專利名稱：一種血清降解性載體的脂質(zhì)藥物及其使用方法
一種血清降解性載體的脂質(zhì)藥物及其使用方法技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于制藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種血清降解性載體的脂質(zhì)藥物及其使用方法。
技術(shù)背景
在真核細(xì)胞與哺乳動(dòng)物細(xì)胞的質(zhì)膜中，卵磷脂(磷脂酰膽堿，PO是分布最多的脂類物質(zhì)。大豆卵磷脂(SPC)和蛋黃卵磷脂(EPC)為最常見的PC產(chǎn)品，在m - I -位點(diǎn)和 sn-2 -位點(diǎn)的取代基分別為飽和?；筒伙柡椭舅崽兼?不飽和度等于2)。在PC分子中，脂肪酸的碳鏈不分支、且不飽和鍵屬于順式構(gòu)型，對(duì)流動(dòng)性影響很大。磷脂在細(xì)胞質(zhì)膜中以不對(duì)稱分布，外微區(qū)主要由PC組成。
活性磷脂酶C和D選擇性地合成PC，用來執(zhí)行凋亡細(xì)胞的清除以及趨化免疫細(xì)胞的吞噬功能。先導(dǎo)類PC用來合成鞘磷脂(SM)、溶血卵磷脂(LPC)和鞘氨醇- I-磷酸 (SlP)0凋亡細(xì)胞激活了非鈣依賴型磷脂酶A2 (iPLA2)并釋放LPC，隨后“趨化”結(jié)合單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的G-蛋白-耦合受體(G2A)。特異性識(shí)別與結(jié)合“開啟” 了免疫細(xì)胞吞噬凋亡細(xì)胞的功能；THP - I和U937細(xì)胞在凋亡時(shí)增加鞘氨醇激酶_ I (SphKl)表達(dá)、分泌 S1P，并對(duì)吞噬細(xì)胞發(fā)出“找到我”的趨化信號(hào)； Ρ-型ATPase酶、應(yīng)急酶或(ABC)-轉(zhuǎn)運(yùn)酶的作用下，癌變或感染細(xì)胞的血小板迅速將磷脂酰絲氨酸(PS，由PC合成)從質(zhì)膜內(nèi)側(cè)轉(zhuǎn)運(yùn)到外側(cè)，再與樹突細(xì)胞(DCs)、增生單核細(xì)胞、成熟巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞以及活性B細(xì)胞等的表面PS進(jìn)行溶解，協(xié)同“自殺”因子消除病變細(xì)胞；另外縮醛磷脂的二酰基具有重要的細(xì)胞信號(hào)介導(dǎo)功能。
在凋亡細(xì)胞清除后，免疫細(xì)胞的調(diào)節(jié)功能恢復(fù)至正常水平。與病原菌的清除或 FcR-調(diào)節(jié)噬菌相比，凋亡細(xì)胞清除的過程具有非炎癥性。在吞噬過程中，巨噬細(xì)胞分泌抗炎免疫因子IL- 10，同時(shí)降低TNF- a，IL - 1β和IL - 12的表達(dá)水平；巨噬細(xì)胞在胞外分泌TGF- β，它是一種重要的抗炎免疫因子；然而，只有PS暴露的陰離子脂質(zhì)體才能誘導(dǎo) TGF - β I的胞外表達(dá)，PC是一種重要的細(xì)胞免疫響應(yīng)阻抑劑。
PC不穩(wěn)定易被氧化，氧化過程多數(shù)情況下與入侵細(xì)菌、支原體、病毒導(dǎo)致的細(xì)胞癌變、感染、慢性免疫缺陷等病變有關(guān)。氧化特異性抗原(OSE)誘導(dǎo)鐸受體、C-反應(yīng)蛋白、補(bǔ)充因子H和原性IgM抗體。免疫細(xì)胞的原性模式識(shí)別受體以一種內(nèi)源性損傷模式鑒別氧化廢棄物。PC氧化后，極性頭暴露了隱秘表位的識(shí)別、結(jié)合受體，并在細(xì)胞表面形成“自主”因子和低密度脂蛋白。
