專利名稱：松果菊苷的新用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及松果菊苷的新用途，具體涉及在制備神經(jīng)生長因子受體激動劑中的用途。
背景技術(shù)：
神經(jīng)營養(yǎng)因子主要包括神經(jīng)生長因子(NGF)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、神經(jīng)營養(yǎng)因子-3(NT-3)和神經(jīng)營養(yǎng)因子-4/5(NT-4/5)。神經(jīng)營養(yǎng)因子在神經(jīng)元的生長、分化和存活中起著重要的作用，它們主要通過結(jié)合并激活Trk受體和p75NTR受體發(fā)揮功能。其中，P75NTR受體屬于腫瘤壞死因子受體家族，而Trk受體是跨膜酪氨酸激酶受體家族成員，包括TrkA、TrkB和TrkC。NGF主要與TrkA相結(jié)合，BDNF和NT-4/5主要與TrkB相結(jié)合，而NT-3則主要與TrkC相結(jié)合。神經(jīng)營養(yǎng)因子與Trk受體結(jié)合后激活受體，促進受體形成同二 聚體，并磷酸化自身受體位于胞漿內(nèi)的酪氨酸殘基，從而進一步激活下游分子通路。這些細 胞通路被激活可以誘發(fā)多種生物學(xué)效應(yīng)，包括抑制神經(jīng)元凋亡、促進神經(jīng)元的存活和分化、促進細胞骨架的改變以及軸突的延伸。在神經(jīng)營養(yǎng)因子中，研究最多的是NGF和BDNF的神經(jīng)保護作用，尤其是這兩個因子在神經(jīng)退行性疾病治療中的應(yīng)用前景得到了國內(nèi)外的廣泛關(guān)注。研究提示，阿爾茨海默病(AD)病人的記憶衰退及認知障礙與中樞膽堿能神經(jīng)元進行性凋亡密切相關(guān)，而NGF和BDNF系統(tǒng)功能減退可能是導(dǎo)致這些神經(jīng)元凋亡的重要原因。在AD病人和動物模型中都發(fā)現(xiàn)，基底神經(jīng)節(jié)及中樞膽堿能神經(jīng)元投射區(qū)的NGF和BDNF表達均下降，進而分別導(dǎo)致TrkA、TrkB受體的活性下降、合成減少，誘發(fā)神經(jīng)元凋亡。相反地，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)過表達NGF或BDNF都可以明顯改善嚙齒類和靈長類AD動物模型中基底神經(jīng)節(jié)膽堿能神經(jīng)元的功能，促進其突起生長，阻止凋亡，并減輕記憶衰退等癥狀。另外，在其他神經(jīng)退行性疾病中，NGF和BDNF系統(tǒng)功能同樣受損，進而加重相應(yīng)腦區(qū)的神經(jīng)元損傷。而在大鼠和靈長類H)模型中，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)過表達NGF或BDNF或直接腦內(nèi)注射外源重組神經(jīng)營養(yǎng)因子能夠保護中腦多巴胺能神經(jīng)元；以上干預(yù)措施還可以促進HD動物模型中紋狀體投射神經(jīng)元的存活。由于神經(jīng)組織具有難于再生和不能利用糖酵解提供能量等特點，神經(jīng)系統(tǒng)、特別是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的疾病往往難于治療，直到目前我們?nèi)匀狈τ行е委熒窠?jīng)退行性疾病的措施。神經(jīng)營養(yǎng)因子一度被認為是有前途的治療神經(jīng)退行性疾病的措施之一，但重組的神經(jīng)營養(yǎng)因子口服易降解，靜脈注射后難于透過血腦屏障，起不到神經(jīng)保護的作用，難以直接用于治療神經(jīng)退行性病。在很多疾病模型中通過轉(zhuǎn)基因的方法使損傷腦區(qū)神經(jīng)生長因子過表達，顯示了良好的神經(jīng)保護作用，但轉(zhuǎn)基因技術(shù)目前還無法應(yīng)用于人類。