Netrin-1及UNC5家族中的UNC5A、UNC5B和UNC5C在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用都相繼有了報(bào)道。目前關(guān)于UNCro基因的腫瘤生物學(xué)功能仍未有任何報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的在于研究UNCro在腫瘤特別是腎癌中的表達(dá)特點(diǎn)和其表達(dá)調(diào)控的機(jī)制、研究UNCro的新功能并提供UNCro的新應(yīng)用。在本發(fā)明中，所述UNCro包括UNCro基因或UNCro蛋白等。所述UNCOT蛋白為如SEQ ID N0.2所 示氨基酸序列組成的蛋白，或在SEQ ID N0.2所示氨基酸序列中經(jīng)過(guò)取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且與SEQ ID N0.2所示氨基酸序列組成的蛋白具有相同功能的衍生蛋白。所述UNCro基因?yàn)榫幋a本發(fā)明的UNCro蛋白的多核苷酸序列，優(yōu)選為編碼SEQID NO:2所示氨基酸序列的多核苷酸序列，或者除了上述氨基酸序列的編碼序列之外，還可以包括非編碼序列，例如內(nèi)含子、編碼序列5'或3'端的非編碼序列等。其中優(yōu)選的UNCro基因?yàn)镾EQ ID N0.1所示的多核苷酸序列，其為在GenBank的登記號(hào)為匪080872.2的基因?；蛘?，更優(yōu)選的UNCro基因?yàn)橐环N分離的核苷酸序列，其只包含編碼UNCro蛋白序列，例如SEQ ID N0.1所示的編碼序列:第329 3190位核苷酸序列。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知，本發(fā)明的UNCro基因的核苷酸序列可以完全相同于如SEQ ID NO:1所示的編碼序列，也可以由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，不完全等同于上述核苷酸的編碼序列。本發(fā)明研究了 UNCro在人類(lèi)多種正常組織中的表達(dá)情況，及在多種組織來(lái)源的腫瘤細(xì)胞系、配對(duì)的腎癌和癌旁組織中的表達(dá)特點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)UNCro在多種組織來(lái)源的腫瘤細(xì)胞系中表達(dá)下調(diào)或缺失，其在腎癌組織中的表達(dá)明顯低于癌旁組織。本發(fā)明還進(jìn)一步通過(guò)免疫組化實(shí)驗(yàn)，證實(shí)UNCro蛋白在腎癌組織中表達(dá)下調(diào)。本發(fā)明通過(guò)分析臨床信息資料，發(fā)現(xiàn)UNCro在腎癌組織中的表達(dá)下調(diào)程度與腎癌的Fuhrman分級(jí)呈相關(guān)性。本發(fā)明進(jìn)一步揭示了 UNCro表達(dá)下調(diào)的機(jī)制，發(fā)現(xiàn)染色體上的雜合性缺失(LOH)及UNCro基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島的甲基化是導(dǎo)致UNCro在多種腫瘤細(xì)胞系及腎癌組織中表達(dá)下調(diào)的重要機(jī)制。本發(fā)明通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí):在UNCro表達(dá)下調(diào)或缺失的腎癌細(xì)胞系(786-0及A498)中恢復(fù)UNCro的表達(dá)，可抑制腫瘤細(xì)胞增殖、細(xì)胞遷移和腫瘤細(xì)胞的克隆形成率。通過(guò)分析腎癌細(xì)胞系786-0表達(dá)UNCro前后細(xì)胞周期的變化，發(fā)現(xiàn)UNCro抑制細(xì)胞增殖是通過(guò)減緩G2/M的釋放實(shí)現(xiàn)的。本發(fā)明通過(guò)在人胚腎細(xì)胞(HEK293T)中過(guò)表達(dá)UNCOT發(fā)現(xiàn)，UNC5D可以誘導(dǎo)HEK293T的凋亡，通過(guò)western blot證實(shí)UNCro所誘導(dǎo)的凋亡是caspase依賴的。根據(jù)以上結(jié)果，可認(rèn)為UNCro是一個(gè)抑癌基因，并可作為癌癥的臨床診斷和/或預(yù)后判斷的輔助指標(biāo)，而且UNCro基因或UNCro蛋白在治療和/或抑制腫瘤中具有重要應(yīng)用價(jià)值。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提供了 UNCro基因或其編碼的蛋白(UNCOT蛋白)在制備治療癌癥的藥物中的應(yīng)用?？蓪⒈景l(fā)明的UNCro序列利用任何已知的轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的方法施用于患病個(gè)體的腫瘤部位，在UNCro表達(dá)下調(diào)或缺失的腫瘤細(xì)胞系及癌組織中恢復(fù)UNCro的表達(dá)，通過(guò)抑制細(xì)胞周期進(jìn)程從而抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，抑制腫瘤細(xì)胞增殖、細(xì)胞遷移或腫瘤細(xì)胞的克隆形成率，可以用于治療癌癥。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明還提供了檢測(cè)UNCro基因或其編碼的蛋白的試劑在制備用于癌癥的輔助診斷和/或預(yù)后判斷的組合物中的應(yīng)用?？蓪⑺龅腢NCro作為癌癥診斷和/或預(yù)后判斷的一個(gè)新指標(biāo)，通過(guò)檢測(cè)樣品中UNCro的表達(dá)或表達(dá)水平，從而為癌癥的輔助診斷和/或預(yù)后判斷提供新的依據(jù)。可以利用本領(lǐng)域已知的任何方法檢測(cè)本發(fā)明的UNCro在核酸水平的表達(dá)，也可在蛋白質(zhì)水平檢測(cè)本發(fā)明UNCro的表達(dá)水平。所述檢測(cè)UNCro基因或其編碼的蛋白的試劑包括:用于在PCR中合成UNCro基因DNA鏈和/或其cDNA鏈的PCR引物、或抗UNCro蛋白的抗體等。本發(fā)明的UNCro基因或UNCro蛋白均可以通過(guò)常規(guī)方法獲得。例如，UNC5D基因的多核苷酸序列可以依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的PCR擴(kuò)增技術(shù)將cDNA、mRNA或者基因組DNA作為模板，并選取合適的寡核苷酸引物擴(kuò)增得到。這樣得到的核苷酸可以克隆進(jìn)合適的載體中，并用DNA分析技術(shù)進(jìn)行序列描述。也可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)DNA合成技術(shù)得到。