PC是莢膜多糖(LPS)的有效組分，能夠誘導(dǎo)細(xì)菌的特定共生、細(xì)菌-宿主的結(jié)合以及細(xì)菌毒素的釋放；陰離子PC激活病原體的表面酰胺酶，介導(dǎo)細(xì)菌的繁殖、分化、凋亡、 黏附以及遷移。細(xì)菌在復(fù)制、凋亡以及溶解過程中，內(nèi)源因子導(dǎo)致胞壁瓦解，LPS釋放毒性類脂Α。這樣，宿主出現(xiàn)感染、癌變和凋亡響應(yīng)，同時(shí)免疫細(xì)胞伴隨炎癥反應(yīng)。
凝血酶誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞(IL - 8)表達(dá)，“趨化因子”激活磷脂水解酶(PLA2),PLA2分為 SPLA2, CPLA2和iPLA2亞型。PC水解產(chǎn)生相應(yīng)的烷酸類炎性介質(zhì)，參與磷脂重建、細(xì)胞信號(hào)傳遞、宿主反應(yīng)和促進(jìn)血液凝固等多種作用。
同樣，PC介導(dǎo)病原菌與宿主細(xì)胞“發(fā)現(xiàn)”藥物分子、“開啟”細(xì)菌及其病變細(xì)胞的抑制、殺死過程；單核免疫細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的“趨化因子”及時(shí)吞噬并清除細(xì)菌和細(xì)胞凋亡體。在PC的介導(dǎo)下，極性頭的表位結(jié)合模式識(shí)別受體實(shí)現(xiàn)藥物的定式排列和靶向傳遞?；赑C的“信號(hào)傳遞”功能和細(xì)胞可代謝特性，制藥工業(yè)已經(jīng)成功開發(fā)了 25種以上的脂質(zhì)商品藥物(FDA認(rèn)證)，均為化學(xué)治療試劑。通過靜脈注射、肌注、口服和腹腔注射途徑用藥的脂質(zhì)藥物數(shù)量分別為12、2、8和I ;只有I種脂質(zhì)體(前列腺素)以動(dòng)脈注射方式用藥。PC以其無細(xì)胞毒性、生物可降解性和阻抑免疫特性等優(yōu)勢(shì)用于包裹藥物的載體。脂質(zhì)體改善了藥物的代謝動(dòng)力學(xué)，預(yù)防藥物早期降解和靶向細(xì)胞失活；此外，脂質(zhì)載體的乳化、分散功能提高了細(xì)胞對(duì)藥物的可利用度。然而用于包裹極性藥物時(shí)，PC的隱秘表位抗原喪失識(shí)別能力，從而抑制了免疫細(xì)胞對(duì)于凋亡細(xì)胞的“吞噬”清除功能；由于PC的構(gòu)型易變，介質(zhì)條件對(duì)包裹藥物的代謝動(dòng)力學(xué)和藥效的影響大，藥物穩(wěn)定性不高；pc的機(jī)械強(qiáng)度不理想，用于生物藥物的包裹時(shí)對(duì)其高級(jí)構(gòu)型的擾動(dòng)明顯。本發(fā)明研發(fā)了一種新的以體外注射方式使用的脂質(zhì)商品藥物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種血清降解性載體的脂質(zhì)藥物，本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供該藥物的使用方法。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的
一種血清降解性載體的脂質(zhì)藥物，包括脂質(zhì)體和血清，其中所述的脂質(zhì)體由卵磷脂鋯納米顆粒包裹藥物形成，脂質(zhì)體和血清的用量比為184-191 μ g 1. 5mL。進(jìn)一步地，所述的卵磷脂鋯納米顆粒為大豆磷脂鋯Zr(SPC)2或蛋黃磷脂鋯Zr (EPC) 2。所述的卵磷脂鋯納米顆粒和血清的用量比為160 μ g :1. 5mL。所述的藥物為核糖體抑制蛋白苦瓜蛋白MAP30或首烏蛋白GAP31。上述的血清降解性載體的脂質(zhì)藥物的使用方法是載體或脂質(zhì)體藥物體外注射到血清中。為了驗(yàn)證藥物的降解情況，在雞血清中磷脂水解酶的催化下，分別對(duì)載體進(jìn)行降解和測(cè)定，然后在體外實(shí)驗(yàn)條件下，分別測(cè)定了脂質(zhì)藥物在血清中的釋放和傳遞作用。·載體的降解