因此，現(xiàn)階段大量國內(nèi)外研究都致力于尋找或合成具有神經(jīng)營養(yǎng)作用的穩(wěn)定的小分子活性化合物，以期用于臨床治療神經(jīng)退行性疾病。由于要在數(shù)目浩大的天然化合物中篩選出合適的活性分子，其工作量極為繁重，故目前的主要手段是人工合成神經(jīng)營養(yǎng)因子的類似物。然而，合成的很多小分子多肽雖具有神經(jīng)營養(yǎng)作用，卻同樣存在不穩(wěn)定易降解和血腦屏障通透性低等問題；因受體選擇性差以及可能的毒性未知等原因，合成的具有Trk受體激動作用的非肽類小分子化合物是否能應(yīng)用于臨床還存在疑問。中藥是我國寶貴的歷史遺產(chǎn)，中藥治病屬于經(jīng)驗用藥，歷經(jīng)幾千年反復(fù)實踐，證實療效顯著且副作用較小，但目前很多機制靶標尚不明確。本申請選擇臨床已證實對神經(jīng)退行性疾病有明顯治療效果的常用中藥肉蓯蓉，鑒定其提取物中的主要活性分子松果菊苷是否具有Trk受體激活作用，及該作用在其神經(jīng)保護效應(yīng)中的地位。該提取物活性強，較穩(wěn)定不易降解，膜通透性強，可以自由穿越血腦屏障，具有成為藥物的潛在價值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供中藥肉蓯蓉提取物中的主要活性小分子松果菊苷在制藥方面的用途。為了達到上述目的，本發(fā)明提供了松果菊苷在制備神經(jīng)生長因子受體激動劑中的用途。 進一步地，所述的神經(jīng)生長因子受體為Trk受體。更進一步地,所述的Trk受體為TrkA和TrkB受體中的至少一種。本發(fā)明還提供了松果菊苷在制備神經(jīng)保護藥物中的用途。本發(fā)明還提供了松果菊苷在制備治療動脈栓塞藥物中的用途。本發(fā)明還提供了松果菊苷在制備治療帕金森病藥物中的用途。本發(fā)明證實了松果菊苷具有Trk受體激動作用，明確了其神經(jīng)保護作用的機制以指導(dǎo)臨床用藥，具體如下(I)、細胞學(xué)實驗證明，天然小分子活性化合物松果菊苷對神經(jīng)細胞損傷有選擇性特異保護作用，松果菊苷可以激活TrkA/B受體，通過Trk受體特異性抑制劑抑制受體激活能夠逆轉(zhuǎn)松果菊苷的神經(jīng)保護作用。(2)、細胞學(xué)實驗證實，雖然松果菊苷對非神經(jīng)細胞損傷沒有保護作用，當(dāng)轉(zhuǎn)染非神經(jīng)細胞株，使其過表達人的TrkA/B受體后，松果菊苷能夠激活受體，產(chǎn)生保護效應(yīng)，該效應(yīng)可以被Trk受體特異性抑制劑逆轉(zhuǎn)。(3)、細胞學(xué)實驗證實，當(dāng)轉(zhuǎn)染非神經(jīng)細胞株，使其過表達胞外結(jié)合功能域缺失突變的TrkA/B受體后，松果菊苷的保護效應(yīng)消失，說明松果菊苷是通過直接與TrkA/B受體結(jié)合激活受體活性，而不是通過胞內(nèi)其他激酶激活TrkA/B受體的活性，證實松果菊苷是TrkA/B受體的激動劑。(4)、在多種動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷模型上進一步證明，靜脈給與松果菊苷能產(chǎn)生顯著神經(jīng)保護效應(yīng)，同時長期靜脈給藥沒有產(chǎn)生明顯的肝、腎毒性。本發(fā)明的有益效果在于發(fā)現(xiàn)了松果菊苷作為神經(jīng)生長因子受體激動劑的新用途。