本發(fā)明的UNCro蛋白可用各種已知的方法通過(guò)轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞并在被轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞生長(zhǎng)到適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度后，用適當(dāng)?shù)姆椒ㄕT導(dǎo)啟動(dòng)子，然后繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)完成后，回收和純化本發(fā)明的UNCro蛋白。本發(fā)明中，作為重組UNCro蛋白，可帶有或未帶有標(biāo)簽。本發(fā)明的檢測(cè)UNCro基因或UNCro蛋白的試劑也可通過(guò)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的各種方法來(lái)制備。具體而言,所述癌癥為腎癌。本發(fā)明還提供了 UNCro基因或其編碼的蛋白在抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和/或增殖、抑制腫瘤細(xì)胞的克隆形成、和/或腫瘤細(xì)胞遷移中的應(yīng)用。本發(fā)明通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，UNCro基因或其編碼的蛋白能夠抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖、抑制腫瘤細(xì)胞的克隆形成并能抑制腫瘤細(xì)胞遷移。具體而言，所述腫瘤細(xì)胞為腎癌細(xì)胞。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述細(xì)胞遷移為纖粘連蛋白誘導(dǎo)的腎癌細(xì)胞的遷移。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，本發(fā)明所述的UNCro在具體應(yīng)用時(shí)，可以是包含于載體中。所述載體可以為真核表達(dá)載體或病毒，優(yōu)選為腺病毒。例如，在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，是通過(guò)腺病毒Ad-UNCOT而明顯抑制腫瘤細(xì)胞的增殖或遷移。另一方面，本發(fā)明還提供了一種用于治療癌癥、抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、抑制腫瘤細(xì)胞的遷移、抑制腫瘤細(xì)胞的成瘤性、 和/或誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的藥物組合物，該藥物組合物含有:UNC5D基因和/或其編碼的蛋白，以及一種或多種藥用賦形劑或藥用載體。具體地，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可根據(jù)其所掌握的現(xiàn)有技術(shù)知識(shí)選用適當(dāng)?shù)乃幱觅x形劑或藥用載體，例如可以包括生理鹽水、等滲葡萄糖溶液、緩沖鹽水、甘油、乙醇及上述溶液的組合等。所述藥物組合物可以采用適當(dāng)?shù)闹苿┬问讲⑼ㄟ^(guò)適當(dāng)?shù)慕o藥途徑來(lái)施用，這些對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言在其知識(shí)范圍內(nèi)無(wú)需創(chuàng)造性勞動(dòng)就可確定最佳的方式。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，所述癌癥為腎癌，所述腫瘤細(xì)胞為腎癌細(xì)胞。另一方面，本發(fā)明還提供了一種用于癌癥特別是腎癌診斷和/或預(yù)后判斷的試劑盒，所述試劑盒含有用于檢測(cè)UNCro基因或其編碼的蛋白的試劑，例如:用于在PCR中合成UNC5D基因DNA鏈和/或其cDNA鏈的PCR引物，或抗UNCOT蛋白的抗體等。綜上所述，本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)UNCro是一種新的潛在抑癌基因，特別是在腎癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中具有重要作用。


圖1A顯示PCR檢測(cè)UNCro在人的16種正常組織的表達(dá)情況，從圖中可見(jiàn)，UNC5D在人的腦、腎、前列腺、睪丸、小腸及結(jié)腸組織中均檢測(cè)到了較強(qiáng)的表達(dá)。圖1B顯示PCR檢測(cè)UNCro在多種組織來(lái)源的腫瘤細(xì)胞系中的表達(dá)情況，從圖中可見(jiàn)，UNCro的表達(dá)在多種組織來(lái)源的腫瘤細(xì)胞系中普遍呈下調(diào)趨勢(shì)。UNCro在非惡性的人胚腎細(xì)胞系J1EK293中有很強(qiáng)的表達(dá)。圖1C顯示本發(fā)明通過(guò)在線軟件預(yù)測(cè)到UNCro基因啟動(dòng)子區(qū)的存在CpG島，本發(fā)明設(shè)計(jì)的MSP弓丨物及BGS引物的位置已在圖中標(biāo)出。圖1D (左圖片)顯示通過(guò)MS-PCR檢測(cè)的13種細(xì)胞系中UNCro啟動(dòng)子區(qū)CpG島的甲基化情況，UNCro啟動(dòng)子區(qū)的CpG島在多數(shù)腫瘤細(xì)胞系中呈甲基化狀態(tài)，人胚腎細(xì)胞系HEK293則呈非甲基化狀態(tài)；圖1D (右圖片)顯示通過(guò)甲基化測(cè)序技術(shù)進(jìn)一步證實(shí)在MS-PCR檢測(cè)陽(yáng)性的幾種細(xì)胞系中UNCro啟動(dòng)子區(qū)的CpG島確實(shí)呈甲基化狀態(tài)，而HEK293細(xì)胞確實(shí)呈非甲基化狀態(tài)。圖1E顯示用去甲基化藥物5-aza處理UNCOT低表達(dá)或表達(dá)陰性的786-0、Hela,SW480、SW620及A549五種細(xì)胞系，然后檢測(cè)UNCOT的表達(dá)情況，可見(jiàn)在用5_aza處理一定時(shí)間后，UNC5D的表達(dá)均上調(diào)。通過(guò)甲基化測(cè)序進(jìn)一步證實(shí)UNCro啟動(dòng)子區(qū)的CpG島已被
去甲基化。圖2A是Basic-PCR分析中的凝膠電泳照片，通過(guò)針對(duì)UNCOT特異性引物，對(duì)腎癌以及癌旁組織cDNA進(jìn)行檢測(cè)，說(shuō)明UNCro mRNA在配對(duì)的腎癌組織中表達(dá)下調(diào)。GAPDH為系統(tǒng)內(nèi)參。圖2B顯示實(shí)時(shí)定量PCR分析結(jié)果，通過(guò)對(duì)UNCro與GAPDH的檢測(cè)值之比進(jìn)行比較，說(shuō)明UNCro mRNA在配對(duì)的腎癌組織中表達(dá)下調(diào)。圖2C是免疫組化分析中的組織染色照片，用UNCro的抗體分別對(duì)腎癌以及癌旁組織進(jìn)行染色，進(jìn)一步證明UNCro蛋白在配對(duì)的腎癌組織中表達(dá)下調(diào)。箭頭所指的就是UNCro陽(yáng)性區(qū)，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)在正常以及癌旁組織中，UNCro主要分別于腎小管胞質(zhì)中。