專利名稱：一種含連翹提取液的納米銀抑菌組合物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于中藥領域，尤其涉及一種中藥抑菌劑。
背景技術：
連翹又稱黃花條、連殼、青翹、落翹、黃奇丹，是中國臨床常用傳統(tǒng)中藥之一，主要生長于山西、河南、山東等地，具有清熱解毒、消腫散結之功效。連翹苷類是連翹所含的主要有效的化學成分，經(jīng)研究表明，連翹具有抗病原微生物、抗炎、解熱、護肝等作用，其中對傷寒桿菌、副傷寒桿菌、大腸桿菌、痢疾桿菌、白喉桿菌及霍亂弧菌、葡萄球菌、鏈球菌都有抑制作用。由于連翹具有多種藥理作用，且在我國資源豐富，廣受人們的關注。中藥制劑濃縮液制成口服液或抑菌劑、涂覆劑等一次用劑量大，且長期使用影響人體健康。

發(fā)明內(nèi)容
針對連翹抑菌劑一次性使用量大和長期使用影響人體健康問題，本發(fā)明人經(jīng)過大量實驗，發(fā)現(xiàn)納米銀能有效增強連翹提取液抑菌性能，減少連翹抑菌劑的用量，且采用兩種低劑量的抑菌組合物，更加的安全。本發(fā)明的目的在于提供一種連翹納米銀抑菌劑，減少連翹抑菌劑一次的用劑量和降低藥品對人體的毒性。本發(fā)明提供如下技術方案
一種抑菌劑，含有連翹提取液、水溶性納米銀；
連翹提取液的制備包括如下步驟取干藥材連翹，加水量為連翹重量的9倍，經(jīng)95 V水浴提取4 h，再經(jīng)過減壓濃縮得到提取液；所得的提取液經(jīng)過O. 22 μ m濾膜過濾。最后提取液經(jīng)高壓液相色譜法對提取液中的連翹苷進行標準定量。水溶性納米銀顆粒粒徑為3 10 nm,納米銀外表包覆兩性聚合物。水溶性納米銀粒徑為3 10 nm,外表為羧基，依照下列方法制備取22. 8 g十四烷酸溶于140 mL按2:5比例混合的甲醇和水中，向溶液中加入4 g的氫氧化鈉析出沉淀，過濾，將沉淀加入到100 mL濃度為10 mol/L水溶性的硝酸銀溶液中得到十四烷酸銀；稱取6. 7 g濃度為20 mmoL/L十四燒酸銀于100 mL燒杯中，向燒杯中加入58 mL濃度為40mmoL/L的三乙胺，80°C下電磁攪拌2 h，白色的十四烷酸銀粉末逐漸變成棕色，不溶的前體消失，加入20 mL丙酮沉淀析出，抽濾，用丙酮洗滌沉淀數(shù)次后，真空干燥，即得到納米銀粒子粉末。依照本方法制備的水溶性納米銀顆粒與連翹提取液具有良好的協(xié)同抗菌作用。抑制大腸桿菌0157:H7時連翹提取液、水溶性納米銀的體積比為75 100: I。為了達到更好的效果，連翹提取液與水溶性納米銀體積比為75-100:1，優(yōu)選為100:1。抑制藤黃微球菌時連翹提取液、水溶性納米銀的體積比為I 25: I。在算體積比時所用的連翹提取液中連翹苷的濃度為9. 3mg/g，所用的水溶性納米銀濃度為10mg/mL。本發(fā)明還涉及上述的抑菌組合物在抑制大腸桿菌0157:H7中的應用。
本發(fā)明還涉及上述的抑菌組合物在抑制藤黃微球菌中的應用。本發(fā)明的有益效果是水溶性納米銀的應用能有效增強連翹抑菌性能，降低連翹抑菌劑的用量，更令人意向不到的是兩種藥物的合用對抑制大腸桿菌0157:H7和藤黃微球菌起到協(xié)同作用，同時本抑菌劑采用兩種低劑量的抑菌物質(zhì)，相對于使用高劑量的連翹或者水溶性納米銀，更加的安全，可以作為安全可靠地外用涂覆劑等。


圖I連翹提取液與納米銀之比為100:1對大腸桿菌0157 :H7協(xié)同抑菌作用
圖Ia 200 μ L連翹提取液對大腸桿菌0157 :Η7的抑制作用，圖Ib 2 μ L的納米銀對大腸桿菌0157: Η7的抑制作用，圖Ic 100 μ L連翹提取液與I μ L納米銀對大腸桿菌0157 :Η7的協(xié)同抑菌作用。
圖2連翹提取液與納米銀之比為75:1對大腸桿菌0157 :Η7協(xié)同抑菌作用
圖2a 150 μL連翹提取液對大腸桿菌0157:H7的抑制作用，圖2b 2 μ L的納米銀對大腸桿菌0157:Η7的抑制作用，圖2c 75 μ L連翹提取液和I μ L納米銀對大腸桿菌0157:Η7的協(xié)同抑菌作用。圖3連翹提取液與納米銀之比為25:1對藤黃微球菌協(xié)同抑菌作用
