專利名稱：一種重組苦豆子凝集素的制備及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及到一種重組苦豆子凝集素和制備方法及其所述重組苦豆子凝集素在抑菌、抗腫瘤和抗病毒方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
凝集素(lectin)是一類結(jié)構(gòu)各異的，至少有一個(gè)非催化結(jié)構(gòu)域，能非共價(jià)地、可逆地結(jié)合專一性單糖或寡糖的非免疫源性、非酶本質(zhì)的糖結(jié)合蛋白。他們?cè)谧匀唤鐝V泛存在，在植物，動(dòng)物和微生物中都發(fā)現(xiàn)有凝集素的存在。目前已發(fā)現(xiàn)的植物凝集素有近1000種，廣泛分布于豆科、石蒜科、百合科、禾本科、大戟科和茄科等眾多植物中，這之中豆科植物凝集素含量最豐富。豆科凝集素具有多種生物學(xué)功能，許多研究表明豆科凝集素能干擾真菌細(xì)胞壁的產(chǎn)生，影響真菌正常的細(xì)胞 代謝；抵御病原體入侵植物；抑制分生孢子萌發(fā)。在農(nóng)業(yè)方面，轉(zhuǎn)入豆科凝集素基因的農(nóng)作物，抗蟲(chóng)、抗菌能力增強(qiáng)。醫(yī)學(xué)方面，豆科凝集素能抑制腫瘤細(xì)胞增殖。除此之外，還具有識(shí)別糖蛋白、糖肽和生物膜中碳水化合物決定簇，作為植物的儲(chǔ)存蛋白和微生物的共生介質(zhì)等功能。隨著人們對(duì)豆科凝集素結(jié)構(gòu)與功能等多方面的深入研究，它在生物學(xué)、農(nóng)學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用受到了廣泛的關(guān)注?？喽棺?Sophora alopecuroides L.),屬于豆科槐屬，是我國(guó)荒漠草原及農(nóng)田上一種多年生藥用草本植物。主要分布于新疆、內(nèi)蒙古、甘肅和寧夏等地區(qū)?？喽棺游犊嘈院?，具有清熱解毒、祛風(fēng)燥濕、止痛和殺蟲(chóng)等作用，并發(fā)現(xiàn)其具有抗炎、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等藥理活性。本發(fā)明利用生物工程技術(shù)，將苦豆子凝集素基因克隆到表達(dá)載體上，轉(zhuǎn)化到基因工程菌中，通過(guò)發(fā)酵并應(yīng)用親和層析技術(shù)進(jìn)行純化，獲得重組的苦豆子凝集素，該重組苦豆子凝集素對(duì)真菌和腫瘤細(xì)胞具有強(qiáng)烈的抑殺作用，而且能顯著抑制HIV-I反轉(zhuǎn)錄酶的活性。關(guān)于苦豆子凝集素的功能與應(yīng)用未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。本發(fā)明為科學(xué)認(rèn)識(shí)苦豆子凝集素的功能提供依據(jù)，在抗菌制劑和抗癌蛋白藥物的篩選方面具有重要的理論和應(yīng)用價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供重組苦豆子凝集素及其制備方法，并且公開(kāi)苦豆子凝集素在制備抗真菌感染、抗腫瘤和抗病毒藥物中的用途。本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的一種源于藥用植物苦豆子的凝集素SAL，其國(guó)際基因庫(kù)登錄號(hào)是DQ011517. I的重組苦豆子凝集素的制備方法和在制備用于抗微生物感染和抗腫瘤藥物中的用途，制備方法包括有苦豆子總RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,苦豆子凝集素基因的提取，利用PCR擴(kuò)增苦豆子凝集素基因，構(gòu)建原核表達(dá)載體及相應(yīng)的重組基因工程菌，重組質(zhì)粒pET30a-SAL的高效表達(dá)及重組苦豆子凝集素的獲得。本發(fā)明的目的還可以通過(guò)以下技術(shù)解決措施來(lái)進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)一種源于藥用植物苦豆子的凝集素SAL，其國(guó)際基因庫(kù)登錄號(hào)是DQ011517. I的重組苦豆子凝集素His-SAL在制備用于抗意大利青霉菌(Penicillium italicum)、指狀青霉菌(Penicilliumdigitatum)、稻痕病菌(Pyricularia grisea)、交格鏈抱菌(Alternaria alternate)、毛根霉(Rhizopuses)和灰霉(Botrytiscinerea)感染的用途。此外，一種源于藥用植物苦豆子的凝集素SAL，其國(guó)際基因庫(kù)登錄號(hào)是DQ011517. I的重組苦豆子凝集素His-SAL在用于制備治療人宮頸癌和食管癌及治療HIV病毒所致疾病的藥物中的用途。重組苦豆子凝集素的制備方法和應(yīng)用，包括以下步驟(I)苦豆子總RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄合成cDNA :將苦豆子葉片放在液氮中研磨，使用Trizol試劑提取總RNA ;用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度法檢測(cè)其總RNA質(zhì)量，A260/280約2. O為純度較好；以總RNA為模板，Oligo dT為引物，使用反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV (RNase H-)，合成 cDNA ；(2)利用PCR擴(kuò)增苦豆子凝集素基因根據(jù)登錄在國(guó)際基因庫(kù)上的苦豆子凝集素基因的cDNA序列[DQ011517. I]，利用DNAMAN軟件設(shè)計(jì)并合成一對(duì)引物，以步驟⑴合成的cDNA為模板，經(jīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增獲得苦豆子凝集素基因的開(kāi)放閱讀框是843bp，回收PCR產(chǎn)物并純化后，克隆到pCR2. I載體上，對(duì)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌落PCR檢測(cè)，酶切鑒定重組質(zhì)粒插入片段的大小正確后，進(jìn)行測(cè)序分析，鑒定獲得了正確的苦豆子凝集素基因；·(3)構(gòu)建重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET30a_SAL及相應(yīng)的重組基因工程菌設(shè)計(jì)特異性引物用于擴(kuò)增苦豆子凝集素成熟蛋白部分基因，將回收的成熟蛋白部分PCR產(chǎn)物SAL基因與pET30a表達(dá)載體分別進(jìn)行雙酶切，對(duì)雙酶切的SAL和pET30a進(jìn)行過(guò)夜連接，獲得原核重組表達(dá)質(zhì)粒pET30a-SAL ;轉(zhuǎn)化到大腸桿菌E. coli BL21(DE3)中獲得基因工程菌，簡(jiǎn)稱E.coliBL21/pET30a-SAL ；(4)重組質(zhì)粒pET30a_SAL的高效表達(dá)及重組苦豆子凝集素的獲得以LB為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，將基因工程菌E. coli BL21/pET-30a-SAL經(jīng)過(guò)IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得可溶性的重組表達(dá)蛋白，其中培養(yǎng)溫度是28°C，IPTG的濃度為O. 3mmol/L ;離心收集菌體，采用超聲波破碎法裂解細(xì)胞，離心獲得上清可溶性蛋白，通過(guò)Ni Sepharose6Fast Flow純化柱進(jìn)行純化,獲得重組苦豆子凝集素，經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè)證明得到了可溶性、高效表達(dá)的重組苦豆子凝集素(His-SAL)融合蛋白；(5)重組苦豆子凝集素的功能活性和應(yīng)用上述步驟(4)得到的純化的重組苦豆子凝集素His-SAL具有止血、抗真菌、抑制腫瘤活性及抑制HIV-I反轉(zhuǎn)錄酶活性，在制備抗農(nóng)業(yè)病原真菌的生物制劑及在腫瘤和抗病毒的蛋白藥物治療方面具有良好的應(yīng)用前景。本發(fā)明提供了上述純化工藝得到的一種重組苦豆子凝集素His-SAL的凝血活性和基本的理化特性。具體為，該重組蛋白對(duì)兔血、鼠血、人類ABO血型均有凝集作用，在PH6-10范圍內(nèi)和溫度為30-80°C范圍內(nèi)，其對(duì)兔血的凝集活性穩(wěn)定。D-半乳糖是與該蛋白特異性結(jié)合的糖。該重組蛋白是一種Mn2+依賴性蛋白。本發(fā)明得到的一種重組苦豆子凝集素His-SAL具有明顯的抑菌活性，對(duì)能引起水果腐爛和糧食霉變的6種病原真菌意大利青霉菌(Penicillium italicum)、指狀青霉菌(Penicilliumdigitatum)、稻痕病菌(Pyricularia grisea)、交格鏈抱菌(Alternariaalternate)、毛根霉(Rhizopuses)和灰霉(Botrytis cinerea)均具有生長(zhǎng)抑制效果，且隨樣品濃度升高其抑菌效果增強(qiáng)。其對(duì)毛根霉、灰霉和交格鏈孢菌抑制效果強(qiáng)，其IC5tl值分別為O. 297mg/ml,O. 367mg/ml和O. 635mg/ml,所述重組苦豆子凝集素可以用于制備在農(nóng)業(yè)上抗真菌感染的生物制劑。本發(fā)明所得到的重組苦豆子凝集素His-SAL還具有明顯的抗癌活性，在體外對(duì)兩種常見(jiàn)的腫瘤細(xì)胞均具有高抑制作用。使用MTT法測(cè)定重組苦豆子凝集素蛋白對(duì)常見(jiàn)癌細(xì)胞如人宮頸癌細(xì)胞HeLa和食管癌細(xì)胞Eca-109具有顯著的抑制生長(zhǎng)作用，當(dāng)His-SAL作用Ecal09及HeLa細(xì)胞72h時(shí)，His-SAL濃度越高對(duì)細(xì)胞的抑制作用也越強(qiáng)，對(duì)Ecal09及HeLa的IC50值分別為20. 62 μ g/ml和22. 18 μ g/ml。對(duì)正常Vero細(xì)胞抑制作用較小。本發(fā)明所述的重組苦豆子凝集素His-SAL具有抑制HIV-I反轉(zhuǎn)錄酶活性的作用，用HIV-IRT試劑盒(Roche公司)檢測(cè)不同濃度的His-SAL對(duì)HIV-I反轉(zhuǎn)錄酶的抑制作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其半數(shù)抑制濃度IC5tl值為O. 24mg/ml。結(jié)果表明His-SAL對(duì)HIV-I反轉(zhuǎn)錄酶的活性表現(xiàn)出強(qiáng)的抑制作用。這些實(shí)驗(yàn)表明重組苦豆子凝集素在制備止血?jiǎng)?、抗病原真菌感染的生物制劑及?腫瘤疾病和HIV病毒所致疾病的藥物治療方面具有良好的應(yīng)用前景。關(guān)于重組苦豆子凝集素的制備、活性和應(yīng)用等未見(jiàn)報(bào)道。本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)提供了重組苦豆子凝集素在大腸桿菌中高效表達(dá)的方法，具體步驟如下(I)苦豆子總RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄合成cDNAO. Ig苦豆子葉片在液氮中研磨,用Iml Trizol試劑對(duì)其進(jìn)行裂解,用槍吹打或劇烈振蕩以裂解組織；將上述組織的Trizol裂解液轉(zhuǎn)入EP管中，在室溫15 30°C下放置5分鐘；在上述EP管中，按照每Iml Trizol加O. 2ml氯仿的量加入氯仿，蓋上EP管蓋子，用力震蕩15S，在室溫下(15°C 30°C )放置2 3分鐘后，12000g(2°C 8°C )離心15分鐘；取上層水相置于新EP管中，按照每Iml Trizol加O. 5ml異丙醇的量加入異丙醇，在室溫下(15°C 30°C)放置10min，12000g(2°C 8°C)離心10分鐘;棄上清，按照每Iml Trizol加lml75%乙醇進(jìn)行洗滌，渦旋混合，7500g(2°C 8°C )離心5min，棄上清；讓沉淀的RNA在室溫下自然干燥；用Rnase-free water溶解RNA沉淀。