專(zhuān)利名稱(chēng)：乳糖化肝細(xì)胞靶向病毒載體的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于病毒蛋白技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種乳糖化肝細(xì)胞靶向病毒載體的制備方法。
背景技術(shù)：
肝癌是很常見(jiàn)的腫瘤之一，在全球發(fā)病率日益上升，嚴(yán)重危害人類(lèi)的生命健康。目前治療肝癌的方法主要是化療、手術(shù)、介入等手段，但效果都不夠理想。隨著基因科學(xué)和技術(shù)的日益發(fā)展，基因治療肝癌成為了可能?；蛑委煹年P(guān)鍵問(wèn)題是攜帶基因的載體問(wèn)題，目前該領(lǐng)域技術(shù)發(fā)展迅速，常用的肝癌基因治療載體主要有病毒載體、脂質(zhì)體、質(zhì)粒、陽(yáng)離子聚合物等。其中，病毒載體效率高，但特異性差，應(yīng)用一直不理想。乳糖酸(lactobionic acid，LA)是寡聚醛糖酸，其上的糖可以識(shí)別在肝細(xì)胞表 面高表達(dá)的脫唾液酸糖蛋白受體(asialoglycoproteins receptor, ASGPR),因?yàn)锳SGPR能與末端為半乳糖基的蛋白質(zhì)或多肽發(fā)生特異性結(jié)合。研究顯示，每個(gè)肝細(xì)胞可以表達(dá)IXlO5 5X105個(gè)ASGPR。ASGPR含有兩個(gè)亞基，Hl和H2，兩個(gè)亞基的比例是5:1，ASGPR和配體結(jié)合的是Hl亞基。一旦和配體結(jié)合后，它能使配體連接的納米顆粒以籠狀蛋白介導(dǎo)的方式進(jìn)入肝細(xì)胞；而且，這樣的入胞方式可以把外源物質(zhì)輸運(yùn)到溶酶體，最后在溶酶體中進(jìn)行降解。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是利用乳糖酸對(duì)肝細(xì)胞的特異性識(shí)別作用，提出一種乳糖化肝細(xì)胞靶向病毒載體的制備方法，為肝癌的靶向藥物治療提供新途徑。本發(fā)明的目的將通過(guò)以下技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)
一種乳糖化肝細(xì)胞靶向病毒載體的制備方法，包括以下步驟
步驟一將輪狀病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP2或者VP6的基因構(gòu)建到蛋白表達(dá)質(zhì)粒pET系列載體上，得到含有輪狀病毒結(jié)構(gòu)蛋白的表達(dá)質(zhì)粒PET-VP2或者pET-VP6 ；
步驟二 將步驟一得到的含有輪狀病毒結(jié)構(gòu)蛋白的表達(dá)質(zhì)粒PET-VP2或者pET-VP6轉(zhuǎn)化大腸桿菌，表達(dá)出包涵體蛋白IB ；
步驟三所述包涵體蛋白IB經(jīng)復(fù)性和重新折疊后，形成有活性的蛋白R(shí)-VP2或者R-VP6 ；
步驟四將步驟三得到的蛋白R(shí)-VP2或者R-VP6與抗癌藥物進(jìn)行交聯(lián)，形成抗癌藥物與蛋白R(shí)-VP2或者R-VP6的共軛物；
步驟五將步驟四得到抗癌藥物與蛋白R(shí)-VP2或者R-VP6的共軛物進(jìn)行自組裝，形成攜帶有抗癌藥物的病毒樣顆粒；
步驟六將靶向配體乳糖酸共價(jià)交聯(lián)到所述攜帶有抗癌藥物的病毒樣顆粒的外表面，得到乳糖化肝細(xì)胞靶向病毒載體。優(yōu)選地，上述的乳糖化肝細(xì)胞靶向病毒載體的制備方法，其中所述步驟五當(dāng)中，先在pH值為4 9的緩沖液中進(jìn)行自組裝，溫度為10°C 40°C，時(shí)間為3h 16h，自組裝完成后在IOOOOrpm 30000rpm轉(zhuǎn)速條件下進(jìn)行離心分離,水洗后得到攜帶有抗癌藥物的
