專利名稱：A型肉毒素重鏈刺激神經(jīng)突起再生的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及A型肉毒素重鏈刺激神經(jīng)突起再生的用途。
背景技術(shù)：
肉毒素(Botulinum Neurotoxin,BoNT)是由專性厭氧梭形芽孢桿菌-肉毒桿菌產(chǎn)生并釋放的細(xì)菌外毒素。是一種致病力很強(qiáng)的天然生物毒素。根據(jù)其血清學(xué)特征肉毒素共有7種不同的類型，分別為血清型A、B、C、D、E、F和G，其中血清型A毒理最強(qiáng)，也是目前主要的市售肉毒素。A型肉毒素的化學(xué)成分為蛋白多肽，其分子由一條重鏈(heavy chain_HC，分子量為IOOkDa)和一條輕鏈(light chain-LC，分子量為50kDa)所組成，二者借二硫鍵相互連接。進(jìn)入體內(nèi)的A型肉毒素主要作用于運(yùn)動神經(jīng)終板(NMJs)的突觸前膜，通過其分子中 重鏈羧基端與突觸前膜相應(yīng)蛋白受體結(jié)合形成毒素-受體復(fù)合物；同時通過毒素重鏈的氨基端介導(dǎo)內(nèi)吞、使毒素輕鏈由細(xì)胞外轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。毒素-受體復(fù)合物經(jīng)內(nèi)吞作用進(jìn)入胞漿形成內(nèi)質(zhì)體，由于內(nèi)質(zhì)體的酸性PH環(huán)境，毒素重鏈與輕鏈分離、輕鏈逸出進(jìn)入胞衆(zhòng)。因此A型肉毒素的重鏈部分被稱為毒素的結(jié)合亞單位；而肉毒素輕鏈則是一種金屬鋅依賴性蛋白水解酶，被稱為毒素的催化亞單位。輕鏈隨重鏈進(jìn)入胞漿后主要裂解胞漿內(nèi) SNARE (soluble NSF attachment protein receptor)成分之一—SNAP-25,使后者喪失參與突觸囊泡在突觸前膜的?？考捌淙诤系墓δ?。當(dāng)神經(jīng)沖動到達(dá)運(yùn)動終板時，裂解的SANP-25不能與其他SNARE蛋白(syantaxin and synaptobrevin)形成突觸蛋白復(fù)合體，因此突觸囊泡不能在突觸前膜停靠并與突觸前膜融合，從而阻斷神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿釋放至突觸間隙，受累的神經(jīng)因此不能刺激所支配肌肉發(fā)生收縮，引起肌肉松弛性麻痹。肉毒素的這種毒性作用主要是通過其分子中的輕鏈的酶活性而實現(xiàn)的。據(jù)報道除乙酰膽堿外，肉毒素還可以阻斷其它神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，譬如谷氨酸、甘氨酸、去甲腎上腺素、多巴胺、血清素及神經(jīng)多肽等。臨床實踐中正是利用了 A型肉毒素的這種毒力作用，將其小劑量局部注射而達(dá)到某種治療效果。肉毒素注射治療起始于上個世紀(jì)40年代，開始時主要用于控制一些與肌肉收縮紊亂有關(guān)的病癥(斜視、眨眼癥、斜頸、面肌痙攣及腦癱引起的外周肌肉強(qiáng)直等)。繼而，肉毒素注射被廣泛地用于美容科皮膚去皺、治療多汗癥、各種慢性疼痛等。近些年來，A型肉毒素在其他一些領(lǐng)域的臨床應(yīng)用及實驗探討也開始引起了人們對肉毒素研究的濃厚興趣，譬如研究發(fā)現(xiàn)局部A型肉毒素注射可以抑制纖維母細(xì)胞增生及膠原產(chǎn)生、減少創(chuàng)傷愈合過程中疤痕的形成；通過肉毒素注射局部血流量增加可延長植皮皮瓣的存活。有些體內(nèi)及體外的研究也曾經(jīng)發(fā)現(xiàn)A型肉毒素全毒素局部注射引起肌肉麻痹后的恢復(fù)期可伴有肌肉組織內(nèi)新的運(yùn)動終板樣結(jié)構(gòu)形成(即神經(jīng)末梢的再生)、可以刺激培養(yǎng)之運(yùn)動神經(jīng)元突起增長、數(shù)目增加等。然而，A型肉毒素上述臨床或?qū)嶒灟熜нh(yuǎn)遠(yuǎn)不能僅用輕鏈對突觸蛋白的裂解作用而解釋。A型肉毒素重鏈部分與突觸前膜結(jié)合所導(dǎo)致的細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活及膜上其他受體蛋白構(gòu)像的改變勢必對上述毒素的臨床不同療效起著重要的啟動作用。