用I %瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度法檢測(cè)其總RNA質(zhì)量，A260/280約2. O為純度較好；以總RNA為模板，按照TransScriptFirst-StrandcDNA Synthesis SuperMix試劑盒(全式金公司)操作方法進(jìn)行第一鏈cDNA的合成；⑵PCR擴(kuò)增苦豆子凝集素基因的序列根據(jù)登錄在國(guó)際基因庫(kù)的苦豆子凝集素基因的cDNA序列[DQ011517. 1]，利用DNAMAN軟件設(shè)計(jì)并合成一對(duì)引物，以步驟(I)合成的cDNA為模板，經(jīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增出約 800bp 的 DNA 片段；所述一對(duì)引物為PI : 5 ' -ATGGCCATATTCCAGAAACAC-3 '，P2 5 ' -TCACACAACACTTGCCATATA-3 ' ；PCR 體系為lyL 苦豆子葉 cDNA, I μ LlOpM 引物 Pl，lyL IOpM 引物 P2，2yL dNTPs Mixture (IOmM), 2 μ L IOXTaq Buffer，?！?5μ LTaqDNAPolymerase (5U/ μ L)以及 12. 5 μ L Sterilized dH20,總反應(yīng)體系為 20 μ L ;聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)采用熱啟動(dòng)，具體條件是94°C 5min ；94°C lmin, 55°C Imin, 72°C lmin,循環(huán)數(shù)35 -JTC IOmin ;PCR片段純化后，克隆到pCR2. I載體上，陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子用Pl和P2引物進(jìn)行菌落PCR檢測(cè)，酶切鑒定重組質(zhì)粒PCR2. I-SAL插入片段的大小正確，表明苦豆子凝集素基因陽(yáng)性克隆重組子已獲得。將含有完整外源片段的陽(yáng)性克隆菌株送北京華大基因中心測(cè)序，進(jìn)行測(cè)序分析，鑒定獲得了正確的苦豆子凝集素基因序列；
(3)構(gòu)建重組質(zhì)粒pET30a_SAL及相應(yīng)的重組基因工程菌設(shè)計(jì)特異性引物用于擴(kuò)增苦豆子凝集素成熟蛋白部分基因(SAL)，為了方便載體的連接，在pET30a表達(dá)載體上設(shè)計(jì)了帶Nco I和Xho I酶切位點(diǎn)的引物P3 :5' -CATGCCATGGCAGACTCACTCTCCTTCACCT-3'(劃線部分為酶切位點(diǎn))，P4 :5' -CCGCTCGAGCACAACACTTGCCATATACAT-3'(劃線部分為酶切位點(diǎn))。PCR反應(yīng)體系為1 μ gPCR2. 1-SAL質(zhì)粒，I μ L IOpM引物 P3，lyL IOpM 引物 P4，2yL dNTPs Mixture (2. 5mM), 2 μ L IOXTaq Buffer,0. 5μ LTaq DNA Polymerase (5U/μ L)以及 12.5yL Sterilized dH20，總反應(yīng)體系為 20 μ L ;輕輕混勻后按以下條件進(jìn)行PCR反應(yīng)，具體條件是94°C 5min;94°C lmin, 58°C lmin, 72°Clmin，循環(huán)數(shù)35 ;72°C，7min ;PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用I %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。取100 μ L PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳后，將目的DNA片段切出。純化步驟參考上海生工公司DNA回收試劑盒說(shuō)明書(shū)；將PCR產(chǎn)物和載體進(jìn)行Nco I和Xho II雙酶切，采用TIANGEN生物公司的PCR產(chǎn)物回收試劑盒，對(duì)雙酶切的pET30a和SAL進(jìn)行回收，然后進(jìn)行連接反應(yīng)；在一微量離心管中
依次加入下列試劑
無(wú)菌水6 μΙ
IOx連接緩沖液6 μ
pET30a 載體(53ng/pL)7 μ
PCR 產(chǎn)物40 pL
T4 DNA連接酶I μ ^
Total Volume60 μ 充分混勻上述連接成分，短暫離心后，16°C水浴過(guò)夜。參考分子克隆實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)(第三版)，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5 α中，將過(guò)夜長(zhǎng)出的陽(yáng)性克隆挑取到6mL的LB培養(yǎng)基(含卡那霉素)中培養(yǎng)12-16h。菌液PCR方法鑒定重組質(zhì)粒正確。按照堿裂解法小量提取質(zhì)粒，用雙酶切進(jìn)行鑒定，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。得到的工程菌為E. coliBL21/pET30a-SALo(4)重組質(zhì)粒pET30a_SAL的高效表達(dá)及重組苦豆子凝集素的獲得將鑒定正確的含有苦豆子凝集素基因的重組質(zhì)粒的培養(yǎng)物分別按I : 100轉(zhuǎn)接到含卡那霉素(100 μ g/mL)的LB液體培養(yǎng)基中，菌液培養(yǎng)至0D_ = O. 5時(shí)，加入IPTG至終濃度為O. 3mmol/L，在28°C誘導(dǎo)培養(yǎng)4h。