血漿采自一月齡的雛雞；在無菌的2 ml離心管中，高速離心新鮮的血漿；分離沉降的血細(xì)胞，收集上清液、得到透明的血清樣品，在4°C下短期儲(chǔ)藏、備用；21*(5 02和Zr(EPC)2固體顆粒經(jīng)冷凍干燥后低溫儲(chǔ)藏；載體定量加入到血清中，在3000 rpm/min條件下攪拌分散固體顆粒，置于37°C恒溫振蕩器內(nèi)進(jìn)行降解；定時(shí)取樣，高速離心(16000 rpm/min) 20分鐘、測(cè)定上清液中磷的含量，根據(jù)測(cè)定結(jié)果計(jì)算載體的降解效率；采用磷鑰藍(lán)分光光度(入=700 nm)以標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定磷的含量。脂質(zhì)蛋白的緩釋
Zr (SPC)2和Zr (EPC)2載體分別包裹MAP30和GAP31的脂質(zhì)體經(jīng)低溫冷凍干燥后儲(chǔ)藏備用，預(yù)先測(cè)定脂質(zhì)體中的蛋白質(zhì)含量；在四個(gè)血清樣品的離心管中，分別定量加入脂質(zhì)蛋白藥物，高速分散至懸浮半透明溶液；在37 °〇恒溫振蕩器內(nèi)振蕩緩釋；在預(yù)定的時(shí)間間隔內(nèi)取樣，高速離心(16000 rpm/min) 20分鐘、測(cè)定上清液中的蛋白含量,計(jì)算緩釋率；蛋白含量通過考馬斯藍(lán)染色的分光光度法測(cè)定(λ =595 nm)。免疫細(xì)胞的共聚焦顯微觀察
小膠質(zhì)細(xì)胞(⑶11)分離自新生小鼠的視網(wǎng)膜組織；取適量用含10 % (體積分?jǐn)?shù))雞血清的培養(yǎng)液混懸，調(diào)整細(xì)胞密度至2X IO5 / ml ;將IOml細(xì)胞懸液接種到多聚賴氨酸包被的T75細(xì)胞培養(yǎng)瓶中(培養(yǎng)液DMEM/F12)，在CO2 (體積分?jǐn)?shù)5 %)的孵箱中、37°C下培養(yǎng)24 11;用0.01 M磷酸鹽緩沖溶液洗滌細(xì)胞，將細(xì)胞種植在六孔的無菌板(孔中放置一塊多聚賴氨酸處理的蓋玻片)中，種植密度為4X105 /孔；含10 %血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)24h ;用(LysoTracker Red DND - 99)標(biāo)記溶酶體 I h,分別用 Hoechst 33342 和抗-HLA - DR 單抗體脫色細(xì)胞核和細(xì)胞膜，磷酸緩沖溶液洗滌；分別加入定量的載體和脂質(zhì)體，培養(yǎng)2 h ；洗滌后以2 %(體積分?jǐn)?shù))多聚甲醛溶液室溫固定30 min ;用特異性山羊二抗(Alexa Fluor 546)標(biāo)記的抗-鼠單抗分別對(duì)⑶11、⑶11 -載體和⑶11-脂質(zhì)藥物進(jìn)行免疫熒光染色，共聚焦顯微鏡下觀察小膠質(zhì)細(xì)胞的形貌。本發(fā)明降解產(chǎn)物不會(huì)對(duì)血細(xì)胞造成如酸度、鹽度、氧化代謝物等壓力，可提高藥物對(duì)受體細(xì)胞定向傳遞和靶向識(shí)別的效率，具有機(jī)械強(qiáng)度高、藥物的構(gòu)型穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，可廣泛用于開發(fā)血細(xì)胞免疫響應(yīng)低、無殘留的緩釋藥物，制備關(guān)于核糖體抑制蛋白可控緩釋和高效傳遞的新劑型。


圖I為蛋黃磷脂鋯納米載體在新鮮雞血清介質(zhì)中的降解結(jié)果；