中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后由于神經(jīng)細(xì)胞的再生能力極低，因此常不能完全再生而恢復(fù)原有功能，即使神經(jīng)細(xì)胞本身存活，但是由于其神經(jīng)突起斷裂后不能與周圍細(xì)胞形成新的突觸關(guān)系而致功能永久性喪失，所以尋找能夠刺激中樞神經(jīng)元和神經(jīng)突起再生的新藥制劑是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的重要任務(wù)之一。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種A型肉毒素重鏈新的用途，具體的涉及到A型肉毒素重鏈刺激神經(jīng)突起再生的用途，用來解決恢復(fù)神經(jīng)細(xì)胞的再生能力的問題。我們?nèi)∩?天的小鼠脊髓，將其制備成富含運(yùn)動神經(jīng)元的細(xì)胞懸液后，接種于預(yù)先鋪被了多聚賴氨酸/層粘連蛋白的培養(yǎng)板，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)I小時，待細(xì)胞完全貼壁后，加入不同劑量的A型肉毒素重鏈溶液繼續(xù)培養(yǎng)24小時，然后用固定細(xì)胞，磷酸緩沖液沖洗，透膜后，5%正常羊血清室溫封閉I小時，加入抗PGP9. 5—抗。將培養(yǎng)板放入濕盒置于4° C冰箱孵育過夜，棄去一抗，磷酸緩沖液洗滌，加入Alexa 488標(biāo)記的羊抗兔IgG 二抗室溫、避光孵育，磷酸緩沖液再次洗滌后將培養(yǎng)板置于熒光倒置顯微鏡下觀察并攝影，對所攝 取的熒光顯微鏡圖片中的神經(jīng)細(xì)胞突起進(jìn)行測定分析。通過測定結(jié)果，我們認(rèn)為A型肉毒素重鏈具有刺激中樞神經(jīng)元神經(jīng)突起再生的作用。給予A型肉毒素重鏈處理的神經(jīng)元其表面突起更具有神經(jīng)細(xì)胞的特征樹突和軸突樣突起明顯可變，軸突長、直、少分支；樹突相對短且多分支。而且由于單獨(dú)使用A型肉毒素重鏈避免了肉毒素全毒素的毒性作用，因此使用過程安全，無毒副作用，而且很小劑量既可達(dá)到刺激神經(jīng)突起再生的作用，譬如重鏈采用劑量為O. I O. OOlnmol / L時，神經(jīng)突起增長總長度較未采用重鏈處理組的細(xì)胞增加2倍以上，且與相對較大劑量組相比較效應(yīng)基本一致，甚至更為突出。因此其促神經(jīng)突起增生(再生)的效果非常顯著。A型肉毒素重鏈對小鼠脊髓運(yùn)動神經(jīng)元具有促進(jìn)其突起明顯增生作用，其促增生作用主要表現(xiàn)在(I)A型肉毒素重鏈可促進(jìn)胚胎脊髓運(yùn)動神經(jīng)元突起的增生；(2)A型肉毒素重鏈可促進(jìn)生后5 7天小鼠脊髓運(yùn)動神經(jīng)元突起的再生；(3) A型肉毒素重鏈可使運(yùn)動神經(jīng)元突起延長；(4) A型肉毒素重鏈可使神經(jīng)元突起的數(shù)量明顯增加。由此可見A型肉毒素重鏈具有刺激中樞脊髓運(yùn)動神經(jīng)元突起再生的能力，有望成為發(fā)掘新型治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷再生的新藥制劑的選擇之一。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于(I)本發(fā)明對已知制劑A型肉毒素重鏈開發(fā)出新的臨床用途，開拓了一個新的應(yīng)用領(lǐng)域。(2)本發(fā)明所采用的A型肉毒素由于去除了毒素分子中的輕鏈部分，具有安全無毒、藥理作用明顯，而且由于毒素重鏈具有與神經(jīng)末梢特異性結(jié)合的機(jī)制，具有對神經(jīng)系統(tǒng)的特異性，預(yù)示著具有較好的臨床應(yīng)用前景。(3)本發(fā)明所采用的A型肉毒素重鏈已經(jīng)可以通過基因工程合成，制劑來源可靠，無毒副作用并可制作成注射針劑使用。(4)本發(fā)明所采用的A型肉毒素重鏈對神經(jīng)突起生長具有明顯促增生作用，臨床意義重大，市場前景廣闊。