圖2D顯示UNCro在癌旁組織與配對(duì)癌組織中的表達(dá)比例(N/T ratio)與相應(yīng)腫瘤組織的臨床Fuhrman分級(jí)之間的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果?？梢钥闯?，隨著Fuhrman分級(jí)的增高,N/T ratio呈下調(diào)趨勢(shì)。圖2E顯示檢測(cè)的腎癌組織與配對(duì)癌旁組織中UNCro啟動(dòng)子區(qū)CpG島的甲基化水平，與上述表達(dá)譜及細(xì)胞系中的甲基化情況一致，腎癌組織中UNCro啟動(dòng)子區(qū)CpG島普遍呈高度甲基化狀態(tài)，而相應(yīng)的癌旁組織則呈非甲基化或低度甲基化狀態(tài)。圖2F顯示甲基化測(cè)序分析結(jié)果，進(jìn)一步證實(shí)圖2E中顯示的結(jié)果。圖2G顯示對(duì)腎癌與配對(duì)癌旁組織進(jìn)行的染色體雜合性缺失(LOH)檢測(cè)的結(jié)果，如圖，本發(fā)明在所選擇的分別位于UNCro編碼區(qū)上游、中游及下游的三個(gè)微衛(wèi)星微點(diǎn)D8S1083、D8S505及D8S1750中均檢測(cè)到了缺失的情況，圖2G是三個(gè)位點(diǎn)發(fā)生LOH的圖例。圖2H是本發(fā)明對(duì)44份配對(duì)腎癌與癌旁組織進(jìn)行LOH檢測(cè)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)圖，在44對(duì)標(biāo)本中，本發(fā)明檢測(cè)到有14對(duì)發(fā)生了雜合性缺失。以上結(jié)果說(shuō)明，除了甲基化外，LOH也是導(dǎo)致UNCro在腎癌組織中發(fā)生表達(dá)下降的重要原因。圖3為本發(fā)明實(shí)施例3中UNCro載體的酶切鑒定圖譜。圖4A顯示在UNCro表達(dá)下調(diào)或缺失的腎癌細(xì)胞系786_0及A498中恢復(fù)UNCOT的表達(dá)，然后用cck-8試劑檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞增殖情況，UNC5D可以明顯抑制腫瘤細(xì)胞系786-0及A498的細(xì)胞增殖。圖4B顯示分析的腎癌細(xì)胞系786-0表達(dá)UNCOT前后細(xì)胞周期的變化情況，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)UNCro的786-0細(xì)胞系無(wú)論是否用Nocodazole進(jìn)行阻滯，處于G2/M期的細(xì)胞數(shù)量都明顯多于對(duì)照組，這說(shuō)明UNCro對(duì)786-0細(xì)胞系的增殖抑制是通過(guò)將細(xì)胞組織在G2/M期實(shí)現(xiàn)的。圖4C顯示平板克隆 形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果，說(shuō)明786-0細(xì)胞在過(guò)表達(dá)UNCro后，在單細(xì)胞clone生長(zhǎng)過(guò)程中存在著差異。圖4D顯示軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果，是研究腫瘤形成的體外實(shí)驗(yàn)，說(shuō)明UNCro對(duì)腎癌細(xì)胞系786-0的克隆形成能力具有抑制性作用。圖4E顯示劃痕試驗(yàn)結(jié)果，說(shuō)明UNCro對(duì)腎癌細(xì)胞系786-0的遷移能力具有抑制性作用。圖4F顯示對(duì)劃痕試驗(yàn)進(jìn)一步的定量試驗(yàn)分析結(jié)果，通過(guò)測(cè)量不同時(shí)間點(diǎn)用腺病毒過(guò)表達(dá)UNCro的786-0及對(duì)照組細(xì)胞的劃痕寬度，以顯示UNCro對(duì)腎癌細(xì)胞系786-0的遷移能力所具有的抑制性作用。圖4G顯示Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，說(shuō)明UNCOT能夠抑制腎癌細(xì)胞系的遷移。圖4H顯示Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果，用以研究腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)的侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程，結(jié)果說(shuō)明UNCro能夠抑制腎癌細(xì)胞系的侵襲能力。圖5A顯示用細(xì)胞核形態(tài)學(xué)的方法所做的細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果，過(guò)表達(dá)UNCro的HEK293T細(xì)胞系與對(duì)照組相比顯示出更多的核碎裂和凋亡小體，說(shuō)明UNCOT能夠誘導(dǎo)HEK293T細(xì)胞的凋亡。圖5B顯示用Annexin V-7AAD雙染色的方法來(lái)證實(shí)UNCOT對(duì)HEK293T細(xì)胞所誘導(dǎo)的凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果，從流式圖來(lái)看，無(wú)論是早期凋亡還是晚期凋亡，實(shí)驗(yàn)組都明顯多于對(duì)照組。
圖5C是用PI染色的方法來(lái)檢測(cè)由于凋亡所形成的DNA定量檢測(cè)時(shí)所出現(xiàn)的亞二倍體峰，UNCro過(guò)表達(dá)的HEK293T中出現(xiàn)了明顯的亞二倍體峰。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，加入caspase的廣泛抑制劑Z-VAD-FMK后，亞二倍體峰消失，說(shuō)明UNCro所誘導(dǎo)的HEK293T細(xì)胞的凋亡是caspase依賴的。圖顯示W(wǎng)estern blot的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，UNC5D過(guò)表達(dá)的HEK293T中能夠檢測(cè)到明顯的PAPR剪切，而且這種剪切時(shí)UNCro劑量依賴的。同樣，加入caspase的廣泛抑制劑Z-VAD-FMK后，PAPR剪切消失，進(jìn)一步說(shuō)明UNCOT所誘導(dǎo)的HEK293T細(xì)胞的凋亡是caspase依賴的。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步闡明本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第三版)(Cold Spring HarborLaboratory (CSHL) Press, 2001)中所述的條件,或按照制造廠商所建議的條件。