圖2為大豆磷脂鋯納米載體在新鮮雞血清介質(zhì)中的降解結(jié)果； 圖3為蛋黃磷脂鋯-MAP30復(fù)合脂質(zhì)體在新鮮雞血清介質(zhì)中的緩釋結(jié)果；
圖4為蛋黃磷脂鋯-GAP31復(fù)合脂質(zhì)體在新鮮雞血清介質(zhì)中的緩釋結(jié)果；
圖5為大豆磷脂鋯-MAP30復(fù)合脂質(zhì)體在新鮮雞血清介質(zhì)中的緩釋結(jié)果；
圖6為大豆磷脂鋯-GAP31復(fù)合脂質(zhì)體在新鮮雞血清介質(zhì)中的緩釋結(jié)果；
圖7為小膠質(zhì)免疫細(xì)胞對(duì)蛋黃磷脂鋯、蛋黃磷脂鋯-MAP30吸收的共聚焦熒光顯微觀察結(jié)果。
具體實(shí)施例方式以下通過具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明。實(shí)施例I
Zr(EPC)2納米載體在血清中降解
準(zhǔn)確稱量160 μ g干燥載體,加入I. 5 ml新鮮血清,在4 °C條件下以3000 rpm/min攪拌20 min，制得半透明懸浮分散液，然后置于37°C恒溫振蕩器內(nèi)振蕩降解；分別于3、5、7、
9、10、11、11. 5、12、12. 5、13 h用微量移液器吸取100 μ I降解液，在16000 rpm/min高速離心20 min ;移取70 μ I上清液于I ml比色管中，用蒸餾水稀釋至400 μ I后依次加入200μ I抗壞血酸(100 g/l)、400 μ I鑰酸銨顯色液(13 g鑰酸銨+0.35 g酒石酸銻鉀+150 mlH2SO4于500 ml);顯色15 min后，在700 nm下測(cè)定吸光度，以血清樣品作為參比。
載體的降解率(％)=(上清液的磷質(zhì)量+載體的總磷質(zhì)量)XlOO %。如圖I所示，載體在血清介質(zhì)中的降解率隨振蕩時(shí)間的增加而提高；降解產(chǎn)物為水溶性磷酸(脂)基團(tuán)，在12 h后載體降解充分，其結(jié)果為93. 26 土 4. 66 % ;統(tǒng)計(jì)的載體降解速率(％/ h)為7. 20 - 8. 08，平均值為7. 74 %/ h，降解反應(yīng)的速率基本是恒定的。
實(shí)施例2
Zr(SPC)2納米載體在血清中降解
160 μ g干燥載體加入到I. 5 ml新鮮血清的離心管中(2 ml)，在4°C條件下以高速攪拌(3000 rpm/min), 20 min后轉(zhuǎn)變?yōu)榘胪该鲬腋》稚⒁?；將離心管置于37°C恒溫振蕩器，振蕩降解載體；分別于3、5、7、9、11、12、13、14、15、15· 5、16 h移取100 μ I降解液，高速離心(16000 rpm/min)20 min ;移取70 μ I上清液到I ml比色管中、稀釋至體積為400 μ I,依次加入200 μ I抗壞血酸(100 g/l)、400 μ I鑰酸銨顯色液(13 g鑰酸銨+0. 35 g酒石酸銻鉀+150 ml H2SO4于500 ml)，顯色15 min ;在700 nm下以血清樣品為參比測(cè)定吸光度，計(jì)算磷的質(zhì)量和載體的降解率。載體的降解率(％)=(上清液的磷質(zhì)量+載體的總磷質(zhì)量)X 100 %。如圖2所示，載體在血清介質(zhì)的初始濃度在O. 11 mg/ml范圍內(nèi)，載體的降解效率隨著降解時(shí)間的增加而增加；降解產(chǎn)物溶解在血清樣品中，在15. 5 h后載體的降解效率達(dá)到最大，其結(jié)果為95. 87 土 4.79 %;載體的降解速率(％/ h)為5. 05 - 6. 35，平均降解速率為 5. 76 %/ ho實(shí)施例3