下面結(jié)合附圖和具體實施方式
對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。圖I為在不同濃度A型肉毒素重鏈作用下，培養(yǎng)的脊髓運(yùn)動神經(jīng)元突起生長的變化。圖2為在不同劑量A型肉毒素重鏈對脊髓運(yùn)動神經(jīng)元突起長度增長的影響，其中*p〈0. 05，與 H-CaO'lOAKT1。)組相比；其中 ***p〈0. 001，與 H-C(1(T8，10_9，10_1Q)組相比。圖3為在A型肉毒素重鏈對小鼠脊髓運(yùn)動神經(jīng)元神經(jīng)突起分支數(shù)量的影響，其中***p〈0. 01，p〈0. 001，與!《(10-8，10-9，10,)組相比。
具體實施例方式下面給出一種根據(jù)本發(fā)明制備的非限定性的實施例。將用市售A型肉毒素重鏈制劑作為促進(jìn)神經(jīng)突起再生的刺激劑。I.美國ListBiological Laboratories公司基因重組A型肉毒素重鏈產(chǎn)品產(chǎn)品號612A，包裝大小50μ g。產(chǎn)品中重鏈重組的436個氨基酸序列基于原毒素的第872 1296氨基酸序列。分子重量為51kDa。重組的A型肉毒素重鏈仍然具有抗原性，可與抗A型肉毒素抗體發(fā)生反應(yīng)；并具有與神經(jīng)細(xì)胞膜上GTlb及SV2結(jié)合的能力。2.本發(fā)明所采用實驗對象為嚙齒類動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)，來自胚胎或生后5 10天的動物大腦皮層、海馬及脊髓組織。將其制備成富含運(yùn)動神經(jīng)元的細(xì)胞懸液后，以O(shè).IXlO6 / ml接種于預(yù)先鋪被了多聚賴氨酸/層粘連蛋白的培養(yǎng)板在37° C孵箱(95%CO2 / 5% O2)內(nèi)培養(yǎng)I小時，待細(xì)胞完全貼壁后，加入不同劑量的A型肉毒素重鏈溶液(制劑濃度范圍為10_7 10_12M / L)后繼續(xù)培養(yǎng)I 7天。為了對照比較，另設(shè)正常對照組-未給予A型肉毒素重鏈組。各組每次實驗均設(shè)定4各培養(yǎng)孔為一組，每孔內(nèi)所含細(xì)胞數(shù)約為5000個左右。待培養(yǎng)至一定期限(1、2、3、4一7天)時，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞(室溫下I小時)，磷酸緩沖液沖洗，O. 1% Triton X-100透膜10分鐘，5%正常羊血清室溫封閉I小時，加入抗PGP9. 5) 一抗(神經(jīng)元及神經(jīng)突起標(biāo)記蛋白。將培養(yǎng)板放入濕盒置于4° C冰箱孵育過夜。棄去一抗，磷酸緩沖液洗滌3次，每次5分鐘，加入熒光標(biāo)記的二抗后室溫、避光孵育I小時，磷酸緩沖液再次洗滌后將培養(yǎng)板置于熒光倒置顯微鏡下觀察，每孔隨機(jī)選擇6個高倍視野攝影(40X)，每組共采集24個視野。對所攝取的熒光顯微鏡圖片中的神經(jīng)細(xì)胞突起(每組共測定細(xì)胞數(shù)為50個)進(jìn)行測定分析。同樣實驗重復(fù)三次。三次實驗所得結(jié)果為本發(fā)明所陳述結(jié)果。3.通過測定結(jié)果我們認(rèn)為A型肉毒素重鏈具有刺激中樞神經(jīng)元神經(jīng)突起再生的作用。給予A型肉毒素重鏈處理的神經(jīng)元其表面突起更具有神經(jīng)細(xì)胞的特征樹突和軸突樣突起明顯可變，軸突長、直、少分支；樹突相對短且多分支(圖I)。而且由于單獨(dú)使用A型肉毒素重鏈避免了肉毒素全毒素的毒性作用，因此使用過程安全，無毒副作用，而且很小劑量既可達(dá)到刺激神經(jīng)突起再生的作用，譬如重鏈采用劑量為0. I 0. OOlnmol / L時，神經(jīng)突起增長總長度較未采用重鏈處理組的細(xì)胞增加2倍以上，且與相對較大劑量組向比較效應(yīng)基本一致，甚至更為突出。因此其促神經(jīng)突起增生(再生)的效果非常顯著(圖1，2)。