以下實(shí)施例中，所用原始試劑和材料均可商購(gòu)獲得，主要試劑和材料為:實(shí)驗(yàn)用到以下細(xì)胞系:五·種腎癌細(xì)胞系包括786-0，A498，ACHN, Cak1-1和0S-RC-2 ;兩種膀胱癌細(xì)胞系包括RT-4和MGH-ul ;五種肝癌細(xì)胞系包括H印G2，Bel-7402,SMMC-7721, HLE 和 HCC-LM3 ;五種肺癌細(xì)胞系包括 NC1-H446，NC1-H460，pAa, A549 和NC1-H1299 ;四種消化道腫瘤細(xì)胞系包括SW480，SW620, HT-29和MKN-45 ;五種白血病細(xì)胞系包括U937，K562，Jurkat,Daudi和D341MED ;—種前列腺腫瘤細(xì)胞系為PC-3 ;—種乳腺癌細(xì)胞系為MCF-7 ;宮頸癌細(xì)胞系Hela ;—種卵巢癌細(xì)胞系SK-0V6 ;兩種黑色素細(xì)胞瘤細(xì)胞系WM-451和SK-Mel-37 ；以及骨腫瘤細(xì)胞系Saos_2。這些細(xì)胞系購(gòu)自ATCC或北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。以上細(xì)胞系使用10% FBS/RPM1-DMEM(4.5g/L 葡萄糖，4mM L-谷氨酸，100U/ml 青霉素，IOOy g/ml 鏈霉素)或 10% FBS/RPM1-1640(4.5g/L 葡萄糖，4mM L-谷氨酸，100U/ml青霉素，100 u g/ml鏈霉素)培養(yǎng)。44例人原發(fā)腎癌和癌旁配對(duì)組織由北京大學(xué)第三醫(yī)院泌尿外科提供。組織芯片購(gòu)自上海芯超生物科技有限公司；引物(包括LOH檢測(cè)所用的熒光引物)合成及測(cè)序委托北京擎科生物技術(shù)有限公司完成;Cell Counting Kit~8 (CCK-8)購(gòu)自 Dojindo 公司；5-氮雜-2-脫氧胞苷(5_aza_2’ -deoxycytidine)、亞硫酸氫鈉(sodiumbisulfite)、染料 33258 (Hoechst33258)、Nocodazole、碘化丙唆(Propidium iodide)以及核糖核酸酶A (RNase A)購(gòu)自Sigma-Aldrich公司；TRIZ0LTM 試劑、Lipofectamine 2000 購(gòu)自 Invitrogen 公司；正常組織cDNA panel (Normal tissue cDNA panel)購(gòu)自 Clontech 公司；實(shí)時(shí)定量PCR 試劑 Power SYBR Green PCR master mix 購(gòu)自 Bio-Rad 公司；Wizard Plus Miniprep DNA Purification System、Reverse TranscriptionSystem、pGEM-TEasy vector、T4DNA ligase、pan-caspase inhibitor Z-VAD-FMK、限制性內(nèi)切酶BglI1、EcoR1、NheI以及高保真DNAGo Taq聚合酶購(gòu)自Promega公司；KOD DNA polymerase 酶購(gòu)自 TOYOBO 公司；抗UNCro抗體購(gòu)自Santa Cruz公司；HRP標(biāo)記山羊抗兔的二抗購(gòu)自Promega公司；抗GAPDH抗體購(gòu)自Proteintech公司；抗Flag抗體購(gòu)自Sigma-Aldrich公司；抗PARP購(gòu)自Cell Signaling 公司；Fibronectin、matrigel、FITC 標(biāo)記的 Annexin V 及 7-AAD 凋亡染色試劑盒購(gòu)自BDBiosciences 公司。實(shí)施例1、UNCro在腫瘤細(xì)胞系中表達(dá)下調(diào)及其表觀遺傳學(xué)機(jī)制1.UNC5D在正常組織中的表達(dá)譜PCR檢測(cè)人16種正常組織中UNCro的表達(dá)情況，反應(yīng)中所用引物序列如表I中SEQID Nos.3和4所示，反應(yīng)條件參見(jiàn)表2，用GAPDH作為系統(tǒng)內(nèi)參(內(nèi)參引物見(jiàn)SEQ IDNos.5 和 6)。2.細(xì)胞或組織的RNA提取按照TRIZOLTM(InVitix)gen)試劑的說(shuō)明書(shū)，分別提取細(xì)胞或組織總RNA，并將其用紫外分光光度計(jì)定量。取 I U g 總 RNA,利用 Reverse Transcription System(Promega)通過(guò)Oligo dT合成第一鏈cDNA。3.RT-PCR 反應(yīng)體 系取I ill上述cDNA產(chǎn)物作模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)中所用引物序列如表I中SEQIDNos.7和8所示，反應(yīng)條件參見(jiàn)表2，用GAPDH作為系統(tǒng)內(nèi)參。本實(shí)施例從32例腎癌以及癌旁配對(duì)組織中提取RNA，制備cDNA。利用BIO-RAD熒光定量PCR系統(tǒng)進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)。其中擴(kuò)增GAPDH作為內(nèi)參。4.細(xì)胞或組織的基因組DNA提取按照DNA extraction kit (Promega)的說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞或組織的基因組DNA并將其用紫外分光光度計(jì)定量。5.UNC5D啟動(dòng)子區(qū)CpG島預(yù)測(cè)通過(guò)軟件(http://www.urogene.0rg/methprimer/.)進(jìn)行預(yù)測(cè)，并分別設(shè)計(jì)甲基化特異性引物(SEQ ID Nos.9和10)、非甲基化特異性引物(SEQ ID Nos.11和12)及甲基化測(cè)序引物(SEQ IDNos.13和14)(如表I所示，反應(yīng)條件參見(jiàn)表2)。6.使用bisulfite處理檢測(cè)DNA甲基化水平將提取的基因組DNA使用BglII限制性內(nèi)切酶酶切；使用不針對(duì)目的片段的限制性內(nèi)切酶，酶切不多于700ng的基因組DNA ;通過(guò)沸水水煮10分鐘以終止反應(yīng)；加入2MNa0H至終濃度為0.3M，50°C放置15分鐘以使DNA變性；對(duì)于每一個(gè)樣品，準(zhǔn)備6個(gè)EP管，裝入300微升石蠟油，冰上放置，預(yù)冷。加入2倍體積的2%低熔點(diǎn)瓊脂糖溶解溶液(用水溶解)到DNA溶液中，用“槍”反復(fù)吹勻；形成瓊脂糖珠子:吸取10微升的DNA/瓊脂糖混合物，加入到預(yù)冷的石蠟油中；(一個(gè)Ep管中只放一個(gè)珠子)將管子放置于冰上30分鐘，以形成堅(jiān)實(shí)的珠子；向每一個(gè)管子加入200-500微升2.5M Sodium Metabisulfite ;在暗室中，50°C放置4-12小時(shí)；用ImlTE (pH 8.0)洗珠子3遍，每次15分鐘，以除去剩余的SodiumMetabisulfite ;用500微升0.2M NaOH洗珠子2遍，每次15分鐘，以結(jié)束修飾；用ImlTE (pH