用SDS-PAGE電泳檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖3，M為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1為未誘導(dǎo)含有重組質(zhì)粒的BL21轉(zhuǎn)化菌全蛋白；2為O. 2mM IPTG，28°C誘導(dǎo)的含有重組質(zhì)粒的BL21轉(zhuǎn)化菌全蛋白；3為O. 3mM IPTG, 28°C誘導(dǎo)的含有重組質(zhì)粒的BL21轉(zhuǎn)化菌全蛋白；4為O. 4mM IPTG，28°C誘導(dǎo)的含有重組質(zhì)粒的BL21轉(zhuǎn)化菌全蛋白；5為O. 5mM IPTG,28°C誘導(dǎo)的含有重組質(zhì)粒的BL21轉(zhuǎn)化菌全蛋白；6為O. 2mM IPTG，37°C誘導(dǎo)的含有重組質(zhì)粒的BL21轉(zhuǎn)化菌全蛋白。表明重組苦豆子凝集素已高效表達(dá)，且大部分是可溶的。親和層析誘導(dǎo)表達(dá)后，4°C，8000g離心5min，收集菌體；每管加入20ml PBS，洗滌菌體3次，加入15. 8ml裂解液，超聲破碎20min，超聲波超聲破菌條件是400W，每5sec間隔5sec共50次。4°C, 12000rpm離心IOmin,收集上清，上清經(jīng)O. 45 μ m的微孔濾膜過(guò)濾后，在4°C通過(guò)裝有預(yù)處理的Ni Sepharose6Fast Flow(GE公司)介質(zhì)中，使其自然通過(guò)層析柱。用結(jié)合buffer (含20mM咪唑，O. 5M NaCl，20mM磷酸鹽)洗柱6遍以上，去除雜蛋白。用洗脫bufferl (含250mM咪唑，O. 5M NaCl，20mM磷酸鹽)過(guò)柱，收集目的蛋白。洗脫buffer2(含500mM咪唑，O. 5M NaCl，20mM磷酸鹽)用于清洗層析柱。透析除去咪唑，純化蛋白用Bradford比色法對(duì)蛋白進(jìn)行定量。純化產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖4，M為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1為O. 3mMIPTG誘導(dǎo)前含有重組質(zhì)粒的BL21轉(zhuǎn)化菌全蛋白，2為O. 3mMIPTG誘導(dǎo)后含有重組質(zhì)粒的BL21轉(zhuǎn)化菌全蛋白，3為250mM咪唑第一次洗脫后的蛋白，4為250mM咪唑第二次洗脫后的蛋白。蛋白產(chǎn)物經(jīng)鑒定正確后，真空冷凍干燥后于_20°C保存?zhèn)溆?。本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)(I)本發(fā)明首次將苦豆子凝集素成熟蛋白基因(SAL)成功構(gòu)建到表達(dá)載體pET30a 上并于原核表達(dá)系統(tǒng)大腸桿菌BL21中獲得表達(dá)。(2)本發(fā)明利用表達(dá)載體自身的特點(diǎn)，采用超聲波破碎法和親和層析相結(jié)合的方法，獲得純度為97%以上，有活性的重組苦豆子凝集素，經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè)，達(dá)到電泳純，大大簡(jiǎn)化了一般重組苦豆子凝集素分離純化的繁瑣步驟。(3)本發(fā)明重組苦豆子凝集素對(duì)幾種常見(jiàn)的致病真菌有明顯的抑制作用，同時(shí)還具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖和抑制HIV-I反轉(zhuǎn)錄酶的作用，不僅擴(kuò)大了苦豆子的應(yīng)用范圍，而且為苦豆子應(yīng)用于有害真菌的防治，腫瘤以及病毒性疾病的治療提供了技術(shù)支持。


圖I是pET30a_SAL重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建示意圖；圖2是pET30a_SAL重組表達(dá)質(zhì)粒的雙酶切鑒定圖，圖中，M為DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量DL5000 ;1為Nco I與Xho I雙酶切鑒定；圖3是SDS-PAGE電泳顯示重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)，圖中，M為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1為未誘導(dǎo)含有重組質(zhì)粒的BL21轉(zhuǎn)化菌全蛋白；2為O. 2mM IPTG，28°C誘導(dǎo)的含有重組質(zhì)粒的BL21轉(zhuǎn)化菌全蛋白；3為O. 3mM IPTG，28°C誘導(dǎo)的含有重組質(zhì)粒的BL21轉(zhuǎn)化菌全蛋白；4為O. 4mM IPTG，28°C誘導(dǎo)的含有重組質(zhì)粒的BL21轉(zhuǎn)化菌全蛋白；5為O. 5mM IPTG，28°C誘導(dǎo)的含有重組質(zhì)粒的BL21轉(zhuǎn)化菌全蛋白；6為O. 2mM IPTG，37°C誘導(dǎo)的含有重組質(zhì)粒的BL21轉(zhuǎn)化菌全蛋白；圖4是SDS-PAGE電泳顯示重組蛋白的純化，圖中，M為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1為O. 3mMIPTG誘導(dǎo)前含有重組質(zhì)粒的BL21轉(zhuǎn)化菌全蛋白，2為O. 3m MIPTG誘導(dǎo)后含有重組質(zhì)粒的BL21轉(zhuǎn)化菌全蛋白，3為250mM咪唑第一次洗脫后的蛋白，4為250mM咪唑第二次洗脫后的蛋白。圖5是重組苦豆子凝集素體外抑菌活性檢測(cè)圖，圖中，a毛根霉(Rhizopuses)；b 灰霉(Botrytis cinerea) ;c 稻痕病菌(Pyricularia grisea) ;d 意大利青霉菌(Penicillium italicum) ;e 指狀青霉菌(Penicillium digitatum) ;f 交格鏈抱菌(Alternaria alternate)。重組蛋白 His-SAL 樣品溶于 O. 02M PBS 緩沖液(pH7. 4)中，用牛津杯法進(jìn)行抑菌活性的測(cè)定，以滅菌的PBS作為對(duì)照。置28V的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h。