另外，給予A型肉毒素重鏈處理后，神經(jīng)細(xì)胞突起分支也明顯增多，大劑量組與小劑量組之間對于神經(jīng)突起分支的作用基本一致，因此，可以采用小劑量應(yīng)用而避免今后臨床長期應(yīng)用或多次應(yīng)用所導(dǎo)致耐受性或免疫反應(yīng)的反應(yīng)的發(fā)生，使療效更為穩(wěn)定，長久(圖 3)。除神經(jīng)突起長度明顯增長外，在A型肉毒素重鏈作用下，脊髓運(yùn)動神經(jīng)元細(xì)胞突起數(shù)量也比對照組明顯增多，主要表現(xiàn)為二級突起數(shù)量增加及細(xì)胞周圍突起的總數(shù)量顯著增加(圖3)。由于A型肉毒素重鏈的細(xì)胞膜結(jié)合蛋白(GTlb及SV2)廣泛存在，同時脊髓運(yùn)動神經(jīng)元是形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)育最為完善的中樞神經(jīng)細(xì)胞之一，因此，A型肉毒素重鏈刺激其神經(jīng)突起增生反應(yīng)代表了中樞神經(jīng)元的共同特征。基于此點(diǎn)，可以推測A型肉毒素重鏈對其他部位的中樞神經(jīng)細(xì)胞具有同樣的效應(yīng)。以上所述，僅為本發(fā)明較佳的具體實施方式
，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，可 輕易想到的變化或替換，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。因此，本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書的保護(hù)范圍為準(zhǔn)。
權(quán)利要求
1.A型肉毒素重鏈刺激神經(jīng)突起再生的用途。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的用途，其特征在于所述的A型肉毒素重鏈，為重組的氨基酸序列，其重組的436個氨基酸序列基于原毒素的第872 1296氨基酸序列，分子重量為51kDa，具有抗原性。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的用途，其特征在于所述的神經(jīng)為嚙齒類動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的用途，其特征在于所述的A型肉毒素重鏈，其用量為IO-7 KT12M / し
5.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的用途，其特征在于所述的A型肉毒素重鏈，其用量為10べ0 KT12M /し
全文摘要
本發(fā)明公開了一種A型肉毒素重鏈新的用途，具體的涉及到A型肉毒素重鏈刺激神經(jīng)突起再生的用途；其促增生作用主要表現(xiàn)在A型肉毒素重鏈可促進(jìn)胚胎脊髓運(yùn)動神經(jīng)元突起的增生，A型肉毒素重鏈可促進(jìn)生后5～7天小鼠脊髓運(yùn)動神經(jīng)元突起的再生，A型肉毒素重鏈可使運(yùn)動神經(jīng)元突起延長，A型肉毒素重鏈可使神經(jīng)元突起的數(shù)量明顯增加；由此可見A型肉毒素重鏈具有刺激中樞脊髓運(yùn)動神經(jīng)元突起再生的能力，有望成為發(fā)掘治療新型中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷再生的新藥制劑的選擇之一。
文檔編號A61P25/02GK102861318SQ20121036998
公開日2013年1月9日 申請日期2012年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月29日
發(fā)明者李夏青, 王志茹, 王晨亮, 張宏, 齊超 申請人:山西醫(yī)科大學(xué)