8.0)洗珠子3遍，每次10分鐘；用小體積的TE (pH8.0)保存珠子于4°C ；(珠子可以存放數(shù)周)PCR檢測(cè)前用Iml雙蒸水洗珠子；以處理后得到的珠子為模板，使用GoTaq DNA合成酶(Promega),在touchdown的條件下,進(jìn)行PCR擴(kuò)增；DNA電泳檢測(cè)結(jié)果。7.亞硫酸氫鹽-基因組DNA測(cè)序以處理后得到的珠子為模板,使用GoTaq DNA合成酶,在touchdown的條件下,進(jìn)行PCR擴(kuò)增；DNA電泳及膠回收、純化擴(kuò)增片段；以膠回收得到的片段連接至pGEM-T easy載體；轉(zhuǎn)化并進(jìn)行藍(lán)白斑篩選；挑取白色菌落(10個(gè))進(jìn)行接種到LA培養(yǎng)基中；送菌液進(jìn)行測(cè)序；根據(jù)測(cè)序結(jié)果比對(duì)NCBI提供的正常DNA序列。 8.5-aza處理細(xì)胞系用終濃度為10 U mol/L 的 5_aza_2’-deoxycytidine (Sigma-Aldrich)處理 786-0、Hela, SW480、SW620及A549五種細(xì)胞系，然后檢測(cè)UNCOT啟動(dòng)子區(qū)的甲基化水平。結(jié)果顯示:本實(shí)施例用PCR檢測(cè)UNCro在人的16種正常組織的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)UNCOT在人的腦、腎、前列腺、睪丸、小腸及結(jié)腸組織中均檢測(cè)到了較強(qiáng)的表達(dá)(圖1A)。PCR檢測(cè)UNCro在多種組織來(lái)源的腫瘤細(xì)胞系中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)UNCro的表達(dá)在多種組織來(lái)源的腫瘤細(xì)胞系中普遍呈下調(diào)趨勢(shì)。UNC5D在非惡性的人胚腎細(xì)胞系HEK293中有很強(qiáng)的表達(dá)(圖1B)。本實(shí)施例中，通過(guò)在線軟件預(yù)測(cè)到UNCro基因啟動(dòng)子區(qū)的存在CpG島，所設(shè)計(jì)的MSP引物及BGS引物的位置參見(jiàn)圖1C中所標(biāo)示。MS-PCR檢測(cè)了 13種細(xì)胞系中UNCOT啟動(dòng)子區(qū)CpG島的甲基化情況，發(fā)現(xiàn)UNCro啟動(dòng)子區(qū)的CpG島在多數(shù)腫瘤細(xì)胞系中呈甲基化狀態(tài)，人胚腎細(xì)胞系HEK293則呈非甲基化狀態(tài)(圖1D-左)；甲基化測(cè)序技術(shù)進(jìn)一步證實(shí)在MS-PCR檢測(cè)陽(yáng)性的幾種細(xì)胞系中UN`Cro啟動(dòng)子區(qū)的CpG島確實(shí)呈甲基化狀態(tài)，而HEK293細(xì)胞確實(shí)呈非甲基化狀態(tài)(圖1D-右)。用去甲基化藥物5-aza處理UNCOT低表達(dá)或表達(dá)陰性的786-0、Hela, SW480、SW620及A549五種細(xì)胞系，然后檢測(cè)UNCOT的表達(dá)情況，可見(jiàn)在用5-aza處理一定時(shí)間后，UNC5D的表達(dá)均上調(diào)。通過(guò)甲基化測(cè)序進(jìn)一步證實(shí)UNCOT啟動(dòng)子區(qū)的CpG島已被去甲基化(圖1E)。實(shí)施例2、UNC5D在腎癌組織中表達(dá)下調(diào)及其相關(guān)機(jī)制1.細(xì)胞或組織的RNA及RT-PCR反應(yīng)體系和基因組DNA提取如實(shí)施例1中所述本實(shí)施例從32例腎癌以及癌旁配對(duì)組織中提取RNA，制備cDNA。利用BIO-RAD熒光定量PCR系統(tǒng)進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)。其中擴(kuò)增GAPDH作為內(nèi)參。所用引物如表I所示，反應(yīng)條件參見(jiàn)表2。2.免疫組化分析組織芯片經(jīng)過(guò)脫蠟，梯度酒精水化，在檸檬酸鈉緩沖液中煮沸15min進(jìn)行抗原修復(fù)，用3% H2O2室溫避光孵育20min去除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，用正常羊血清工作液室溫封閉30min，然后滴加兔抗人UNCro多克隆抗體(Santa)至終濃度1: 100，于37°C反應(yīng)lh。用同樣濃度的正常兔源IgG作為陰性對(duì)照。用PBS充分洗滌后滴加HRP標(biāo)記的羊抗兔小鼠抗山羊二抗室溫反應(yīng)30分鐘，用PBS洗滌三次，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，梯度酒精脫水，最后中型樹(shù)膠封片于顯微鏡下觀察并記錄結(jié)果。3.UNC5D表達(dá)相關(guān)的統(tǒng)計(jì)分析UNCro在癌旁組織與配對(duì)癌組織中的表達(dá)比例(N/T ratio)與相應(yīng)腫瘤組織的臨床Fuhrman分級(jí)之間的統(tǒng)計(jì)分析。本發(fā)明將Fuhrman級(jí)別分為三組,1/1_11、11/11_111和III/II1-1V，分別有11、37、12份病例對(duì)應(yīng)。4.檢測(cè)DNA甲基化水平及亞硫酸氫鹽-基因組DNA測(cè)序方法如實(shí)施例1所述。共檢測(cè)病例標(biāo)本44份，每份均包括腎癌與配對(duì)的癌旁組織。5.雜合性缺失檢測(cè)本發(fā)明選擇了分別位于UNCro編碼區(qū)上游、中游及下游的三個(gè)微衛(wèi)星微點(diǎn)，即:D8S1083、D8S505及D8S1750,并合成相應(yīng)地的熒光引物(見(jiàn)表I中SEQ ID Nos.15和16、SEQ ID Nos.17和18、SEQ ID Nos.19和20)，反應(yīng)條件參見(jiàn)表2，通過(guò)分析PCR產(chǎn)物的大小來(lái)確定是否發(fā)生了 L0H。共檢測(cè)病例標(biāo)本44份，每份均包括腎癌與配對(duì)的癌旁組織。結(jié)果顯示:根據(jù)前面的生物信息學(xué)分析及細(xì)胞系結(jié)果的提示，本發(fā)明把注意力轉(zhuǎn)向臨床標(biāo)本，本發(fā)明選擇了腎透明細(xì)胞癌。通過(guò)普通PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn):UNC 在四對(duì)所檢測(cè)的腎癌與配對(duì)癌旁組織中均表現(xiàn)為腎癌組織中表達(dá)確實(shí)或明顯下調(diào)(圖2A)。然后本發(fā)明對(duì)32對(duì)標(biāo)本進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)，通過(guò)對(duì)UNCro與GAPDH的檢測(cè)值之比進(jìn)行比較，說(shuō)明UNC5DmRNA在配對(duì)的腎癌組織中表 達(dá)下調(diào)(圖2B)。免疫組化結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)UNCro蛋白在配對(duì)的腎癌組織中表達(dá)下調(diào)(圖2C，圖中箭頭所指的就是UNCro陽(yáng)性區(qū)，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)在正常以及癌旁組織中，UNCro主要分別于腎小管胞質(zhì)中)。