在圖中(I)為含 O. 36mg/mlHis-SAL 的 O. 02M PBS buffer (pH7. 4) ； (2)為含 O. 27mg/ml His-SAL 的 O. 02M PBS buffer (pH7. 4) ； (3)為含 0. 18mg/ml His-SAL 的 O. 02M PBSbuffer (pH7. 4) ； (4)為含 0. 09mg/ml His-SAL 的 0. 02M PBS buffer (pH7. 4) ； (c)為 0. 02MPBS buffer (pH7. 4)即陰性對(duì)照。結(jié)果表明該重組蛋白對(duì)6種真菌均有生長(zhǎng)抑制作用；圖6是重組蛋白His-SAL對(duì)癌細(xì)胞增殖抑制的MTT檢測(cè)圖。取不同濃度的His-SAL (2. 5，12. 5, 25, 50,62. 5 μ g/mL)分別檢測(cè)其對(duì)HeLa (人宮頸癌細(xì)胞)和ECa-109 (人食管癌細(xì)胞)的增殖抑制作用。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明His-SAL對(duì)HeLa和ECa-109細(xì)胞均有抑制生長(zhǎng)作用，其作用72h的IC5tl值為20. 62 μ g/ml和22. 18 μ g/ml 0但其對(duì)正常的VeiO細(xì)胞抑制作用較弱。
具體實(shí)施例方式下面采用具體實(shí)施例的方式解釋本發(fā)明，但本發(fā)明不局限于實(shí)施例。實(shí)施例I :苦豆子凝集素基因的克隆 I.材料植物材料苦豆子種子(采于烏魯木齊紅雁池水庫(kù))。將種子放入帶有濕紗布的平皿中，待長(zhǎng)出葉片后備用。菌株大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5 α (購(gòu)自 invitrogen 公司)。質(zhì)粒載體pCR2. I載體購(gòu)自Invitrogen。主要試劑Trizol、DNA Marker>Taq DNA聚合酶購(gòu)自天根生化科技、T4DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶購(gòu)TaKaRa，DNA片段回收試劑盒購(gòu)自上海生工。培養(yǎng)基LB液體培養(yǎng)基蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，NaC15g/L, NaOH O. 334g/L，調(diào)pH至7. 0，高壓滅菌。LB固體培養(yǎng)基在液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加2. 4g/L瓊脂粉，高壓滅菌。I. 2 方法1.2. I引物設(shè)計(jì)根據(jù)登錄在國(guó)際基因庫(kù)的苦豆子凝集素基因的cDNA序列(DQ011517. 1)，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增苦豆子凝集素基因，引物序列如下Pl 5/ -ATGGCCATATTCCAGAAACAC-3'P2 5/ -TCACACAACACTTGCCATATA-3'I. 2. 2苦豆子總RNA的提取及質(zhì)量檢測(cè)(采用Trizol法提取)O. Ig苦豆子葉片在液氮中研磨,用Iml Trizol試劑對(duì)其進(jìn)行裂解,用槍吹打或劇烈振蕩以裂解組織；將上述組織的Trizol裂解液轉(zhuǎn)入EP管中，在室溫15 30°C下放置5分鐘；在上述EP管中，按照每Iml Trizol加O. 2ml氯仿的量加入氯仿，蓋上EP管蓋子，用力震蕩15S，在室溫下(15°C 30°C )放置2 3分鐘后，12000g(2°C 8°C )離心15分鐘；取上層水相置于新EP管中，按照每Iml Trizol加O. 5ml異丙醇的量加入異丙醇，在室溫下(15°C 30°C )放置 lOmin，12000g(2°C 8°C )離心 10 分鐘；棄上清，按照每 Iml Trizol加lml75%乙醇進(jìn)行洗滌，渦旋混合，7500g(2°C 8°C )離心5min，棄上清；讓沉淀的RNA在室溫下自然干燥；用Rnase-free water溶解RNA沉淀?？喽棺涌俁NA的質(zhì)量檢測(cè)將提取的總RNA在I %的瓊脂糖凝膠中電泳，18S和28SrRNA在真核生物中占總RNA的90%以上，因此呈特征條帶。18S和28S rRNA特征譜帶清晰，無(wú)拖尾，亮度比接近I : 2，說(shuō)明RNA是完整的，沒(méi)有被降解。再用紫外分光光度法檢測(cè)，分別在波長(zhǎng)260nm和280nm處測(cè)RNA樣品OD值，OD260/OD280約2. O較好，進(jìn)而確定是否需要重新提取RNA。I. 2. 3RNA 的反轉(zhuǎn)錄取高質(zhì)量的RNA,按照全式金公司 TransScript First-Strand cDNA SynthesisSuperMix操作方法進(jìn)行第一鏈cDNA的合成。在EP管中配制下列模板RNA/引物混合液50ng_5 μ g總 RNA, I μ I Anchored Oligo (dT) 18 (O. 5 μ g/μ I)引物，10 μ I 2X TS ReactionMix反應(yīng)混合液，1μ I TransScriptRT/RI Enzyme Mix反轉(zhuǎn)錄酶混合液,加無(wú)Rnase的水至總體積為20μ 1，42°C保溫lh，70°C保溫IOmin后，迅速在冰上急冷2min以上，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。1.2.4PCR 擴(kuò)增
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR體系為1 μ L苦豆子葉cDNA，I μ L IOpM引物Ρ1，