圖I為松果菊苷的結(jié)構(gòu)示意圖；圖2為松果菊苷預(yù)處理對Hela、CH0、PC12和原代培養(yǎng)大鼠皮層神經(jīng)元細胞凋亡影響結(jié)果圖；圖3為松果菊苷和K252a預(yù)處理對大鼠皮層神經(jīng)元TrkA/B受體活性和細胞凋亡影響結(jié)果圖。圖3A-B為松果菊苷和K252a預(yù)處理對大鼠皮層神經(jīng)元中TrkA/B受體活性影響結(jié)果圖；圖3C為松果菊苷和K252a預(yù)處理對大鼠皮層神經(jīng)元中神經(jīng)元凋亡影響結(jié)果圖；圖4為Hela細胞過表達人源的全長TrkA或TrkB受體后，松果菊苷和K252a預(yù)處理對TrkA/B受體活性和Hela細胞凋亡影響結(jié)果圖。圖4A-B為Hela細胞過表達人源的全長TrkA或TrkB受體2d后，松果菊苷和K252a預(yù)處理對Hela細胞中TrkA/B受體活性影響結(jié)果圖；圖4C為Hela細胞過表達人源的全長TrkA或TrkB受體2d和4d后，TrkA/B的表達結(jié)果圖；圖4D-F為Hela細胞過表達人源的全長TrkA或TrkB受體2d后，松果菊苷和K252a預(yù)處理對Hela細胞凋亡影響結(jié)果圖；圖5為Hela細胞過表達人源的截斷TrkA或TrkB受體后，松果菊苷和K252a預(yù)處理對TrkA/B受體活性和Hela細胞凋亡影響結(jié)果圖。圖5A-B為Hela細胞過表達人源的胞外結(jié)合功能域缺失突變的TrkA或TrkB受體2d后，松果菊苷和K252a預(yù)處理對Hela細胞中TrkA/B受體活性影響結(jié)果圖；圖5C為Hela細胞過表達人源的胞外結(jié)合功能域缺失突變 的TrkA或TrkB受體2d和4d后，TrkA/B的表達結(jié)果圖；圖OT-F為Hela細胞過表達人源的胞外結(jié)合功能域缺失突變的TrkA或TrkB受體2d后，松果菊苷和K252a預(yù)處理對Hela細胞凋亡影響結(jié)果圖；圖6A為大鼠大腦中動脈栓塞模型后的大腦冠狀切片TTC染色結(jié)果圖；圖6B為大鼠大腦中動脈栓塞模型后大腦皮層的western blot測定結(jié)果圖。圖7為MPTP帕金森模型小鼠的中腦切片酪氨酸羥化酶(TH)免疫組化染色結(jié)果圖。圖8為松果菊苷持續(xù)靜脈給藥0、3、6、12月后，大鼠肝腎功能的檢測結(jié)果圖。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖和實施例來具體說明本發(fā)明。實施例第一步松果菊苷能通過激活TrkA/B受體選擇性減輕神經(jīng)細胞的損傷選用四種不同類型的細胞，Hela, CHO、PC12和原代培養(yǎng)大鼠皮層神經(jīng)元，通過線粒體呼吸鏈抑制劑NaN3誘導(dǎo)細胞損傷，并在此基礎(chǔ)上觀察松果菊苷的保護作用，具體步驟為I、細胞培養(yǎng)I)細胞系的培養(yǎng)Hela(CCL-2. 2)、CH0(CCL_61)和 PC12 (CRL-1721)細胞都購自ATCC0 Hela和CHO細胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)(Gibco公司)，PC12細胞則用含10%馬血清、5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，細胞傳代后長至80%融合時換液，進行下述的給藥處理。2)大鼠皮層神經(jīng)元的原代培養(yǎng)取孕17天左右的SD大鼠的健康胎鼠，取腦并分離皮層，剪碎后消化吹打，經(jīng)篩網(wǎng)過濾，離心收集神經(jīng)元細胞，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液重懸細胞，以1x107ml的密度種于細胞培養(yǎng)板上。4h后更換為神經(jīng)元培養(yǎng)液(含B27的Neurobasal溶液，Gibco公司)，繼續(xù)培養(yǎng)。3d后換液,一周后進行下述的給藥處理。2、松果菊苷對神經(jīng)細胞的選擇性保護作用I)給藥處理試驗分組對照組(Ctrl)、NaN3組(NaN3)、松果菊苷低劑量組(E5+NaN3)、中劑量組(E10+NaN3)、高劑量組(E20+NaN3)。Hela、CHO 和 PC12 細胞的 NaN3組通過2mM的NaN3處理細胞24h誘導(dǎo)損傷；大鼠皮層神經(jīng)元對NaN3損傷相對敏感，則用