一種血清降解性載體的脂質(zhì)藥物，包括脂質(zhì)體和血清，其中脂質(zhì)體由卵磷脂鋯納米顆粒包裹藥物形成，脂質(zhì)體和血清的用量比為187μ g 1. 5mL。卵磷脂鋯納米顆粒為蛋黃磷脂鋯Zr(EPC)2，藥物為核糖體抑制蛋白苦瓜蛋白MAP30。上述的血清降解性載體的脂質(zhì)藥物的使用方法是載體或脂質(zhì)體藥物體外注射到血清中。Zr (EPC) 2 - MAP30脂質(zhì)體的藥物釋放
脂質(zhì)體以下列工藝制備，蛋白載體(質(zhì)量比)0.34:1，pH 8. 52 (10 mM PBS+100 mMNaCl)，反應(yīng)時(shí)間15 h ;脂質(zhì)體經(jīng)離心、洗滌后冷凍干燥，其中MAP30的含量(質(zhì)量比)為24. O±1.0 % ;在187 μ g的脂質(zhì)體中，注射1.5 ml新鮮的體外血清樣品,在3000 rpm/min的速率下攪拌20 min (4°C)，制得半透明懸浮分散液，然后置于37°C恒溫振蕩器內(nèi)振蕩緩釋；分別于3、7、10、12、14、15、16、17、18、19、20h用微量取液器移取100 μ I緩釋液，高速離心(16000 rpm/min)20 min ;移取60 μ I上清液到5 ml比色管中、加入5 ml考馬斯亮藍(lán)染料(100 mg/ι),顯色2 min ;以血清樣品為參比、在波長595 nm下測(cè)定吸光度,計(jì)算蛋白質(zhì)量和緩釋率。蛋白緩釋率(％)=(上清液的蛋白質(zhì)量+脂質(zhì)體的總蛋白質(zhì)量)XlOO %。在載體降解以及血清鹽度和pH誘導(dǎo)下，包裹的蛋白逐漸釋放至血清中；如圖3所示，隨著振蕩時(shí)間的延長，血清的蛋白濃度呈現(xiàn)出增加的變化趨勢(shì)；在振蕩20 h時(shí)，血清中蛋白濃度達(dá)到最大結(jié)果，為28. 11 yg/ml ;此時(shí)蛋白的緩釋率為93. 7 土 4.69 %，在20 h內(nèi)蛋白的緩釋速率范圍為3. 18 - 5. 28 %/ h (平均值4. 53 %/ h)。實(shí)施例4
一種血清降解性載體的脂質(zhì)藥物，包括脂質(zhì)體和血清，其中脂質(zhì)體由卵磷脂鋯納米顆粒包裹藥物形成，脂質(zhì)體和血清的用量比為191 μ g 1. 5mL。卵磷脂鋯納米顆粒為蛋黃磷脂鋯Zr (EPC) 2，藥物為核糖體抑制蛋白首烏蛋白GAP31。Zr(EPC)2- GAP31脂質(zhì)體的蛋白緩釋
脂質(zhì)體的制備條件 ，蛋白載體(質(zhì)量比)O. 29:1，pH 5.0 (10 mM PBS+100 mM NaCl)，反應(yīng)時(shí)間20 h ;脂質(zhì)體經(jīng)離心、洗滌后冷凍干燥(GAP31的含量23.5 土 1.2 %)；191 μ g脂質(zhì)體加入到I. 5 ml新鮮血清,在3000 rpm/min的速率下攪拌20 min(4°C ),得到半透明的懸浮分散液，在37°C恒溫振蕩器內(nèi)振蕩緩釋；于3、6、8、10、12、14、16、17、18、19、20、21、22h用微量取液器分別移取100 μ I緩釋液，高速離心(16000 rpm/min) 20 min ;取60 μ I上清液到5 ml比色管中，加入5 ml考馬斯亮藍(lán)染料(100 mg/1)，顯色2 min;以血清樣品為參比、測(cè)定吸光度(λ =595 nm)，計(jì)算蛋白質(zhì)量和緩釋率。蛋白緩釋率(％)=(上清液的蛋白質(zhì)量+脂質(zhì)體的總蛋白質(zhì)量)XlOO %。在載體降解以及血清介質(zhì)(鹽度和pH)誘導(dǎo)下，脂質(zhì)包裹蛋白逐漸釋放至血清中；如圖4所示，隨著振蕩時(shí)間的延長，血清的蛋白濃度呈現(xiàn)出增加的變化趨勢(shì)；在振蕩21 h時(shí)，血清中蛋白濃度增加到最大的結(jié)果，為28.67 μg/ml;此時(shí)蛋白的緩釋率為95.6 土4. 78 %，在21 h內(nèi)蛋白的緩釋速率范圍為3. 27 - 4. 83 %/ h (平均值4. 17 %/ h)。實(shí)施例5