病毒樣顆粒。優(yōu)選地，上述的乳糖化肝細(xì)胞靶向病毒載體的制備方法，其中所述緩沖液為碳酸鈉-碳酸緩沖液，Tris-HCl緩沖液或者PBS緩沖液中的任意一種。優(yōu)選地，上述的乳糖化肝細(xì)胞靶向病毒載體的制備方法，其中所述抗癌藥物為阿霉素、紫杉醇、喜樹(shù)堿或者siRNA中的任意一種。優(yōu)選地，上述的乳糖化肝細(xì)胞靶向病毒載體的制備方法，其中所述步驟六包括先將EDC、NHS和乳糖酸混合反應(yīng)，乳糖酸:EDC:NHS的摩爾比是(1: 1:10) (1:1:5)，反應(yīng)2tT8h后，把β -巰基乙醇加入到反應(yīng)液中淬滅EDC ;然后將攜帶有抗癌藥物的病毒樣顆粒 加入到反應(yīng)液中，繼續(xù)反應(yīng)12tT20h，最終得到乳糖化肝細(xì)胞靶向病毒載體。本發(fā)明的突出效果為本發(fā)明利用乳糖酸對(duì)肝細(xì)胞的特異性識(shí)別作用，構(gòu)建了乳糖化肝細(xì)胞靶向病毒載體，克服了病毒載體特異性差的問(wèn)題，能特異性識(shí)別肝癌細(xì)胞!fepG2，使所攜帶的藥物在肝癌細(xì)胞中能進(jìn)行釋放并產(chǎn)生細(xì)胞毒性，為肝癌的靶向藥物治療提供了新途徑。


圖I是本發(fā)明實(shí)施例的流程示意 圖2是本發(fā)明實(shí)施例的步驟六的反應(yīng)結(jié)構(gòu) 圖3是本發(fā)明實(shí)施例的攜帶有阿霉素的病毒樣顆粒DVLPs的原子力顯微鏡圖片(A)和透射電鏡圖片(B)，標(biāo)尺分別為200nm和50nm ；
圖4是本發(fā)明實(shí)施例的免疫點(diǎn)雜交鑒定 圖5是乳糖酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn) 圖6是本發(fā)明實(shí)施例的DVLPLAs的原子力顯微鏡圖片(A)和透射電鏡圖片(B)，標(biāo)尺分別為 200nm 和 50nm ；
圖7是本發(fā)明實(shí)施例的免疫熒光檢測(cè)DVLPLAs在肝癌細(xì)胞IfepG2中的分布 圖8是本發(fā)明實(shí)施例的不同濃度的乳糖酸封閉乳糖酸受體后的藥物輸運(yùn)系統(tǒng)進(jìn)入肝癌細(xì)胞H印G2的熒光顯微鏡圖片；
圖9是本發(fā)明實(shí)施例的免疫熒光檢測(cè)DVLPLAs在細(xì)胞A549，MCF-7和Hela中的分布
圖10是本發(fā)明實(shí)施例的DVLPLAs和阿霉素對(duì)HepG2細(xì)胞的毒性和濃度的關(guān)系圖。
具體實(shí)施例方式下面以輪狀病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP6為具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案作進(jìn)一步說(shuō)明，實(shí)施例中所述實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法；所述試劑和材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑獲得。同樣的方案也適用于輪狀病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP2，而且，通過(guò)對(duì)各個(gè)步驟相應(yīng)條件的選擇和替換，可以形成多種具體實(shí)例，它們均在本發(fā)明要求保護(hù)的范圍之內(nèi)。本實(shí)施例的一種乳糖化肝細(xì)胞靶向病毒載體的制備方法，如圖I所示，包括以下步驟步驟一將輪狀病毒(Rotavirus，RV)結(jié)構(gòu)蛋白VP6的基因構(gòu)建到載體pET28a上，得到質(zhì)粒 pET-VP6 ；
步驟二 將步驟一得到的質(zhì)粒pET-VP6轉(zhuǎn)化大腸桿菌,表達(dá)出包涵體蛋白(InclusionBody, IB)；
步驟三包涵體蛋白IB經(jīng)復(fù)性和重新折疊后，形成有活性的蛋白R(shí)-VP6 ；