通過(guò)UNCro在癌旁組織與配對(duì)癌組織中的表達(dá)比例(N/T ratio)與相應(yīng)腫瘤組織的臨床Fuhrman分級(jí)之間進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,本發(fā)明發(fā)現(xiàn)一個(gè)有意思的現(xiàn)象=UNCOT在惡性程度越低的腎癌組織中似乎表達(dá)受抑制程度相對(duì)越低(圖2D，隨著Fuhrman分級(jí)的增高，N/Tratio呈下調(diào)趨勢(shì))。本發(fā)明從兩方面來(lái)描述UNCro在腎癌組織中表達(dá)下調(diào)的機(jī)制，一是UNCro基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化檢測(cè)(圖2E及圖2F)，二是染色體上UNCro區(qū)段的雜合性缺失(圖2G及圖2H)。實(shí)驗(yàn)證實(shí)這兩種機(jī)制均參與了了 UNCro在腎癌組織中表達(dá)下調(diào)的調(diào)控。具體地，圖2E是檢測(cè)的腎癌組織與配對(duì)癌旁組織中UNCro啟動(dòng)子區(qū)CpG島的甲基化水平，與上述表達(dá)譜及細(xì)胞系中的甲基化情況一致，腎癌組織中UNCro啟動(dòng)子區(qū)CpG島普遍呈高度甲基化狀態(tài)，而相應(yīng)的癌旁組織則呈非甲基化或低度甲基化狀態(tài)；圖2F是通過(guò)甲基化測(cè)序分析進(jìn)一步證實(shí)圖2E的結(jié)果。圖2G是對(duì)腎癌與配對(duì)癌旁組織進(jìn)行的染色體雜合性缺失(LOH)檢測(cè)的結(jié)果，如圖，本發(fā)明在所選擇的分別位于UNCro編碼區(qū)上游、中游及下游的三個(gè)微衛(wèi)星微點(diǎn)D8S1083、D8S505及D8S1750中均檢測(cè)到了缺失的情況，圖2G是三個(gè)位點(diǎn)發(fā)生LOH的圖例。圖2H是本發(fā)明對(duì)44份配對(duì)腎癌與癌旁組織進(jìn)行LOH檢測(cè)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)圖，在44對(duì)標(biāo)本中，本發(fā)明檢測(cè)到有14對(duì)發(fā)生了雜合性缺失。以上結(jié)果說(shuō)明，除了甲基化外，LOH也是導(dǎo)致UNC5D在腎癌組織中發(fā)生表達(dá)下降的重要原因。實(shí)施例3、UNC5D對(duì)腫瘤細(xì)胞系的增殖、遷移及克隆形成能力的抑制作用1.UNCro真核表達(dá)載體的構(gòu)建本發(fā)明以腦組織cDNA為模板，通過(guò)高保真Taq酶K.0.D酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增(擴(kuò)增引物見(jiàn)表I中SEQ ID Nos.21和22，反應(yīng)條件參見(jiàn)表2)，其中上游引物帶有EcoRI酶切位點(diǎn)，下游引物帶有NheI酶切位點(diǎn)，將PCR產(chǎn)物及pRK空載體用EcoRI和NheI進(jìn)行雙酶切處理，然后DNA電泳分離純化，用T4連接酶將產(chǎn)物進(jìn)行連接，經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化-挑單克隆-小搖菌液-小提質(zhì)粒等一系列操作后，最后經(jīng)測(cè)序及酶切進(jìn)行驗(yàn)證(酶切圖譜見(jiàn)圖3)，測(cè)序正確。正確的質(zhì)粒進(jìn)行大量提取。UNCro蛋白產(chǎn)物的C端標(biāo)有flag標(biāo)簽。2.腺病毒Ad-UNCOT載體的構(gòu)建和病毒的包裝Ad-UNC5D以及對(duì)照空載體病毒Achnull (Mock)、Ad-GFP委托本元正陽(yáng)公司重組、包裝、純化獲得，TCID50亦由該公司測(cè)定。3.腎癌細(xì)胞系的感染以及轉(zhuǎn)染細(xì)胞在感染前一天以適宜密度接種于96孔板、12孔板、6孔板或60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，18-22小時(shí)后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，用不同的MOI值感染細(xì)胞。吸去原細(xì)胞培養(yǎng)上清，加入半量新鮮完全培養(yǎng)基，而后在加入腺病毒的第一小時(shí)里每15分鐘輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)皿，一小時(shí)后補(bǔ)足培養(yǎng)基。待轉(zhuǎn)染的細(xì)胞提前24小時(shí)接種于6孔板中，轉(zhuǎn)染前將培養(yǎng)基換成Opt1-MEM培養(yǎng)基，將含有12ii I的lipofetamine2000的Opt1-MEM培養(yǎng)基2504 y I與含有4 y g質(zhì)粒DNA的OptiM培養(yǎng)基混合，室溫30分鐘后，滴加入培養(yǎng)基中，4-6小時(shí)后換為普通培養(yǎng)基。24小時(shí)后觀察。4.CCK-8法繪制細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線將腺病毒感染后的細(xì)胞按照2000細(xì)胞/孔的密度接種于96孔板中，每組細(xì)胞設(shè)3個(gè)平行復(fù)孔，分別于0h、24h、48h、72h加入10 U I的CCK-8試劑，于37°C在5% CO2下孵育2小時(shí)后，用ELISA Reader 450nm測(cè)量光密度值。對(duì)各時(shí)間點(diǎn)不同組的結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)后繪制細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線。5.細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)將786-0細(xì)胞以I X 106接種于60mm培養(yǎng)板，80%匯合后感染。24小時(shí)后在新鮮培養(yǎng)液中加入nocodazole (300ng/ml ； Sigma-A I dr ich), 16小時(shí)后收集變圓的細(xì)胞，PBS洗兩遍，棄上清，培基重懸以2X10 5/well鋪入6孔板中，每?jī)尚r(shí)為一時(shí)間點(diǎn)收獲細(xì)胞，PBS洗兩遍，加入Iml 70%預(yù)冷乙醇中，吹打均勻，4°C固定12小時(shí)以上。以PBS洗滌去乙醇，IOOOrpm, 5min,洗兩遍。0.5mlPBS重懸細(xì)胞，加入PI和RNaseA至終濃度50 u g/ml，37°C溫浴30min。用流式細(xì)胞儀測(cè)定周期。以FlowJo軟件(Tree Star)分析流式數(shù)據(jù)。6.平板克隆形成實(shí)驗(yàn)分別將轉(zhuǎn)染pRK的細(xì)胞(對(duì)照組)以及pRK-UNC5CL的細(xì)胞(實(shí)驗(yàn)組)按每孔1000個(gè)、2000個(gè)以及10000個(gè)細(xì)胞接種到6孔板中，24小時(shí)后將培養(yǎng)基換成含有G418的普通培養(yǎng)基培養(yǎng)，每三天換一次液，14天后使用預(yù)冷的甲醇固定，0.005結(jié)晶紫染色。