一種血清降解性載體的脂質(zhì)藥物，包括脂質(zhì)體和血清，其中脂質(zhì)體由卵磷脂鋯納米顆粒包裹藥物形成，脂質(zhì)體和血清的用量比為184μ g 1. 5mL。卵磷脂鋯納米顆粒為大豆磷脂鋯Zr (SPC)2，藥物為核糖體抑制蛋白苦瓜蛋白MAP30。Zr(SPC)2- MAP30脂質(zhì)體的蛋白緩釋
脂質(zhì)體以下列方法制備，蛋白載體(質(zhì)量比)0.34:1，pH 9. 02 (10 mM PBS+100 mMNaCl),反應(yīng)時(shí)間15 h ;脂質(zhì)體經(jīng)離心、洗漆后冷凍干燥,其中包裹MAP30的含量(質(zhì)量比)24.4 ±1.2 %;準(zhǔn)確稱量184 μ g干燥的脂質(zhì)體，加入I. 5 ml新鮮血清，攪拌20 min(3000rpm/min，4°C)得到半透明懸浮液，然后置于37°C恒溫振蕩器內(nèi)振蕩緩釋；分別于3、6、8、
10、12、14、16、17、18、19、20、21、22 h用微量取液器移取100 μ I緩釋液，高速離心(16000rpm/min) 20 min ;移取60 μ I上清液到5 ml比色管中，加入5 ml考馬斯亮藍(lán)染料(100mg/1),顯色2 min ;在595 nm下以血清樣品為參比測(cè)定吸光度,計(jì)算蛋白質(zhì)量和緩釋率。蛋白緩釋率(％)=(上清液的蛋白質(zhì)量+脂質(zhì)體的總蛋白質(zhì)量)XlOO %。在載體降解以及血清介質(zhì)(鹽度和pH)誘導(dǎo)下，脂質(zhì)包裹蛋白逐漸釋放至血清中；如圖5所示，隨著振蕩時(shí)間的延長，血清的蛋白濃度呈現(xiàn)出增加的變化趨勢(shì)；在振蕩21 h時(shí)，血清中蛋白濃度達(dá)到最大值，為28. 67 48/1111;此時(shí)蛋白的緩釋率為95.55 土 4.78%，在20 h內(nèi)蛋白的緩釋速率范圍為3. 28 - 4. 82 %/ h (平均值4. 16 %/ h)。實(shí)施例6
一種血清降解性載體的脂質(zhì)藥物，包括脂質(zhì)體和血清，其中脂質(zhì)體由卵磷脂鋯納米顆粒包裹藥物形成，脂質(zhì)體和血清的用量比為189μ g 1. 5mL。卵磷脂鋯納米顆粒為大豆磷脂鋯Zr (SPC) 2，藥物為核糖體抑制蛋白首烏蛋白GAP31。Zr(SPC)2- GAP31脂質(zhì)體的蛋白緩釋
脂質(zhì)體以下列工藝制備，蛋白載體(質(zhì)量比)0.29:1，pH 5. 89 (10 mM PBS+100 mMNaCl),反應(yīng)時(shí)間15 h ;脂質(zhì)體經(jīng)離心、洗漆后冷凍干燥,其中包裹MAP30的含量(質(zhì)量比)23. 8 ± I. 2% ;準(zhǔn)確稱量189 μ g干燥的脂質(zhì)體,加入I. 5 ml新鮮血清,在3000 rpm/min的速率下攪拌20 min (4°C)，制得半透明懸浮分散液，然后置于37°C恒溫振蕩器內(nèi)振蕩緩釋;分別于2、4、6、7、9、12、14、15、17、19、20、21、22h用微量取液器移取100 μ I緩釋液，高速離心(16000 rpm/min)20 min ;移取60 μ I上清液到5 ml比色管中，加入5 ml考馬斯亮藍(lán)染料(100 mg/1),顯色2 min;在595 nm下以血清樣品為參比測(cè)定吸光度,計(jì)算蛋白質(zhì)量和緩釋率。蛋白緩釋率(％)=(上清液的蛋白質(zhì)量+脂質(zhì)體的總蛋白質(zhì)量)X 100%。在載體降解以及血清介質(zhì)(鹽度和pH)誘導(dǎo)下，脂質(zhì)包裹蛋白逐漸釋放至血清中；如圖6所示，隨著振蕩時(shí)間的延長，血清的蛋白濃度呈現(xiàn)出增加的變化趨勢(shì)；在振蕩21 h時(shí)，血清中蛋白濃度增加到最大結(jié)果，為28. 53 yg/ml ;此時(shí)蛋白的緩釋率為95. 7 土 4.76%，在21 h內(nèi)蛋白的緩釋速率范圍為3. 44 - 5. 92 %/ h (平均值4. 41 %/ h)。實(shí)施例7