步驟四將蛋白R(shí)-VP6與阿霉素(DOX)進(jìn)行交聯(lián)，交聯(lián)的形式可以是利用蛋白上的氨基、羧基或巰基進(jìn)行化學(xué)鍵交聯(lián)，也可以是利用疏水性相互作用、靜電吸附的物理方法進(jìn)行物理交聯(lián)，形成阿霉素與蛋白R(shí)-VP6的共軛物DVP6 ；
步驟五將DVP6進(jìn)行自組裝，自組裝的方法如下在pH值為4 9的緩沖液中進(jìn)行自組裝，溫度為10°C 40°C，時(shí)間為3h 16h。自組裝完成后在IOOOOrpm 30000rpm轉(zhuǎn)速條件下進(jìn)行離心分離，水洗后得到攜帶有阿霉素的病毒樣顆粒DVLPs，其中緩沖液為碳酸鈉-碳酸緩沖液，Tris-HCl緩沖液或者PBS緩沖液中的任意一種，優(yōu)選PBS緩沖液；
步驟六=DVLPs外表面有四個(gè)賴(lài)氨酸分子可以提供氨基進(jìn)行進(jìn)一步的化學(xué)交聯(lián)(kll8，kl23, kl25 and kl45)，通過(guò)EDC反應(yīng)，將靶向配體乳糖酸共價(jià)交聯(lián)到DVLPs的外表面，得到乳糖化肝細(xì)胞靶向病毒載體DVLPs-LA(DVLPLAs)，其方法如下先將I-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(EDC)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)和乳糖酸(LA)混合反應(yīng)，把乳糖酸上的羧基變成活潑酯，LA:EDC:NHS三者的摩爾比是(1: 1:10) (1: 1:5)，反應(yīng)2h 8h后，把β -巰基乙醇加入到反應(yīng)液中淬滅EDC ;然后將攜DVLPs加入到反應(yīng)液中，繼續(xù)反應(yīng)12h 20h，最終得到乳糖化肝細(xì)胞靶向病毒載體DVLPs-LA (DVLPLAs)。反應(yīng)完成后，用水透析48h，充分透析除去未反應(yīng)完的小分子物質(zhì)，其反應(yīng)過(guò)程如圖2所示。本實(shí)施例的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)和結(jié)果如下
O原子力顯微鏡和透射電鏡對(duì)攜帶有阿霉素的病毒樣顆粒DVLPs的形貌表征如圖3所示，原子力顯微鏡圖片(A)和透射電鏡圖片(B)中觀察到40nm 120nm的DVLPs,結(jié)果顯示，VP6在交聯(lián)了阿霉素后自組裝形成的DVLPs的粒徑比單獨(dú)的VP6自組裝的VLPs稍大，這可能是因?yàn)榘⒚顾亟宦?lián)后引起的。同時(shí)，交聯(lián)后更容易組裝，這是因?yàn)榘⒚顾厮鶐У恼姾稍谝欢ǔ潭壬系窒?VP6上所帶的負(fù)電荷，從而減弱了 VP6之間的靜電相互排斥，所以更容易組裝。2)免疫點(diǎn)雜交鑒定DVLPLAs
為了證明所獲得的產(chǎn)品來(lái)自VP6組裝體，而不是實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的雜質(zhì)，利用免疫點(diǎn)雜交鑒定了 DVLPLAs。如圖4所示，其中的點(diǎn)VP6 (復(fù)性的蛋白)、VLP (空白蛋白自組裝)、DVLP(交聯(lián)了阿霉素的病毒樣顆粒)及DVLPLAs (修飾了 LA的病毒樣顆粒)均能被抗VP6的特異性抗體所識(shí)別，說(shuō)明該納米藥物輸運(yùn)系統(tǒng)由VP6組成。3)苯酚硫酸法定量計(jì)算交聯(lián)到DVLPs上的乳糖酸
苯酚硫酸法的原理是糖在濃硫酸作用下，脫水生成的糠醛或羥甲基糠醛能與苯酚縮合成一種橙紅色化合物，在10 μ g 100 μ g范圍內(nèi)，其顏色深淺與糖的含量成正比，且在490nm波長(zhǎng)下有最大吸收峰，故可用比色法在此波長(zhǎng)下測(cè)定。苯酚硫酸法可用于甲基化的糖、戊糖和多聚糖的測(cè)定，方法簡(jiǎn)單，靈敏度高，實(shí)驗(yàn)時(shí)基本不受蛋白質(zhì)存在的影響，并且產(chǎn)生的顏色能穩(wěn)定160min以上。標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)繪制配制濃度為400 μ g*mL_1的乳糖酸(Lactobionic Acid, LA)溶液，分別取 0，10，20，30，40，50，60，70，80，90 μ L 的乳糖酸溶液于小試管中，各補(bǔ)水到200 μ L，然后加入100 μ L苯酚溶液，振蕩。再加入500 μ L濃硫酸