7.軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)將腺病毒感染后的細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化并輕輕吹打，使之成為單細(xì)胞，作活細(xì)胞計(jì)數(shù)，用含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度至IX IO6細(xì)胞/L。用蒸餾水分別制備出1.2%和0.7%兩個(gè)濃度的低溶點(diǎn)瓊脂糖液，高壓滅菌后，維持在40°C中使之不凝固。按1:1比例使1.2%的瓊脂糖和2 X DMEM培養(yǎng)基(含有2 X抗生素和20 %的小牛血清)混合后，取3ml混合液注入直徑為6cm的平皿中(IOcm平皿加7 IOml),冷卻凝固，可作底層瓊脂置于CO2溫箱中備用。按1:1比例使0.7%的瓊脂糖和2XDMEM培養(yǎng)基在無(wú)菌試管中相混以后，再將感染Ad-GFP的細(xì)胞(對(duì)照組)以及感染Ad-UNC5CL的細(xì)胞(實(shí)驗(yàn)組)分別加入1.5ml的剛剛配好的混合物中，充分混勻，注入鋪有1.2%瓊脂糖底層平皿中，逐漸形成雙瓊脂層。待上層瓊脂凝固后，置入37°C、5% CO2的溫箱中培養(yǎng)10 14天。把平皿放置在倒置顯微鏡下，觀察細(xì)胞克隆數(shù)。計(jì)算形成率。
8.遷移、侵襲和劃痕以及劃痕定量實(shí)驗(yàn)采用孔徑為8 ii m 的聚碳酸酯膜(polycarbonate membrane)的 24-wellTranswell (Corning公司)進(jìn)行趨化性遷移實(shí)驗(yàn)(chemotaxis assay)。用10 % FBS置于下室，將fibronectin(纖粘連蛋白)(BD-Pharmingen公司)涂于聚碳酸酯膜的下層。收獲對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，用0.1% BSA/DMEM洗細(xì)胞2遍，調(diào)整細(xì)胞密度至I X 107ml，50 yl/孔，每種細(xì)胞設(shè)3個(gè)平行復(fù)孔。于37°C在5% CO2下孵育I小時(shí)后，收膜，用甲醇固定細(xì)胞，Giemsa染色20分鐘，用棉簽輕輕刮去上層未遷移的細(xì)胞，用PBS洗3遍，光學(xué)顯微鏡下觀察。每孔隨機(jī)選取3個(gè)高倍鏡視野進(jìn)行計(jì)數(shù)，對(duì)每種細(xì)胞3個(gè)平行復(fù)孔9個(gè)高倍鏡視野的計(jì)數(shù)值取算術(shù)平均數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。侵襲實(shí)驗(yàn)實(shí)在Transwell遷移實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上在小室膜上面涂上30 ii g的Matrigel (BD Biosciences)。.劃痕實(shí)驗(yàn)在6孔板中進(jìn)行,將感染后的細(xì)胞鋪于孔中直至長(zhǎng)滿一層，使用無(wú)菌槍頭將細(xì)胞劃痕，用PBS洗3次，孵育至相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)后在鏡下進(jìn)行觀察照相。劃痕定量試驗(yàn)中，每三個(gè)小時(shí)為一個(gè)時(shí)間點(diǎn)，用相差顯微鏡進(jìn)行拍照記錄，然后測(cè)量劃痕的寬度并繪制曲線圖。結(jié)果顯示:在UNCro表達(dá)下調(diào)或缺失的腎癌細(xì)胞系786-0及A498中恢復(fù)UNCOT的表達(dá)，然后用cck-8試劑檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞增殖情況，UNCro可以明顯抑制腫瘤細(xì)胞系786-0及A498的細(xì)胞增殖(圖4A)。分析的腎癌細(xì)胞系786-0表達(dá)UNCro前后細(xì)胞周期的變化，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)UNCro的786-0細(xì)胞系無(wú)論是否用Nocodazole進(jìn)行阻滯，處于G2/M期的細(xì)胞數(shù)量都明顯多于對(duì)照組，這說(shuō)明UNCro對(duì)786-0細(xì)胞系的增殖抑制是通過(guò)將細(xì)胞組織在G2/M期實(shí)現(xiàn)的(圖4B)。在平板克隆形成實(shí)驗(yàn)中，786-0細(xì)胞在過(guò)表達(dá)UNCro后，在單細(xì)胞clone生長(zhǎng)過(guò)程中存在著差異(圖4C)。同樣，在軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)中，UNCro對(duì)腎癌細(xì)胞系786-0的克隆形成能力具有抑制性作用(圖4D)。劃痕試驗(yàn)顯示UNCro對(duì)腎癌細(xì)胞系786-0的遷移能力具有抑制性作用(圖4E)。對(duì)劃痕試驗(yàn)進(jìn)一步的定量試驗(yàn)，通過(guò)測(cè)量不同時(shí)間點(diǎn)用腺病毒過(guò)表達(dá)UNCro的786-0及對(duì)照組細(xì)胞的劃痕寬度，以顯示UNCro對(duì)腎癌細(xì)胞系786-0的遷移能力所具有的抑制性作用(圖4F)。Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)的結(jié)果說(shuō)明UNCro能夠抑制腎癌細(xì)胞系的遷移(圖4G)，T ranswell小室侵襲實(shí)驗(yàn)，用以研究腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)的侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程，結(jié)果說(shuō)明UNCro能夠抑制腎癌細(xì)胞系的侵襲能力(圖4H)。實(shí)施例4、UNC5D對(duì)人胚腎細(xì)胞HEK293T的凋亡誘導(dǎo)及其相關(guān)分子機(jī)制1.細(xì)胞核形態(tài)學(xué)檢測(cè)凋亡收獲UNCro過(guò)表達(dá)的293T細(xì)胞及對(duì)照組細(xì)胞，PBS洗滌兩次，以含4%福爾馬林的PBS固定細(xì)胞30分鐘，PBS洗滌兩次，以Hoechst33258 (Sigma)染色5分鐘，PBS洗滌兩次，在熒光顯微鏡的UV通道下觀察記錄，出現(xiàn)核碎裂和凋亡小體的細(xì)胞被認(rèn)為是凋亡細(xì)胞。2.流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)凋亡Annexin V-7AAD雙染色的方法為收獲UNCOT過(guò)表達(dá)的293T細(xì)胞及對(duì)照組細(xì)胞，PBS洗漆兩次,按照Apoptosis Detection Kit (BD Biosciences)的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)。