Iμ L IOpM 弓 I 物 P2，2yL dNTPs Mixture (IOmM) , 2 μ LlO X Taq Buffer，O. 5 μ L TaqDNAPolymerase (5U/μ L)以及 12.5yL Sterilized dH20，總反應(yīng)體系為 20 μ L ;聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)采用熱啟動(dòng)，具體條件是94°C 5min ；94°C lmin，55°C lmin，72°C lmin，循環(huán)數(shù)35 ;72°C IOmin ;PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用I %瓊脂糖凝膠電泳后，用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒(生工生物工程上海有限公司，實(shí)驗(yàn)步驟按照該公司的柱式DNA回收試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行)進(jìn)行純化。I. 2. 5大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞的制備大腸桿菌感受態(tài)的制備，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞參考分子克隆實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)(第三版)。I. 2. 6PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與pCR2. I載體的連接與轉(zhuǎn)化鏈接反應(yīng)體系為
無(wú)菌水5 μι
IOx連接緩沖液I μ ^
pCR2.1 載體(25 ng/pL)2 μ
新鮮的PCR產(chǎn)物_Ij^L_
Γ Τ4 DNA 連接酶I μι
Total Volume10 μL充分混勻上述連接成分，短暫離心后，16°C水浴過(guò)夜。I. 2. 7轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞將10 μ L連接片段與200 μ L感受態(tài)細(xì)胞混合，放置于冰上30min ;42°C水浴放置90s ;放置冰上5-10min ;加入800 μ L LB液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)Ih ;取200 μ L涂LB平板(含氨芐青霉素)；37°C培養(yǎng)12h，獲得轉(zhuǎn)化子。I. 2. 8酶切鑒定陽(yáng)性克隆和測(cè)序分析取形態(tài)規(guī)則的單菌落用Pl和P2引物進(jìn)行菌落PCR檢測(cè)，酶切鑒定重組質(zhì)粒插入片段的大小是否正確。確認(rèn)含目的基因插入片段后，將含有完整外源片段的陽(yáng)性克隆菌株送北京華大基因有限公司測(cè)序。
將測(cè)序的結(jié)果通過(guò)多種生物信息學(xué)的方法對(duì)其進(jìn)行多方面的分析，如信號(hào)肽、跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)、修飾位點(diǎn)、二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)等等，結(jié)果表明，苦豆子凝集素基因cDNA開(kāi)放式閱讀框長(zhǎng)843bp，編碼280個(gè)氨基酸的前體蛋白。前29個(gè)氨基酸為信號(hào)肽序列。7_29個(gè)氨基酸為其跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)苦豆子凝集素的分子量為31181Da，其等電點(diǎn)為6. 25?？喽棺幽嘏c豆科其它凝集素的同源性較高。二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)它與其它一些豆科凝集素的結(jié)構(gòu)非常相似。實(shí)施例2 :苦豆子凝集素基因的重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及原核表達(dá)和純化I 材料大腸桿菌BL21,pET-30a購(gòu)自Invitrogen公司。DNA膠回收試劑盒購(gòu)自生工生物工程上海有限公司，T4DNA連接酶及各種限制性內(nèi)切酶均為TaKaRa公司產(chǎn)品?？敲顾兀逼S青霉素，Ni Sepharose6Fast Flow(GE公司)。其它化學(xué)試劑為國(guó)產(chǎn)分析純產(chǎn)品。2.苦豆子凝集素基因表達(dá)載體的構(gòu)建·2. I引物設(shè)計(jì)(下劃線為酶切位點(diǎn)，上游酶切位點(diǎn)為Nco I，下游酶切位點(diǎn)Xho I)P3. 5' ~CATGCCATGGCAGACTCACTCTCCTTCACCT~3/ P4 5/ -CCGCTCGAGCACAACACTTGCCATATACAT-3'2. 2苦豆子凝集素基因的擴(kuò)增反應(yīng)體系為20 μ L(陰性對(duì)照中模板用Sterilized dH20代替)
pCR2.1-SAL 質(zhì)粒(25 ng^L) I μLI OxEx Taq Buffer2 μ
Sterilized (IH2O12.5 pL
Ex Taq (5 U/pL)0.5 μL
P3 primer (10 μΜ)I μ ^
P4 primer (10 μΜ)I μ
dNTP Mixture2 μΙ>
Total Volume20 pL輕輕混勻后按以下條件進(jìn)行PCR反應(yīng)
變性反應(yīng)94 °C5min
PCR 反應(yīng)35 cycles
94 °CI min
58 °CI min
72 °CI min
后反應(yīng)72 °C7 minPCR擴(kuò)增產(chǎn)物用I %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。
2.3PCR產(chǎn)物的回收取100 μ L PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳后，將目的DNA片段切出。純化步驟參考上海生工公司DNA回收試劑盒說(shuō)明書(shū)。2. 4PCR產(chǎn)物和載體酶切反應(yīng)體系為30yL(目的基因載體=4 1)37°C過(guò)夜酶切。2. 5PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與載體的連接與轉(zhuǎn)化連接反應(yīng)體系為 無(wú)菌水6 pL