(具體的加量見(jiàn)表I)，迅速振蕩搖勻，反應(yīng)30min,于490nm下測(cè)定其光密度。以O(shè)號(hào)樣品做
空白，然后以乳糖酸的微克數(shù)為橫坐標(biāo)，以光密度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)如圖5
所示，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，可以得到一個(gè)直線(xiàn)方程，Y=O. 022X+0. 036，利用這個(gè)方程，可以計(jì)算相
應(yīng)的乳糖酸的量。各個(gè)標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)的參數(shù)如表I所示
表I繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的各個(gè)組分的量
編號(hào)|0 |1 |2 |3 |4 |5 |6 |7 |8 |9
LAUL)0~ 10 ~20 30 40 —50 60 70 80 90 水 UL)200 190 ~180 了70 160 — 150 140 130 120 110
苯酚 UU Too 100 —100 Too 100 — 100 100 100 100 100
濃硫酸(μ L) 500 500 — 500 500 500 一 500 500 500 500 500PD|θ· 0000 |θ· 1670 |θ· 3000 |θ· 4152 |θ· 5010 |θ· 5921 |θ· 6445 |θ· 7462 |θ· 9203 | · 1425根據(jù)苯酚硫酸法，測(cè)得VP6和乳糖酸的摩爾比是VP6 LA =1 2。根據(jù)VP6的分子結(jié)構(gòu)，理論上一個(gè)VP6可以交聯(lián)上四個(gè)乳糖酸，但實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明交聯(lián)上2個(gè)，這說(shuō)明在第一步交聯(lián)阿霉素的過(guò)程中，暴露在VP6表面的氨基會(huì)受到一定的影響。但是，在天然的輪狀病毒VP6組裝時(shí)，由780個(gè)蛋白亞基組裝成70nm的VLPs。所以，一旦VLPs的直徑達(dá)到70nm，其上將會(huì)攜帶1560個(gè)乳糖酸分子，這將大大提高該體系的肝細(xì)胞靶向性和進(jìn)入細(xì)胞的能力。4)原子力顯微鏡和透射電鏡對(duì)DVLPLAs的形貌表征
如圖6所示，原子力顯微鏡圖片(A)和透射電鏡圖片(B)中觀察到修飾后的DVLPLAs和DVLPs的粒徑相比沒(méi)發(fā)生太大的變化，為40nm 120nm。AFM和TEM觀察時(shí)的粒徑相比要稍大些，這是由于AFM針尖的加寬效應(yīng)(effects of tip broadening)引起的。5)免疫熒光檢測(cè)DVLPLAs在肝癌細(xì)胞!fepG2中的分布
發(fā)明人對(duì)DVLPLAs在細(xì)胞中的分布進(jìn)行了研究，如圖7所示，HepG2細(xì)胞在加入DVLPLAs共孵育后，進(jìn)行免疫熒光的檢測(cè)。圖7左上為普通顯微鏡的照片，顯示的是細(xì)胞的正常生長(zhǎng)狀態(tài)；圖7右上為熒光顯微鏡下的照片，顯示的是綠色熒光FITC染料抗體特異識(shí)別DVLPLAs在細(xì)胞中的分布；圖7左下為阿霉素在紅色熒光激發(fā)下所發(fā)出的熒光，顯示阿霉素在細(xì)胞中的分布，顯微鏡下，紅色熒光分布在細(xì)胞核里；圖7右下為前面三張圖片的疊加效果圖，可以清楚的看到，DVLPLAs能夠進(jìn)入肝癌細(xì)胞IfepG2，并分布在細(xì)胞質(zhì)中(圖7右上)，所攜帶的阿霉素能從載體上釋放出來(lái)并進(jìn)入細(xì)胞核(圖7左下)。這是因?yàn)樵贚A-ASGRs相互作用所介導(dǎo)的入胞方式中，蛋白類(lèi)納米顆粒往往被運(yùn)送到溶酶體中，最后被其中的蛋白酶進(jìn)行降解，然后釋放出阿霉素。另外，在輪狀病毒感染細(xì)胞的途徑中，存在一條經(jīng)過(guò)溶酶體的途徑，這也促使了該載體進(jìn)入溶酶體，然后阿霉素從載體上釋放出來(lái)。6)受體介導(dǎo)的入胞途徑