圖3a 400 μ L連翹提取液對藤黃微球菌的抑制作用，圖3b 16 μ L的納米銀對藤黃微球菌的抑制作用，圖3c 200 μ L連翹提取液和8 μ L納米銀對藤黃微球菌的協(xié)同抑菌作用。圖4連翹提取液與納米銀之比為20:1對藤黃微球菌協(xié)同抑菌作用
圖4a 320 μ L連翹提取液對藤黃微球菌的抑制作用，圖4b 16 μ L的納米銀對藤黃微球菌的抑制作用，圖4c 160 μ L連翹提取液與8 μ L納米銀對藤黃微球菌的協(xié)同抑菌作用。實施例中所用試劑均為常規(guī)試劑，依照常規(guī)方式配制即可。
具體實施例方式實施例I
I、連翹提取液的制備過程稱取干藥材連翹50 g，加水量為450 mL，在95 °C下提取4h，經(jīng)過真空旋轉濃縮儀后，用O. 22 μ m濾膜除去提取液中的雜質(zhì)和細菌，最后用高效液相色譜法測得提取液中連翹苷含量為9. 3 mg/g。2、水溶性銀納米顆粒制備
a、取22. 8 g十四烷酸溶于140 mL按2:5比例混合的甲醇和水中，向溶液中加入4g的氫氧化鈉析出沉淀，過濾，將沉淀加入到100 mL濃度為10 mol/L水溶性的硝酸銀溶液中得到十四烷酸銀。13、稱取6.7 g濃度為20 mmoL/L十四燒酸銀于100 mL燒杯中，向燒杯中加入58mL濃度為40 mmoL/L的三乙胺，80°C下電磁攪拌2 h，白色的十四烷酸銀粉末逐漸變成棕色，不溶的前體消失，加入20 mL丙酮沉淀析出，抽濾，用丙酮洗滌沉淀數(shù)次后，真空干燥，即得到納米銀粒子粉末。3、連翹提取液與水溶性納米銀協(xié)同抑菌作用。
a細菌的培養(yǎng)
挑取LB瓊脂培養(yǎng)基上的大腸桿菌0157:H7的單菌落于10 mL LB肉湯培養(yǎng)基中，置于37 °C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h，再按I %的接種量接種于5 mL的LB肉湯培養(yǎng)基中，37 °C培養(yǎng)4h后。取I mL上述菌液用O. 1%的蛋白胨水連續(xù)稀釋三個梯度，最終的菌液大約為IO6 CFU/mL。b水溶性納米銀與連翹提取液在抑菌性能上的協(xié)同作用
分別取I mL上述已稀釋好的菌液于I. 5 mL滅菌的離心管中，向I號離心管中分別加入200 μ L連翹提取液，向2號離心管中加入2 μ L濃度為10 mg/mL水溶性納米銀，向3號離心管中加入100 μ L連翹提取液(連翹苷濃度為9. 3 mg/g)和I μ L濃度為10 mg/mL水溶性納米銀，不加入任何上述抑菌劑。為保證每管液體最終體積相等，差量用O. 1%的蛋白胨水補齊。置于37 °C培養(yǎng)2 h。每組實驗平行三次。c平板計數(shù)
將實驗組待測液用PBS連續(xù)稀釋兩個梯度，10°、10'10_2各取出200 μ L分別均勻涂布在LB固體平板上；空白組連續(xù)稀釋四個梯度，從10_2、10_3、10_4三個梯度分別均涂布在LB固體平板上。平板吹干后，37°C倒置培養(yǎng)12 h，長出菌落后計數(shù)，以30-300個菌落形成單位(CFU)為有效的計數(shù)范圍。每毫升原菌液活菌數(shù)=平板計數(shù)*稀釋倍數(shù)*5
抑菌物質(zhì)I加入抑菌劑后能數(shù)出來的菌落數(shù)
空白組_6. 5X IO7CFUZmL_
200 μ L 的連翹提取液1.5 X IO6CFUZmL—
含2 μ L濃度為lOmg/mL的納米銀H X IO2CFUZmL
含100 μ L的連翹提取液和I μ L濃度為IOmgZmL的納米銀溶液 |oCFU/mL
如圖I所示，圖Ia 150 μ L連翹提取液對大腸桿菌0157 :Η7的抑制作用，圖Ib 2 μ L的納米銀對大腸桿菌0157: Η7的抑制作用，圖Ic 100 μ L連翹提取液與I μ L納米銀對大腸桿菌0157:Η7的協(xié)同抑菌作用。實驗表明本發(fā)明提供的抑菌組合物具有減少連翹抑菌劑一次用量的作用，且兩種藥物的合用對抑制大腸桿菌0157:Η7起到協(xié)同的作用
具體實施方式
2
I、連翹提取液的制備過程稱取干藥材連翹50 g，加水量為450 mL，在95 °C下提取4h，經(jīng)過真空旋轉濃縮儀后，用O. 22 μ m濾膜除去提取液中的雜質(zhì)和細菌，調(diào)整濃度，用高效液相色譜法測得提取液中連翹苷含量為9. 3 mg/g。2、水溶性銀納米顆粒制備