在用PI染色的方法來(lái)檢測(cè)由于凋亡所形成的DNA定量檢測(cè)時(shí)所出現(xiàn)的亞二倍體峰的試驗(yàn)中，在293T細(xì)胞中轉(zhuǎn)入U(xiǎn)NCro及MOCK質(zhì)粒，加入或不加caspase的廣泛抑制劑Z-VAD-FMK，48小時(shí)后收獲UNCro過(guò)表達(dá)的293T細(xì)胞及對(duì)照組細(xì)胞，PBS洗滌兩次，然后加入Iml 70%預(yù)冷乙醇中，吹打均勻，4°C固定12小時(shí)以上。以PBS洗滌去乙醇，1000rpm，5min，洗兩遍。0.5mlPBS重懸細(xì)胞，加入PI和RNaseA至終濃度50i! g/ml，37°C溫浴30min。用流式細(xì)胞儀測(cè)定。3.Wertern blot 檢測(cè)凋亡在293T細(xì)胞中轉(zhuǎn)入U(xiǎn)NCro及MOCK質(zhì)粒，加入或不加caspase的廣泛抑制劑Z-VAD-FMK, 48小時(shí)后收獲UNCOT過(guò)表達(dá)的293T細(xì)胞及對(duì)照組細(xì)胞，收獲相同數(shù)量的UNCOT過(guò)表達(dá)的293T細(xì)胞及對(duì)照組細(xì)胞的總細(xì)胞蛋白，Wertern blot檢測(cè)，PAPR及其剪切蛋白，GAI3DH 及 flag。結(jié)果顯示:在用細(xì)胞核形態(tài)學(xué)的方法所做的細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)中，過(guò)表達(dá)UNCro的HEK293T細(xì)胞系與對(duì)照組相比顯示出更多的核碎裂和凋亡小體，說(shuō)明UNCro能夠誘導(dǎo)HEK293T細(xì)胞的凋亡(圖5A)。用Annexin V-7AAD雙染色的方法來(lái)證實(shí)UNCOT對(duì)HEK293T細(xì)胞所誘導(dǎo)的凋亡，無(wú)論是早期凋亡還是晚期凋亡，實(shí)驗(yàn)組都明顯多于對(duì)照組(圖5B)。用PI染色的方法來(lái)檢測(cè)由于凋亡所形成的DNA定量檢測(cè)時(shí)所出現(xiàn)的亞二倍體峰，UNC5D過(guò)表達(dá)的HEK293T中出現(xiàn)了明顯的亞二倍體峰。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，加入caspase的廣泛抑制劑Z-VAD-FMK后，亞二倍體峰消失，說(shuō)明UNCro所誘導(dǎo)的HEK293T細(xì)胞的凋亡是caspase依賴的(圖5C)。Westernblot的實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，UNCro過(guò)表達(dá)的HEK293T中能夠檢測(cè)到明顯的PAPR剪切，而且這種剪切時(shí)UNCro劑量依賴的。同樣，加入caspase的廣泛抑制劑Z-VAD-FMK后，PAPR剪切消失，進(jìn)一步說(shuō)明UNCro所誘導(dǎo)的HEK293T細(xì)胞的凋亡是caspase依賴的(圖OT)。表1-引物列表
權(quán)利要求
1.UNC5D基因和/或其編碼的蛋白在制備治療癌癥的藥物中的應(yīng)用。
2.檢測(cè)UNCro基因或其編碼的蛋白的試劑在制備用于癌癥的輔助診斷和/或預(yù)后判斷的組合物中的應(yīng)用； 優(yōu)選地，所述檢測(cè)UNCro基因或其編碼的蛋白的試劑包括:用于在PCR中合成UNCro基因DNA鏈和/或其cDNA鏈的PCR引物、或抗UNCOT蛋白的抗體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其中，所述癌癥為腎癌。
4.UNC5D基因和/或其編碼的蛋白在制備具有抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、抑制腫瘤細(xì)胞的遷移、抑制腫瘤細(xì)胞的成瘤性、和/或誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的效果的制劑中的應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其中，所述腫瘤細(xì)胞為腎癌細(xì)胞。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其中，所述遷移為細(xì)胞外基質(zhì)纖粘連蛋白誘導(dǎo)的腎癌細(xì)胞的遷移。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或2或4或5或6所述的應(yīng)用，其中，所述UNCro基因包含于載體 中； 優(yōu)選地，所述載體為真核表達(dá)載體或病毒，更優(yōu)選為腺病毒。
8.一種用于治療癌癥、抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、抑制腫瘤細(xì)胞的遷移、抑制腫瘤細(xì)胞的成瘤性、和/或誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的藥物組合物，該藥物組合物含有: UNC5D基因和/或其編碼的蛋白，以及一種或多種藥用賦形劑或藥用載體。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的藥物組合物，其中，所述癌癥為腎癌，所述腫瘤細(xì)胞為腎癌細(xì)胞。
10.一種用于癌癥診斷和/或預(yù)后判斷的試劑盒，所述試劑盒含有:用于在PCR中合成UNC5D基因DNA鏈和/或其cDNA鏈的PCR引物，或抗UNCOT蛋白的抗體； 優(yōu)選地，所述癌癥為腎癌。
全文摘要
本發(fā)明提供了新的抑癌基因UNC5D基因及其編碼蛋白的新應(yīng)用，具體涉及UNC5D基因和/或其編碼的蛋白在制備治療癌癥的藥物中的應(yīng)用；檢測(cè)UNC5D基因或其編碼的蛋白的試劑在制備用于癌癥的輔助診斷和/或預(yù)后判斷的組合物中的應(yīng)用；UNC5D基因和/或其編碼的蛋白在制備具有抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、抑制腫瘤細(xì)胞的遷移、抑制腫瘤細(xì)胞的成瘤性、和/或誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的效果的制劑中的應(yīng)用。本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)UNC5D是一種新的潛在抑癌基因，特別是在腎癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中具有重要作用。
文檔編號(hào)A61P35/00GK103157116SQ20121036209
公開(kāi)日2013年6月19日 申請(qǐng)日期2012年9月25日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月25日
發(fā)明者張君, 張毓, 呂丹, 董冬 申請(qǐng)人:北京大學(xué)