通過(guò)受體競(jìng)爭(zhēng)性抑制實(shí)驗(yàn)，來(lái)證明DVLPLAs是經(jīng)過(guò)ASGPRs介導(dǎo)的方式進(jìn)入細(xì)胞的。所用DVLPLAs的濃度為33 μ g -πιΓ1。免疫熒光檢測(cè)結(jié)果說(shuō)明，游離的LA能和H印G2細(xì)胞上的受體結(jié)合，從而抑制DVLPLAs的結(jié)合，這個(gè)過(guò)程具有濃度依賴(lài)性。如圖8所示，當(dāng)LA的濃度為50 μ g · πιΓ1時(shí)，不能把細(xì)胞上的受體(5X IO6個(gè).mr1)完全封閉，當(dāng)濃度達(dá)到150μ g mr1時(shí)，細(xì)胞上的受體幾乎完全被封閉。7) DVLPLAs對(duì)HeG2細(xì)胞的特異靶向性選擇ASGPRs陰性的細(xì)胞A549、MCF-7和Hela作為對(duì)照，研究DVLPLAs對(duì)H印G2細(xì)胞的特異靶向性。所用DVLPLAs的濃度為33μ g mL—1，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖9所示，其中，上排圖片是自然光下的顯微照片，顯示的是上述細(xì)胞的自然生長(zhǎng)狀態(tài)，下排圖片是在綠色激發(fā)光下的免疫熒光照片，結(jié)果表明，這些ASGPRs陰性的細(xì)胞中沒(méi)有檢測(cè)到明顯的熒光，表明該載藥體系進(jìn)入這些細(xì)胞比較困難，說(shuō)明含乳糖酸的納米載體能特異識(shí)別并進(jìn)入ASGPRs陽(yáng)性的細(xì)胞H印G2，不能識(shí)別和進(jìn)入ASGPRs陰性的細(xì)胞。8) DVLPLAs 對(duì)!fepG2 細(xì)胞的毒性
如圖10所示，細(xì)胞毒性試驗(yàn)表明，當(dāng)阿霉素裝載到VLPs上的濃度到達(dá)2. 5μ g -πιΓ1時(shí)，對(duì)細(xì)胞(5X IO6個(gè)沒(méi)有明顯的毒性；當(dāng)濃度到達(dá)7. 5 μ g -πιΓ1時(shí)，細(xì)胞的相對(duì)存活率為60%，當(dāng)濃度到達(dá)10μ g · ι Γ1時(shí)，幾乎能殺死所有的細(xì)胞。在和游離的阿霉素的比較中發(fā)現(xiàn)，濃度相同的情況下，DVLPLAs對(duì)H印G2細(xì)胞的毒性小于游離的阿霉素。原因可能是載體上的阿霉素有一個(gè)緩釋的過(guò)程，只有釋放的阿霉素在細(xì)胞內(nèi)達(dá)到一定的濃度時(shí)才產(chǎn)生毒 性，而游離的阿霉素可以較快的進(jìn)入細(xì)胞，并達(dá)到一定濃度，導(dǎo)致細(xì)胞損傷或死亡。綜上所述，本發(fā)明利用乳糖酸對(duì)肝細(xì)胞的特異性識(shí)別作用，構(gòu)建了乳糖化肝細(xì)胞靶向病毒載體，克服了病毒載體特異性差的問(wèn)題，能特異性識(shí)別肝癌細(xì)胞IfepG2，使所攜帶的藥物在肝癌細(xì)胞中能進(jìn)行釋放并產(chǎn)生細(xì)胞毒性，為肝癌的靶向藥物治療提供了新的途徑。
權(quán)利要求