O.2mM的NaN3處理神經(jīng)元24h誘導(dǎo)損傷。松果菊苷低(5mg/L)、中(10mg/L)、高(20mg/L)劑量組都先用松果菊苷預(yù)處理各種細胞2h，更換新的培液后，再予NaN3單獨處理24h。對照組不給藥處理。NaN3購自Sigma公司；松果菊苷購自中國藥品生物制品檢定所。2)細胞凋亡的測定在NaN3給藥處理12和24h后，分別收集以上各組的細胞，通過BD公司的Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒染色后，用流式細胞儀檢測細胞凋亡的變化。實驗數(shù)據(jù)以平均值土標準差(X土S)表示，用GraphPad Prism統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析。結(jié)果如圖2所示，在NaN3誘導(dǎo)的四種細胞(Hela、CHO、PC12和原代培養(yǎng)大鼠皮層神經(jīng)元)損傷模型中，松果菊苷預(yù)處理能顯著降低PC12和大鼠皮層神經(jīng)元的凋亡率，其保護作用呈劑量相關(guān)；然而，松果菊苷對Hela和CHO細胞損傷沒有明顯作用。提示松果 菊苷預(yù)處理能選擇性保護神經(jīng)細胞，而且劑量為10mg/L時就已能夠提供最大保護效應(yīng)。3、松果菊苷對大鼠皮層神經(jīng)元中TrkA/B受體活性的影響 I)給藥處理實驗分組對照組(Ctrl)、NaN3組(NaN3，Na)、松果菊苷損傷組(E+NaN3，E+Na)、松果菊苷對照組(E)、K252a組(K+E+NaN3，K+E+Na)。大鼠皮層神經(jīng)元通過
O.2mM的NaN3處理神經(jīng)元24h誘導(dǎo)損傷；松果菊苷損傷組先用10mg/L松果菊苷預(yù)處理細胞2h,更換新的培液后，再予NaN3單獨處理24h ;松果菊苷對照組用10mg/L松果菊苷預(yù)處理細胞2h，更換新的培液；K252a組先用I μ M的K252a和10mg/L松果菊苷同時預(yù)處理細胞2h,更換新的培液后，再予NaN3單獨處理24h ;對照組不給藥處理。K252a購自Sigma公司。2) Western blot檢測蛋白水平的變化在NaN3給藥處理12和24h后，收集以上各組的細胞，用 RIPA 裂解液(含有 150mM NaCl, I % NP-40,50mM Tris, pH 8.0，1% 脫氧膽酸鈉，0. 1% SDS)冰上裂解細胞，12，OOOg離心20min收集上清。用BAC試劑盒(碧云天公司)測蛋白濃度后，通過8% SDS凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、脫脂牛奶封閉后，一抗孵育過夜(pTrkA(9141)、TrkA(2505)、TrkB(4603)抗體均購自 Cell signaling 公司，pTrkB 抗體(NBP1-03516)購自 Novus 公司，β -actin 抗體(A3854)購自 Sigma 公司)。PVDF 膜(BioRad公司)經(jīng)TBST漂洗后，孵育HRP標記的二抗山羊抗兔IgG(AP307P，Chemicon公司)。最后用ECL顯色試劑盒(Santa Cruz公司)反應(yīng)曝光,通過quantity one圖像分析系統(tǒng)檢測蛋白條帶積分光密度。結(jié)果如圖3A-B所示，NaN3損傷能抑制TrkA/B受體磷酸化,松果菊苷預(yù)處理不僅可以逆轉(zhuǎn)該效應(yīng)，還能進一步激活TrkA/B受體，顯著增加受體磷酸化，而Trk受體的特異性抑制劑K252a能阻止松果菊苷激活TrkA/B受體。提示松果菊苷可能通過激活TrkA/B受體選擇性減輕神經(jīng)細胞損傷。3)細胞凋亡的測定在NaN3給藥處理12和24h后，分別收集以上各組的細胞，按上述方法檢測細胞凋亡的變化。結(jié)果如圖3C所示，K252a阻止松果菊苷激活TrkA/B受體的同時還能逆轉(zhuǎn)松果菊苷抑制神經(jīng)元損傷的效應(yīng)。證實松果菊苷是通過激活TrkA/B受體減輕神經(jīng)元損傷的。第二步非神經(jīng)細胞瞬時過表達人源的全長TrkA/B受體后，松果菊苷能通過激活Trk受體減輕細胞損傷