IOx連接緩沖液6 μL
pET30a 載體(53ng^L)7 μ
新鮮的PCR產(chǎn)物40 μ ^
Τ4 DNA連接酶I μ
Total Volume60 μ 充分混勻上述連接成分，短暫離心后，16°C水浴過(guò)夜。2. 6大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化參考分子克隆實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)(第三版)的方法進(jìn)行大腸桿菌感受態(tài)的制備和連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞。2. 7酶切鑒定陽(yáng)性克隆和測(cè)序按照堿裂解法小量提取質(zhì)粒，用雙酶切進(jìn)行鑒定。在250 μ L離心管中依次加入
3μ LlOXH Buffer，各 O. 5μ L Nco I 與 Xho I，15 μ L Plasmid，I μ L 無(wú)菌水；總體積為20 μ L0置37°C反應(yīng)3-6h，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。篩選獲得的含有SAL融合蛋白基因的重組質(zhì)粒，稱pET30a-SAL，見(jiàn)附圖I和圖2。將該重組質(zhì)粒委托由北京華大基因有限公司進(jìn)行核酸測(cè)序分析，進(jìn)一步驗(yàn)證SAL融合蛋白基因及其讀碼框的正確性。3重組苦豆子凝集素(His-SAL)的誘導(dǎo)表達(dá)和純化3. I融合蛋白的表達(dá)條件的優(yōu)化將鑒定正確的含有重組質(zhì)粒的培養(yǎng)物分別按I : 100轉(zhuǎn)接到含卡那霉素(100 μ g/mL)的LB液體培養(yǎng)基中，菌液培養(yǎng)至0D_ = O. 6-0. 8。在不同的IPTG濃度與溫度條件下，誘導(dǎo)表達(dá)兩種蛋白，IPTG濃度分別是O. 2mM、0. 3mM、0. 4mM、0. 5mM，誘導(dǎo)溫度分別是28°C和37°C，將收集的菌液于4°C 12000r/min離心收集菌體，重懸于適量的2 X SDS加樣緩沖液中，沸水浴lOmin，取30 μ L于12%的SDS-PAGE上進(jìn)行電泳檢測(cè)不同IPTG濃度與溫度對(duì)融合蛋白His-SAL表達(dá)的影響，確定最佳誘導(dǎo)溫度和IPTG濃度。通過(guò)分析比較，目的蛋白表達(dá)的最優(yōu)條件溫度280C，初始菌OD600 = 0 . 5, IPTG終濃度O. 3mmol/L,時(shí)間4h。結(jié)果見(jiàn)圖3。3. 2重組苦豆子凝集素(His-SAL)的分離純化誘導(dǎo)表達(dá)后，4°C，8000g離心lOmin，收集菌體；用預(yù)冷的PBS重懸菌體，8000g離心lOmin，收集菌體(不可_70°C保存)；用適量的PBS再次重懸菌體，冰浴30min，超聲破碎20-40min, 12000g 離心 20min,收集上清。上清加到 GE 公司 Ni Sepharose6Fast Flow 純化柱中，經(jīng)過(guò)除雜、洗脫獲得純度為97%以上的重組苦豆子凝集素，透析除去咪唑，Bradford法測(cè)濃度后，過(guò)濾除菌。將純化的重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳鑒定正確，見(jiàn)圖4，冷凍干燥后于-20°C保存?zhèn)溆谩ＳH和層析的條件如下結(jié)合buffer :20mM 咪唑，O. 5M NaCl，20mM 磷酸鹽；洗脫bufferl :250mM 咪唑，O. 5M NaCl，20mM 磷酸鹽；洗脫buffer2 :500mM 咪唑，O. 5M NaCl，20mM 磷酸鹽。實(shí)施例3 :本發(fā)明重組苦豆子凝集素His-SAL的凝血活性和理化性質(zhì)I.凝血活性取健康兔紅血球、鼠紅血球、人類AB04種血型血球，用TBS-Ca2+離心洗滌三次
后，制成2%紅血球懸液。稱取重組苦豆子凝集素凍干品用生理鹽水配成lmg/mL，按照PariyaphonPetnual[8]等的方法，在V型96孔微量血清稀釋板上進(jìn)行重組蛋白樣品的系列倍比稀釋，之后每孔加入2%兔紅血球懸液25 μ L，微量振蕩器上振搖lmin，25°C放置2h，檢查血細(xì)胞凝集情況。結(jié)果如表I，其對(duì)兔血細(xì)胞，鼠血細(xì)胞，人類ABO血型都有凝集作用，其中，對(duì)兔血細(xì)胞凝集作用最強(qiáng)，最低凝集濃度為O. 0056mg/ml。表IHis-SAL對(duì)人和動(dòng)物血細(xì)胞的凝集作用
權(quán)利要求
1.一種源于藥用植物苦豆子的凝集素，其國(guó)際基因庫(kù)登錄號(hào)是DQ011517. I的重組苦豆子凝集素在制備用于抗菌、抗病毒感染和抗腫瘤藥物中的用途。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種重組苦豆子凝集素，其特征在于，對(duì)兔血、鼠血、人類ABO血型均有凝集作用，在PH6-10范圍內(nèi)和溫度為30-80°C范圍內(nèi)，其對(duì)兔血的凝集活性穩(wěn)定，D-半乳糖是與該蛋白特異性結(jié)合的糖。