1.一種乳糖化肝細(xì)胞靶向病毒載體的制備方法，其特征在于包括以下步驟 步驟一將輪狀病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP2或者VP6的基因構(gòu)建到蛋白表達(dá)質(zhì)粒PET系列載體上，得到含有輪狀病毒結(jié)構(gòu)蛋白的表達(dá)質(zhì)粒PET-VP2或者pET-VP6 ； 步驟二 將步驟一得到的含有輪狀病毒結(jié)構(gòu)蛋白的表達(dá)質(zhì)粒PET-VP2或者pET-VP6轉(zhuǎn)化大腸桿菌，表達(dá)出包涵體蛋白IB ； 步驟三所述包涵體蛋白IB經(jīng)復(fù)性和重新折疊后，形成有活性的蛋白R(shí)-VP2或者R-VP6 ； 步驟四將步驟三得到的蛋白R(shí)-VP2或者R-VP6與抗癌藥物進(jìn)行交聯(lián)，形成抗癌藥物與蛋白R(shí)-VP2或者R-VP6的共軛物； 步驟五將步驟四得到抗癌藥物與蛋白R(shí)-VP2或者R-VP6的共軛物進(jìn)行自組裝，形成攜帶有抗癌藥物的病毒樣顆粒； 步驟六將靶向配體乳糖酸共價(jià)交聯(lián)到所述攜帶有抗癌藥物的病毒樣顆粒的外表面，得到乳糖化肝細(xì)胞靶向病毒載體。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的乳糖化肝細(xì)胞靶向病毒載體的制備方法，其特征在于所述步驟五當(dāng)中，先在pH值為4 9的緩沖液中進(jìn)行自組裝，溫度為10°C 40°C，時(shí)間為3h 16h,自組裝完成后在IOOOOrpm 30000rpm轉(zhuǎn)速條件下進(jìn)行離心分離,水洗后得到攜帶有抗癌藥物的病毒樣顆粒。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的乳糖化肝細(xì)胞靶向病毒載體的制備方法，其特征在于所述緩沖液為碳酸鈉-碳酸緩沖液，Tris-HCl緩沖液或者PBS緩沖液中的任意一種。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的乳糖化肝細(xì)胞靶向病毒載體的制備方法，其特征在于所述抗癌藥物為阿霉素、紫杉醇、喜樹(shù)堿或者siRNA中的任意一種。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的乳糖化肝細(xì)胞靶向病毒載體的制備方法，其特征在于所述步驟六包括先將EDC、NHS和乳糖酸混合反應(yīng)，乳糖酸EDC: NHS的摩爾比是(1: 1:10) (1: 1:5)，反應(yīng)2h 8h后，把β -巰基乙醇加入到反應(yīng)液中淬滅EDC ;然后將攜帶有抗癌藥物的病毒樣顆粒加入到反應(yīng)液中，繼續(xù)反應(yīng)12h 20h，最終得到乳糖化肝細(xì)胞靶向病毒載體。
全文摘要
本發(fā)明揭示了一種乳糖化肝細(xì)胞靶向病毒載體的制備方法，包括步驟一將輪狀病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP2或者VP6的基因構(gòu)建到蛋白表達(dá)質(zhì)粒pET系列載體上，得到表達(dá)質(zhì)粒pET-VP2或者pET-VP6；步驟二將pET-VP2或者pET-VP6轉(zhuǎn)化大腸桿菌，表達(dá)出包涵體蛋白IB；步驟三IB經(jīng)復(fù)性和重新折疊后，形成蛋白R(shí)-VP2或者R-VP6；步驟四將R-VP2或者R-VP6與抗癌藥物進(jìn)行交聯(lián)，形成共軛物；步驟五將共軛物進(jìn)行自組裝，形成攜帶有抗癌藥物的病毒樣顆粒；步驟六將靶向配體乳糖酸共價(jià)交聯(lián)到攜帶有抗癌藥物的病毒樣顆粒的外表面，得到乳糖化肝細(xì)胞靶向病毒載體。本發(fā)明能特異性識(shí)別肝癌細(xì)胞HepG2，使所攜帶的藥物在肝癌細(xì)胞中能進(jìn)行釋放并產(chǎn)生細(xì)胞毒性，為肝癌的靶向藥物治療提供了新途徑。
文檔編號(hào)A61P35/00GK102895667SQ20121040103
公開(kāi)日2013年1月30日 申請(qǐng)日期2012年10月22日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月22日
發(fā)明者趙慶歡, 劉紅海, 樂(lè)曉桐, 李詠梅, 顧莉娟 申請(qǐng)人:蘇州百拓生物技術(shù)服務(wù)有限公司