既然松果菊苷預(yù)處理對非神經(jīng)細胞損傷沒有明顯作用，我們進一步在Hela細胞中瞬時過表達人源的全長TrkA/B受體，并觀察在此基礎(chǔ)上給予松果菊苷能否產(chǎn)生保護效應(yīng)。具體步驟如下l)Hela細胞的培養(yǎng)及傳代=Hela細胞的來源及培養(yǎng)同上所述，傳代后過夜準備轉(zhuǎn)染。
2)質(zhì)粒制備通過分子克隆方法將人來源的TrkA/B全長cDNA裝入pcDNA3. O表達質(zhì)粒中。3)瞬時轉(zhuǎn)染先將I μ g的質(zhì)粒與100 μ I Opti-MEM溶液(Gibco公司)混勻，再與4μ I的FuGENE HD轉(zhuǎn)染試劑(Roche公司)混合均勻，室溫放置半小時后加入細胞中，6h后換成正常的細胞培液。4) Western blot驗證TrkA/B過表達轉(zhuǎn)染2d和4d后，收集Hela細胞,用上述同樣的方法裂解細胞、提取蛋白、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，孵育TrkA/B、β-actin抗體和二抗(來源同上)，曝光、拍照并分析數(shù)據(jù)。結(jié)果如圖4C所示,轉(zhuǎn)染2d和4d后，western blot檢測顯示Hela細胞中TrkA/B大量表達。于是在轉(zhuǎn)染2d后，開始給藥處理。5)給藥處理實驗分組對照組(Ctrl)、NaN3組(NaN3，Na)、松果菊苷損傷組(E+NaN3，E+Na)、松果菊苷對照組(E)、K252a組(K+E+NaN3，K+E+Na)。給藥處理同上述大鼠皮層神經(jīng)元的給藥劑量和方式。6)細胞凋亡的測定在NaN3給藥處理12和24h后，分別收集以上各組的細胞，通過上述方法檢測細胞凋亡。7) Westernblot檢測蛋白水平的變化在NaN3給藥處理12和24h后，收集以上各組的細胞，用上述同樣的方法裂解細胞、提取蛋白、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，孵育PTrkA/B、TrkA/B、β-actin抗體和二抗(來源同上)，曝光、拍照并分析數(shù)據(jù)。結(jié)果如圖4所示，松果菊苷預(yù)處理可以激活TrkA/B受體(圖4A_B)，并明顯抑制瞬時過表達TrkA/B受體的Hela細胞凋亡(圖4D-F)。而同時給與K252a和松果菊苷預(yù)處理時，K252a能夠完全逆轉(zhuǎn)松果菊苷激活TrkA/B受體(圖4A-B)及抑制細胞損傷(圖4D-F)的效應(yīng)。說明TrkA和TrkB受體都參與介導(dǎo)松果菊苷的神經(jīng)保護作用。第三步非神經(jīng)細胞瞬時過表達人源的截斷突變TrkA/B受體后，松果菊苷不能激活截斷突變的Trk受體，也不能抑制細胞損傷為證實松果菊苷是通過直接與TrkA/B受體相結(jié)合而激活受體，本發(fā)明構(gòu)建了人源的胞外配體結(jié)合功能域缺失突變的TrkA/B表達質(zhì)粒，瞬時轉(zhuǎn)染Hela細胞，并觀察在此基礎(chǔ)上給予松果菊苷能否產(chǎn)生保護效應(yīng)。具體步驟如下l)Hela細胞的培養(yǎng)及傳代同上所述。2)質(zhì)粒制備通過Toyobo公司的突變試劑盒將上述含有人來源的TrkA/B全長cDNA的pcDNA3. O表達質(zhì)粒進行突變，得到受體胞外配體結(jié)合功能域缺失突變的TrkA/B表達質(zhì)粒。3)瞬時轉(zhuǎn)染和western blot驗證TrkA/B過表達步驟都同上所述。結(jié)果如圖5C所示,轉(zhuǎn)染2d和4d后，western blot檢測顯示Hela細胞中截斷突變的TrkA/B大量表達。同樣地，我們在轉(zhuǎn)染2d后，開始給藥處理。