⑶11細(xì)胞的共聚焦顯微觀察
取適量小膠質(zhì)細(xì)胞CDll用含10 % (體積分?jǐn)?shù))雞血清的培養(yǎng)液混懸，調(diào)整細(xì)胞密度至2 X IO5 / ml ;將IOml細(xì)胞懸液接種到多聚賴氨酸包被的T75細(xì)胞培養(yǎng)瓶中(培養(yǎng)液DMEM/F12)，在5 % CO2的孵箱中、37°C下培養(yǎng)24 11;用0.01 M磷酸鹽緩沖溶液洗滌細(xì)胞，將細(xì)胞種植在六孔的無菌板(孔中放置一塊多聚賴氨酸處理的蓋玻片)中，種植密度為4X105 /孔；含10 %血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)24h ;用(LysoTracker Red DND - 99，50 nM)標(biāo)記溶酶體I h，分別用0.1 μΜ Hoechst 33342和O. I μ M抗_ HLA - DR單抗體脫色細(xì)胞核和細(xì)胞膜，O. 01M磷酸緩沖溶液洗滌3次；分別加入100 yg Zr (EPC) 2和100 μ g Zr (EPC) 2 - MAP30,培養(yǎng)2 h ;洗滌后以2 % (體積分?jǐn)?shù))多聚甲醛溶液室溫固定30 min ;用特異性山羊二抗(AlexaFluor 546)標(biāo)記的抗-鼠單抗分別對(duì) CDl I、CDl I - Zr (EPC) 2 和 CDl I - (Zr (EPC) 2 -MAP30)進(jìn)行免疫熒光染色，共聚焦顯微鏡下觀察小膠質(zhì)細(xì)胞的形貌。如圖7所示,用特異性山羊二抗(Alexa Fluor 546)標(biāo)記的抗-鼠單抗標(biāo)記的CDll細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色，共聚焦顯微觀察結(jié)果顯示小膠質(zhì)細(xì)胞純化后貼壁24 h,細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則；Zr (EPC)2載體及Zr (EPC)2-MAP30脂質(zhì)體陽性信號(hào)均顯示在細(xì)胞膜表面，二者包含共定位部分；細(xì)胞呈現(xiàn)靜息的狀態(tài)，載體、脂質(zhì)體在短期內(nèi)傳遞到CDll表面，細(xì)胞形貌在載體、脂質(zhì)體黏結(jié)前后沒有顯著的變化。圖中各個(gè)圈示區(qū)域分別對(duì)應(yīng)Alexa Fluor 546抗體(圖A)、Zr (EPC) 2 (圖B)與Zr (EPC) 2-MAP30 (圖C)的分布，I-亮場影像、2-熒光影像與亮場影像的疊加。在血清中磷脂水解酶作用12和15. 5 h時(shí)，實(shí)施例1、2中的載體降解效率分別達(dá)93.26 %和95.87 %，降解產(chǎn)物不會(huì)對(duì)血細(xì)胞造成如酸度、鹽度、氧化代謝物等壓力；與非磷脂類脂質(zhì)材料相比，發(fā)明中的載體賦予凋亡細(xì)胞“找到我”和免疫細(xì)胞“吞噬我”的信號(hào)傳遞功能，提高藥物對(duì)受體細(xì)胞定向傳遞和靶向識(shí)別的效率；與磷脂載體相比，與Zr (IV)雜化的納米材料具有機(jī)械強(qiáng)度高、包裹蛋白的構(gòu)型穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)蛋白藥物的包裹效率和穩(wěn)定性等指標(biāo)均有明顯的提聞。在血清的介質(zhì)中，實(shí)施例3— 6中4種脂質(zhì)體對(duì)包裹核糖體失活蛋白(MAP30和GAP31)進(jìn)行了充分的緩釋，藥物緩釋率在93. 7 % - 95. 7 %;藥物的緩釋時(shí)間持續(xù)20 h - 21h，藥物緩釋量為I. 37 - I. 40 Ug / h -ml (血清);因此，脂質(zhì)藥物在恒定緩釋、持續(xù)時(shí)間以及緩釋量等藥效指標(biāo)均具有顯著的優(yōu)勢(shì)。