該重組蛋白是一種Mn2+依賴性蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求1-2項(xiàng)所述的重組苦豆子凝集素的獲得方法和應(yīng)用，包括如下步驟 (1)苦豆子總RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄合成cDNA:將苦豆子葉片放在液氮中研磨，使用Trizol試劑提取總RNA ;用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度法檢測(cè)其總RNA質(zhì)量，A260/280約2.0為純度較好；以總RNA為模板，Oligo dT為引物，使用反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV (RNase H-)，合成 cDNA ； (2)利用PCR擴(kuò)增苦豆子凝集素基因根據(jù)登錄在國(guó)際基因庫(kù)上的苦豆子凝集素基因的cDNA序列[DQ011517. I]，利用DNAMAN軟件設(shè)計(jì)并合成一對(duì)引物，以步驟(I)合成的cDNA為模板，經(jīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增獲得苦豆子凝集素基因的開(kāi)放閱讀框是843bp，回收PCR產(chǎn)物并純化后，克隆到pCR2. I載體上，對(duì)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌落PCR檢測(cè)，酶切鑒定重組質(zhì)粒插入片段的大小正確后，進(jìn)行測(cè)序分析，鑒定獲得了正確的苦豆子凝集素基因； (3)構(gòu)建重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET30a-SAL及相應(yīng)的重組基因工程菌設(shè)計(jì)特異性引物用于擴(kuò)增苦豆子凝集素成熟蛋白部分基因，將回收的成熟蛋白部分PCR產(chǎn)物SAL基因與pET30a表達(dá)載體分別進(jìn)行雙酶切，對(duì)雙酶切的SAL和pET30a進(jìn)行過(guò)夜連接，獲得原核重組表達(dá)質(zhì)粒pET30a-SAL ;轉(zhuǎn)化到大腸桿菌E. coli BL21(DE3)中獲得基因工程菌，簡(jiǎn)稱E.coliBL21/pET30a-SAL ； (4)重組質(zhì)粒pET30a-SAL的高效表達(dá)及重組苦豆子凝集素的獲得以LB為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，將基因工程菌E. coli BL21/pET-30a-SAL經(jīng)過(guò)IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得可溶性的重組表達(dá)蛋白，其中培養(yǎng)溫度是28°C，IPTG的濃度為O. 3mmol/L ;離心收集菌體，采用超聲波破碎法裂解細(xì)胞，離心獲得上清可溶性蛋白，通過(guò)Ni Sepharose6Fast Flow純化柱進(jìn)行純化,獲得重組苦豆子凝集素，經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè)證明得到了可溶性、高效表達(dá)的重組苦豆子凝集素(His-SAL)融合蛋白； (5)重組苦豆子凝集素的功能活性和應(yīng)用 上述步驟(4)得到的純化的重組苦豆子凝集素His-SAL具有凝血、抗真菌、抑制腫瘤活性及抑制HIV-I反轉(zhuǎn)錄酶活性，在制備抗農(nóng)業(yè)病原真菌的生物制劑及在腫瘤和抗病毒的蛋白藥物治療方面具有良好的應(yīng)用前景。
4.權(quán)利要求I 2項(xiàng)所述的重組苦豆子凝集素，其特征是所述重組蛋白具有血液凝集活性，在制備新型止血藥物中的用途。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的用途，其特征是所述重組蛋白對(duì)兔血細(xì)胞，鼠血細(xì)胞，人類ABO血型都有凝集作用。
6.權(quán)利要求1-2項(xiàng)所述的重組苦豆子凝集素，其特征是所述重組蛋白具有抑菌作用，在制備治療病原微生物感染的抗菌藥物中的用途。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的用途，其特征是所述真菌是意大利青霉菌(Penicilliumitalicum)、指狀青霉菌(Penicillium digitatum)、稻痕病菌(Pyriculariagrisea)、交格鏈抱菌(Alternaria alternate)、毛根霉(Rhizopuses)和灰霉(Botrytiscinerea)等6種病原真菌。
8.權(quán)利要求I 2項(xiàng)所述的重組苦豆子凝集素，其特征是所述重組蛋白具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用，在制備治療腫瘤藥物中的用途。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的用途，其特征是所述的腫瘤為宮頸癌和食管癌。
10.權(quán)利要求I 2項(xiàng)所述的重組苦豆子凝集素，其特征是所述重組蛋白能夠有效的抑制HIV-I反轉(zhuǎn)錄酶活性，在制備抗HIV病毒制劑中的用途。
全文摘要
本發(fā)明提供一種源于苦豆子(Sophora lopecuraides)的凝集素(國(guó)際基因庫(kù)登錄號(hào)是DQ011517.1)的重組蛋白His-SAL。該蛋白質(zhì)對(duì)兔血、鼠血、人類ABO血型均有凝集作用，在pH6-10范圍內(nèi)和溫度為30-80℃范圍內(nèi)，其對(duì)兔血的凝集活性穩(wěn)定。D-半乳糖是與該蛋白特異性結(jié)合的糖。該重組蛋白是一種Mn2+依賴性蛋白。該蛋白質(zhì)對(duì)真菌的生長(zhǎng)具有很強(qiáng)的抑制作用，在抗農(nóng)業(yè)真菌方面具有廣泛的用途。該蛋白質(zhì)可用于預(yù)防和治療人宮頸癌和食管癌等腫瘤。該蛋白質(zhì)具有抑制HIV-1反轉(zhuǎn)錄酶活性的作用，可用于制備抗HIV病毒的藥物。重組苦豆子凝集素的制備方法包括有苦豆子總RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄合成cDNA、凝集素基因的獲取、構(gòu)建重組質(zhì)粒以及相應(yīng)的重組工程菌、重組質(zhì)粒的高效表達(dá)及得到重組苦豆子凝集素。
文檔編號(hào)A61P31/10GK102872448SQ201210389020
公開(kāi)日2013年1月16日 申請(qǐng)日期2012年10月15日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月15日
發(fā)明者孫素榮, 張富春, 李婷婷, 李陽(yáng), 劉東亮 申請(qǐng)人:新疆大學(xué)