4)實驗分組和給藥處理都同上所述。5)細胞凋亡的測定同上所述。6) Western blot檢測蛋白水平的變化同上所述。結(jié)果如圖5所示，松果菊苷預(yù)處理不能激活截斷突變的TrkA/B受體(圖5A_B)，也不能抑制過表達截斷突變TrkA/B受體的Hela細胞凋亡(圖 _F)。提示松果菊苷是通過直接與TrkA/B受體結(jié)合激活受體活性,而不是通過激活胞內(nèi)其他激酶進而激活TrkA/B受體活性的，證實松果菊苷是TrkA/B受體的直接激動劑。第四步在體給與松果菊苷同樣可以激活TrkA/B受體，產(chǎn)生神經(jīng)保護效應(yīng)在動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷模型上進一步驗證，靜脈給與松果菊苷能否減輕神經(jīng)元損傷、產(chǎn)生顯著神經(jīng)保護效應(yīng)，同時檢測治療劑量的松果菊苷長期給藥會否產(chǎn)生明顯的 肝、腎毒性。具體步驟為I、大鼠大腦中動脈栓塞模型的建立健康SD大鼠，雄性，體重230 250g，購自中科院實驗動物中心。動物隨機分組對照組(Ctrl),缺血組(ischemia, I),松果菊苷缺血組(E+ischemia, E+I), K252a組(K+E+ischemia,K+E+I),松果菊苷對照組(E),每組14只。缺血組在大鼠左側(cè)頸內(nèi)、頸外動脈分叉處附近將線栓經(jīng)頸內(nèi)動脈入顱，監(jiān)測血流至線栓堵住左側(cè)大腦中動脈分支開口，持續(xù)缺血Ih后拔出線栓恢復(fù)灌流。同時對照組進行同樣的手術(shù)處理，但不插入線栓。松果菊苷缺血組每天定時按40mg/(kg體重)連續(xù)靜脈注射松果菊苷2周后，進行與缺血組相同的手術(shù)處理，并繼續(xù)靜脈注射松果菊苷5d ;松果菊苷對照組按同樣劑量靜脈給藥但不予手術(shù)。K252a組給與同樣劑量的松果菊苷和Κ252&(5μπι01/(1^體重)/d)同時靜脈注射2周后，進行與缺血組相同的手術(shù)處理，并繼續(xù)給藥5d。每組同時給藥，給藥完成后再進行以下實驗。2、TTC染色將各組一半的大鼠麻醉后直接取腦，通過模具行冠狀切片，并浸入TTC染液(Sigma公司)中避光染色20min，取出漂洗后，排列拍照。如圖6A所示，在大鼠大腦中動脈栓塞模型中，靜脈給藥松果菊苷能明顯減小皮層和紋狀體區(qū)梗死灶的面積，同時給與Trk抑制劑K252a能逆轉(zhuǎn)松果菊苷的神經(jīng)保護效應(yīng)。3、Western blot檢測蛋白水平的變化將各組另一半的大鼠麻醉后直接處死，取腦并分離左、右皮層，通過玻璃勻漿器冰上勻漿，再用RIPA裂解液充分裂解細胞，接著用上述同樣的方法離心提取蛋白、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，孵育pTrkA/B、TrkA/B、β-actin抗體和二抗(來源同上)，曝光、拍照并分析數(shù)據(jù)。如圖6B所示，松果菊苷靜脈給藥能激活大鼠皮層神經(jīng)元的TrkA/B受體，通過K252a阻止TrkA/B受體激活可以逆轉(zhuǎn)松果菊苷的神經(jīng)保護效應(yīng)。說明在體給與松果菊苷同樣是通過激活TrkA/B受體產(chǎn)生神經(jīng)保護效應(yīng)的。4、小鼠MPTP帕金森模型的建立健康C57BL小鼠，雄性，體重20 25g，購自中科院實驗動物中心。動物隨機分組對照組(control)，MPTP 組，松果菊苷組(E+MPTP)，K252a 組(K+E+MPTP)，每組 7 只。MPTP組每日定時按30mg/ (kg體重)腹腔注射MPTP (Sigma公司)，連續(xù)注射5d。對照組同時給與等量的生理鹽水腹腔注射。松果菊苷組在連續(xù)靜脈注射松果菊苷(40mg/(kg體重)/d)2周后，開始腹腔注射MPTP (30mg/ (kg體重)/d)，并繼續(xù)靜脈注射松果菊苷2周。K252a組給與同樣劑量的松果菊苷和K252a(5 μ mol/(kg體重)/d)同時靜脈注射2周后，開始腹腔注射MPTP，并繼續(xù)靜脈給藥2周。