PC作為配體，賦予了載體材料對(duì)于細(xì)胞免疫響應(yīng)的阻抑特性；載體及其脂質(zhì)體定向傳遞到CDll的免疫細(xì)胞后，對(duì)細(xì)胞的形貌不具有明顯的擾動(dòng)；在實(shí)施例7中，觀察到完整的細(xì)胞膜和細(xì)胞核結(jié)構(gòu)?！?br> 權(quán)利要求
1.一種血清降解性載體的脂質(zhì)藥物，其特征是包括脂質(zhì)體和血清，其中所述的脂質(zhì)體由卵磷脂錯(cuò)納米顆粒包裹藥物形成，脂質(zhì)體和血清的用量比為184-191 μ g 1. 5mL。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種血清降解性載體的脂質(zhì)藥物，其特征是所述的卵磷脂鋯納米顆粒為大豆磷脂鋯Zr (SPC) 2或蛋黃磷脂鋯Zr (EPC) 2。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種血清降解性載體的脂質(zhì)藥物，其特征是所述的卵磷脂鋯納米顆粒和血清的用量比為160 μ g 1. 5mL。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種血清降解性載體的脂質(zhì)藥物，其特征是所述的藥物為核糖體抑制蛋白。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種血清降解性載體的脂質(zhì)藥物，其特征是所述的核糖體抑制蛋白為苦瓜蛋白MAP30或首烏蛋白GAP31。
6.權(quán)利要求I或2、或3、或4、或5所述的一種血清降解性載體的脂質(zhì)藥物的使用方法是載體或脂質(zhì)體藥物體外注射到血清中。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種血清降解性載體的脂質(zhì)藥物及其使用方法，屬于制藥技術(shù)領(lǐng)域。一種血清降解性載體的脂質(zhì)藥物，其特征是包括脂質(zhì)體和血清，其中所述的脂質(zhì)體由卵磷脂鋯納米顆粒包裹藥物形成，脂質(zhì)體和血清的用量比為184-191μg∶1.5mL，使用方法是載體或脂質(zhì)體藥物體外注射到血清中。本發(fā)明降解產(chǎn)物不會(huì)對(duì)血細(xì)胞造成如酸度、鹽度、氧化代謝物等壓力，可提高藥物對(duì)受體細(xì)胞定向傳遞和靶向識(shí)別的效率，具有機(jī)械強(qiáng)度高、包裹藥物的構(gòu)型穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，可廣泛用于開發(fā)血細(xì)胞免疫響應(yīng)低、無殘留的緩釋藥物，制備關(guān)于核糖體抑制蛋白可控緩釋和高效傳遞的新劑型。
文檔編號(hào)A61K47/46GK102908629SQ20121039176
公開日2013年2月6日 申請(qǐng)日期2012年10月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月16日
發(fā)明者薛金輝, 喬元彪, 霍宇平, 郭彩珍, 翟言強(qiáng), 衛(wèi)英慧, 李彥威 申請(qǐng)人:呂梁學(xué)院