同實施例I。3、連翹提取液與水溶性納米銀協(xié)同抑菌作用。a細菌的培養(yǎng)
挑取LB瓊脂培養(yǎng)基上的大腸桿菌0157:H7的單菌落于10 mL LB肉湯培養(yǎng)基中，置于37 °C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h，再按I %的接種量接種于5 mL的LB肉湯培養(yǎng)基中，37 °C培養(yǎng)4h后。取I mL上述菌液用O. 1%的蛋白胨水連續(xù)稀釋三個梯度，最終的菌液大約為IO6 CFU/mL。b水溶性納米銀與連翹提取液在抑菌性能上的協(xié)同作用分別取I mL上述已稀釋好的菌液于I. 5 mL滅菌的離心管中，向I號離心管中分別加Λ 150 μ L連翹提取液，向2號離心管中加入2 μ L濃度為10 mg/mL水溶性納米銀，向3號離心管中加入75 μ L連翹提取液(連翹苷濃度為9. 3mg/g)和I μ L濃度為10 mg/mL水溶性納米銀，不加入任何上述抑菌劑。為保證每管液體最終體積相等，差量用O. 1%的蛋白胨水補齊。置于37 °C培養(yǎng)2 h。每組實驗平行三次。c平板計數(shù)
將實驗組待測液用PBS連續(xù)稀釋兩個梯度，10°、10'10_2各取出200 μ L分別均勻涂 布在LB固體平板上；空白組連續(xù)稀釋四個梯度，從10_2、10_3、10_4三個梯度分別均涂布
在
LB固體平板上。平板吹干后，37°C倒置培養(yǎng)12 h，長出菌落后計數(shù)，以30-300個菌落形成單位(CFU)為有效的計數(shù)范圍。每毫升原菌液活菌數(shù)=平板計數(shù)*稀釋倍數(shù)*5
權利要求
1.一種含連翹提取液的納米銀抑菌劑，其特征在于含有連翹提取液、水溶性納米銀；所述的連翹提取液的制備包括如下步驟取干藥材連翹，加水量為連翹重量的9倍，經(jīng)95°〇水浴提取4 h，再經(jīng)過減壓濃縮得到提取液；所述水溶性納米銀依照下列方法制備取22.8 g十四烷酸溶于140 mL按2:5比例混合的甲醇和水中，向溶液中加入4 g的氫氧化鈉析出沉淀，過濾，將沉淀加入到100 mL濃度為10 mol/L水溶性的硝酸銀溶液中得到十四烷酸銀；稱取6. 7 g濃度為20 mmoL/L十四烷酸銀于100 mL燒杯中，向燒杯中加入58 mL濃度為40 mmoL/L的三乙胺，80°C下電磁攪拌2 h，白色的十四烷酸銀粉末逐漸變成棕色，不溶的前體消失，加入20 mL丙酮沉淀析出，抽濾，用丙酮洗滌沉淀數(shù)次后，真空干燥，即得到納米銀粒子粉末。
2.如權利要求I所述的抑菌組合物，其特征在于抑制大腸桿菌0157:H7時連翹提取液、水溶性納米銀的體積比為75 100: I。
3.如權利要求I所述的抑菌組合物，其特征在于抑制藤黃微球菌時連翹提取液、水溶性納米銀的體積比為I 25: I。
4.如權利要求I所述的抑菌組合物，其特征在于所得的提取液經(jīng)過O.22 ym濾膜過濾。
5.如權利要求I所述的抑菌組合物，其特征在于所得的提取液經(jīng)高壓液相色譜法對提取液中的連翹苷進行標準定量。
6.如權利I 5任一所述的抑菌組合物在抑制大腸桿菌0157:H7中的應用。
7.如權利I 5任一所述的抑菌組合物在抑制藤黃微球菌中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抑菌組合物，屬于中藥領域。抑菌組合物中連翹提取液與水溶性納米銀以比例混合，兩種藥物的合用對抑制大腸桿菌O157:H7、藤黃微球菌起到協(xié)同的作用。本發(fā)明的一種連翹提取物與納米銀抑菌劑與現(xiàn)有的技術相比，解決了常規(guī)抑菌方法中連翹抑菌劑用量較大的問題，同時采用兩種低劑量的抑菌物質(zhì)減少了微生物耐藥的發(fā)生機率、降低了其對人體的毒性，更加的安全。
文檔編號A61P31/04GK102895315SQ20121036651
公開日2013年1月30日 申請日期2012年9月28日 優(yōu)先權日2012年9月28日
發(fā)明者魏華, 熊勇華, 許恒毅, 王力均, 郭亮, 徐鋒, 萬翠香, 賴衛(wèi)華 申請人:南昌大學