每組同時給藥，給藥完成后再進行以下實驗。5、小鼠的灌注、取腦及冰凍切片小鼠用10%水合氯醛麻醉；經(jīng)心灌注生理鹽水100ml，再灌注固定液即含4%多聚甲醛的磷酸鹽緩沖液(O. lmol/L,pH 7. 2) 250ml，30min灌注完畢。取出整腦，在上述固定液內(nèi)浸泡6h。經(jīng)梯度蔗糖脫水后，冰凍冠狀切片。6、酪氨酸羥化酶免疫組化染色挑取黑質(zhì)平面的連續(xù)冠狀切片，進行酪氨酸羥化酶(TH)的免疫組化染色，以鑒定多巴胺能神經(jīng)元。步驟如下用O. OlM PBS溶液(pH = 7. 4)漂洗腦片3次，再用含O. 2%TritonX-100和10%小牛血清的O. OlM PBS溶液封閉I小時后，兔抗大鼠TH抗體
(Chemicon,AB152) 一抗孵育過夜，用O. OlM PBS溶液漂洗腦片3次，HRP標記的二抗山羊抗兔IgG (AP307P, Chemicon公司)孵育I小時,通過DAB試劑盒(中杉金橋)顯色，顯微鏡下觀察。如圖7所示，在小鼠MPTP帕金森模型中，靜脈給藥松果菊苷能顯著減少中腦多巴胺能神經(jīng)元的死亡，同時給與Trk抑制劑K252a可以逆轉(zhuǎn)松果菊苷的神經(jīng)保護效應(yīng)，提示松果菊苷可以對多種神經(jīng)元損傷產(chǎn)生保護作用。7、肝腎功能的測定健康SD大鼠，雄性，體重230 250g，購自中科院實驗動物中心。動物隨機分組對照組(Ctrl)，松果菊苷組(E)，每組7只。松果菊苷組按上述治療劑量40mg/ (kg體重)/d持續(xù)靜脈給藥0、3、6、12月后，自大鼠尾靜脈采血，血樣經(jīng)4000rpm離心2min分離血清。通過丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(GPT)試劑盒及天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(GOT)試劑盒測定血清中GPT和GOT的含量以反映肝功能；通過肌酐(Cr)試劑盒和尿素氮(BUN)試劑盒測定血清中Cr和BUN的含量以反映腎功能。以上試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。如圖8所示，治療劑量的松果菊苷持續(xù)靜脈給藥12個月對大鼠的肝功能(GPT、GOT)和腎功能(Cr、BUN)都沒有顯著影響，說明治療劑量的松果菊苷在體長期靜脈給藥沒有明顯的肝、腎毒性。
權(quán)利要求
1.松果菊苷在制備神經(jīng)生長因子受體激動劑中的用途。
2.如權(quán)利要求I所述的用途，其特征在于，所述的神經(jīng)生長因子受體為Trk受體。
3.如權(quán)利要求2所述的用途，其特征在于，所述的Trk受體為TrkA和TrkB受體中的至少一種。
4.松果菊苷在制備神經(jīng)保護藥物中的用途。
5.松果菊苷在制備治療動脈栓塞藥物中的用途。
6.松果菊苷在制備治療帕金森病藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明提供了松果菊苷的新用途。天然小分子活性化合物松果菊苷對神經(jīng)細胞損傷有選擇性特異保護作用，松果菊苷可以激活TrkA/B受體，通過Trk受體特異性抑制劑抑制受體激活能夠逆轉(zhuǎn)松果菊苷的神經(jīng)保護作用。靜脈給與松果菊苷能產(chǎn)生顯著神經(jīng)保護效應(yīng)，同時長期靜脈給藥沒有產(chǎn)生明顯的肝、腎毒性。
文檔編號A61P25/16GK102861041SQ20121037790
公開日2013年1月9日 申請日期2012年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月29日
發(fā)明者李文偉, 朱敏, 呂傳真 申請人:復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院